MAGOH在膠質(zhì)瘤組織中的表達及其臨床意義

劉杰，張德龍，毛捷，夏大勇，徐善水

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 蕪湖 241001)

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的40%～60%[1]，近年來穩(wěn)居原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率第一位且有持續(xù)上升趨勢。膠質(zhì)瘤具有高發(fā)病率、高侵襲性、高復(fù)發(fā)率等特點，患者中位生存期僅有12～16個月，目前臨床上對膠質(zhì)瘤的治療主要以手術(shù)切除為主，并輔以放、化療，但整體治療效果并不能令人滿意，因此從病因?qū)W角度研究膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程對于正確認(rèn)識其發(fā)病機制及優(yōu)化膠質(zhì)瘤治療方案十分必要[2-4]。通過數(shù)據(jù)挖掘，我們發(fā)現(xiàn)mago-nashi同源基因(MAGOH)在不同級別膠質(zhì)瘤組織中存在明顯表達差異性，即MAGOH表達量越高，膠質(zhì)瘤組織分級越高。因此，本研究通過測定并分析MAGOH在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況以探索MAGOH有無成為膠質(zhì)瘤標(biāo)志物的潛力，以及它對膠質(zhì)瘤預(yù)后的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)數(shù)據(jù)庫 CGGA數(shù)據(jù)庫是包含有數(shù)百例膠質(zhì)瘤患者齊全生物信息資料的數(shù)據(jù)庫。本研究回顧性分析了來自于CGGA m RNA microarray 數(shù) 據(jù) 庫 (http：//www.cgga.org.cn/Uploads/201709/CGGA_mRNA_microarray_C&M.data.included_301.xlsx)和CGGA m RNA seq FPKM數(shù)據(jù)庫(http：//www.cgga.org.cn/Uploads/201709/CGGA_ALL_m RNAseq_C&M.data.available_325(IDH_updated).xlsx)的301例和325例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床資料與m RNA芯片數(shù)據(jù)。

1.1.2 膠質(zhì)瘤樣本 本研究所采用組織標(biāo)本共58例均來源于自2013年1月—2017年12月在皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的患者，其中正常組織樣本10例，低級別膠質(zhì)瘤14例(WHOⅠ/Ⅱ)，高級別膠質(zhì)瘤34例(WHOⅢ/Ⅳ)，所納入膠質(zhì)瘤標(biāo)本均經(jīng)我院病理科證實。入選標(biāo)準(zhǔn)為病理診斷為神經(jīng)膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅳ級)，40＜年齡(歲)＜90，既往無特殊病史。入選樣本部位：額葉、顳葉、頂后葉、島頁、胼胝體區(qū)。48例患者平均年齡為(58.32±10.47)歲。10例正常組織樣本來源于外傷患者，所有入選患者或患者家屬均簽署知情同意書，同意參與科研項目，本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。樣本采集清理后立即放置于液氮中，RNA通過Trizol法獲得并儲存于-80℃環(huán)境中。采用WHO膠質(zhì)瘤病理分級對樣本進行分組。由于組織樣本大部分來自于額葉、顳葉，而其他區(qū)域樣本量較少，根據(jù)采集區(qū)域?qū)颖具M行分組后統(tǒng)計功效不高，因此，本研究未討論樣本采集區(qū)域與MAGOH表達水平的關(guān)系。

1.1.3 試劑/試劑盒 見表1。

表1 試劑/試劑盒

1.2 方法 本研究使用R語言對CGGA數(shù)據(jù)進行差異表達分析和生存分析。其中差異表達使用limma軟件包進行分析。使用Origin Pro進行統(tǒng)計繪圖。

1.2.1 Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR) 總RNA使用Trizol法從組織或細(xì)胞中提取。取1μg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板。按照K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄成功后使用QuantiNovaTMSYBR○RGreen PCR kit在QuantStudio3儀器上進行熒光定量PCR，實驗具體操作步驟遵循對應(yīng)試劑盒說明書。引物：GAPDH(product length=123)Forward 5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′， Reverse 5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′;MAGOH(product length=74)Forward 5′-TGGAAGTTCAGGCTCGGTTG-3′，Reverse 5′-TTGTGCCCCACGTAGTAACG-3′。

2 結(jié)果

2.1 MAGOH的表達量在IDH1突變組顯著下調(diào)CGGA m RNA測序數(shù)據(jù)中包含IDH1、TP53突變的資料。我們對IDH1突變和MAGOH表達量之間的關(guān)系做了分析。發(fā)現(xiàn)在IDH1突變組的MAGOH表達量顯著下調(diào)(圖1A)，而MAGOH的表達量和TP53突變無明顯關(guān)聯(lián)(圖1B)。

圖1 MAGOH與IDH1突變和TP53突變之間的關(guān)系

2.2 MAGOH與O(6)-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)表達存在顯著正相關(guān) 現(xiàn)有研究表明MGMT基因表達升高可作為接受放化療的間變性星形細(xì)胞瘤患者的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究分析了MAGOH和MGMT蛋白的表達關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MAGOH與MGMT的表達呈現(xiàn)明顯正相關(guān)(見圖2)。

圖2 MAGOH與MGMT相關(guān)性分析

2.3 CGGA數(shù)據(jù)庫中MAGOH表達量與腫瘤分級呈正相關(guān) 在CGGAmRNA seq FPKM數(shù)據(jù)中，MAGOH表達量呈現(xiàn)顯著差異，并且與膠質(zhì)瘤分級顯著正相關(guān)(圖3A)。在CGGAmRNA microarray數(shù)據(jù)中，MAGOH表達量呈現(xiàn)顯著差異，但WHOⅣ比WHOⅡ略低(圖3B)，為確定MAGOH的表達量是否與膠質(zhì)瘤分級呈正相關(guān)，因此我們做了qRT-PCR驗證。

