微小RNA-8085在膀胱癌組織中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌J82細(xì)胞侵襲和增殖的影響

王 斌,張志敏,宋 揚(yáng),何 軒,金 豐,王 閣,李 建

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤中心,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:lmno051049@126.com)

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,研究膀胱癌細(xì)胞關(guān)鍵分子的作用機(jī)制,對(duì)深入了解膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及分子靶向治療具有重要的臨床意義[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性小分子非編碼RNA,可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)結(jié)合,促進(jìn)靶基因mRNA的降解或者導(dǎo)致其沉默,進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)[2]。miRNA在腫瘤特別是膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用,研究miRNA在膀胱癌中的作用機(jī)制,對(duì)膀胱癌的診斷、治療及判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義[3]。miR-8085在疾病中的作用報(bào)道研究很少。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-8085在膀胱癌組織中的表達(dá)及過(guò)表達(dá)人膀胱癌J82細(xì)胞中miR-8085的表達(dá)為模型,分析miR-8085在膀胱癌細(xì)胞中的作用機(jī)制,為膀胱癌的分子診斷標(biāo)志物和靶向治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來(lái)源

來(lái)源于陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心2016-08～2018-02手術(shù)切除的32例膀胱癌和癌旁正常組織樣本,手術(shù)切下的樣本迅速凍存于液氮保存,術(shù)后病理均證實(shí)為膀胱癌。本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

人膀胱癌細(xì)胞株J82購(gòu)于上海信然生物技術(shù)有限公司。陰性對(duì)照慢病毒、攜帶miR-8085的慢病毒、miR-NC和miR-8085模擬物購(gòu)于上海吉瑪公司;實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司;野生型與突變型TOP2A 3′非翻譯區(qū)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL-4載體)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司;Lipofectamine?3000和基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;一抗N-cadherin、TOP2A、GAPDH、CDK4、Twist1及Cyclin B和二抗羊抗兔購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

人膀胱癌細(xì)胞株J82培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J82細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度為60%-70%時(shí),分別感染攜帶miR-8085的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒,命名為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。感染操作依據(jù)慢病毒感染說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。感染后第8-12小時(shí)觀察J82細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測(cè)miR-8085和TOP2A的表達(dá)量

應(yīng)用Trizol法提取組織和細(xì)胞中總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-8085或TOP2A的表達(dá)量。qPCR擴(kuò)增參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,62 ℃退火17 s,72 ℃延伸17 s,共36個(gè)循環(huán)。qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理。分別以U6和GAPDH作內(nèi)參,計(jì)算miR-8085和TOP2A的表達(dá)量。引物序列如下,GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-8085上游引物:5′-GGGTGGGAGAGAGGACTG-3′,下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;TOP2A上游引物:5′-TGGCTGTGGTATTGTAGAAAGC-3′,下游引物5′-TTGGCATCATCGAGTTTGGGA-3′。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染J82細(xì)胞的侵襲能力

收集兩組感染細(xì)胞,使用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml?；|(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室上室,37 ℃凝固30 min。在Tran-swell小室上室加入200 μl/孔細(xì)胞懸液,在Transwell小室下室加入650 μl/孔含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱。連續(xù)培養(yǎng)1 d,使用多聚甲醛固定18 min,使用結(jié)晶紫染液染色18 min,使用流水輕輕沖洗,使用棉簽輕輕擦去未穿過(guò)底膜的細(xì)胞。室溫下晾干后,使用顯微鏡計(jì)數(shù)穿過(guò)底膜的細(xì)胞數(shù),每孔隨機(jī)選4個(gè)視野計(jì