圖3 MAGOH的表達量與膠質(zhì)瘤WHO分級的關(guān)系

2.4 MAGOH的表達量在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào)且與膠質(zhì)瘤分級呈正相關(guān) MAGOH的表達量在CGGA數(shù)據(jù)庫中已表現(xiàn)為顯著上調(diào)。我們在臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本中使用qRT-PCR技術(shù)檢測MAGOH在各樣本中的表達量，結(jié)果顯示MAGOH的表達量和樣本W(wǎng)HO高低分級呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(見圖4A)，即隨著樣本中MAGOH表達量的增加，WHO分級也呈遞增趨勢。這與CGGA數(shù)據(jù)相符，在組織標(biāo)本中的ROC曲線，下面積達到0.94，見圖4B，這表明MAGOH的表達量在膠質(zhì)瘤的診斷中具有良好的效能。

圖4 qRT-PCR檢測MAGOH在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的表達情況

2.5 高表達MAGOH預(yù)示不良預(yù)后 CGGA m RNA seq FPKM與CGGA mRNA microarray兩個數(shù)據(jù)庫的生存分析顯示MAGOH在膠質(zhì)瘤組織中的表達量和患者預(yù)后存在顯著關(guān)聯(lián)(見圖5A、圖5B)。MAGOH高表達組的預(yù)后明顯差于低表達組。

圖5 CGGA數(shù)據(jù)庫中MAGOH的表達量與生存率的關(guān)系

3 討論

MGMT是一種DNA修復(fù)酶，目前已經(jīng)證實甲基化狀態(tài)下的MGMT啟動子能夠預(yù)測膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的敏感程度[5]，亦有文獻指出MGMT的表達調(diào)控通路可能與TP53基因密切相關(guān)[6]，Dora等[7]的研究進而發(fā)現(xiàn)，p53對MGMT的表達調(diào)節(jié)機制是通過阻斷MGMT啟動子與Sp1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合實現(xiàn)的。本研究中，通過對CGGA數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘并分析，發(fā)現(xiàn)MAGOH與MGMT的表達量亦呈正相關(guān)。MA-GOH在IDH1突變型膠質(zhì)瘤組織中的表達量明顯下調(diào)，而與TP53基因無明顯關(guān)聯(lián)。IDH1突變是在膠質(zhì)瘤中首先被發(fā)現(xiàn)代謝物編碼基因異常[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IDH1突變在低級別膠質(zhì)瘤組織中普遍存在，約占70%左右[9]，且IDH1突變型患者預(yù)后明顯比IDH1野生型患者好，IDH1可作為預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨立指標(biāo)[10]。這提示在膠質(zhì)瘤組織中MAGOH在膠質(zhì)瘤中有深入研究價值。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MAGOH在膠質(zhì)瘤中表達量顯著上調(diào)，且與膠質(zhì)瘤WHO分級正相關(guān)。

MAGOH是人類與果蠅mago nashi基因高度同源的基因，位于人類第1號染色體短臂第3區(qū)，分子量為17164Da，mago nashi基因可參與調(diào)解雌雄同體生物性別決定蛋白的表達，如血吸蟲。另外，mago nashi基因已發(fā)生突變的果蠅所繁衍出的后代在胚質(zhì)組合及種系進化過程中存在一定程度缺陷，這種突變基因亦可編碼哺乳動物的mago nashi同源基因，從而引起哺乳動物的生物學(xué)特性改變。目前，臨床上對MAGOH與人類疾病之間關(guān)系的研究報道較少，在腦部腫瘤的報道更為鮮見。

在CGGA數(shù)據(jù)庫中我們進一步分析了MAGOH與預(yù)后的關(guān)系，生存分析顯示高表達的MAGOH預(yù)示著不良的預(yù)后，這與MAGOH在膠質(zhì)瘤中高表達趨勢相符，這也提示了MAGOH可能參與膠質(zhì)瘤的惡性行為。已有的研究表明MAGOH蛋白、核糖核酸結(jié)合基序蛋白8A(RNAbinding motif protein 8A，RBM8A，亦稱Y14)共同作為外顯子連接復(fù)合體(Exon junction complex，EJC)形成二聚體，作為EJC的核心成分[11]。RBM8A是一種在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達的保守蛋白質(zhì)[12]。EJC與m RNA的生成代謝關(guān)系緊密，可與m RNA結(jié)合而影響mRNA剪接、m RNA定位、翻譯和m RNA降解[13-14]。MAGOH/RBM8A復(fù)合物對EJC調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程十分重要。其他的研究發(fā)現(xiàn)RBM8A-MAGOH復(fù)合體可能影響中心體的定位而參與了有絲分裂的調(diào)控[15]。MAGOH表達量的改變能影響 MAGOH/RBM8A復(fù)合物的形成，這可能是MAGOH參與膠質(zhì)瘤惡性行為的機制之一。

總而言之，我們發(fā)現(xiàn)MAGOH的表達與膠質(zhì)瘤WHO分級正相關(guān)，且在IDH1突變組中下調(diào)，其表達量與患者生存率呈負(fù)相關(guān)。MAGOH對膠質(zhì)瘤有良好的診斷效能，我們認(rèn)為MAGOH是潛在的膠質(zhì)瘤生物標(biāo)志物，且可能參與膠質(zhì)瘤惡性行為，下一步將進行深入研究。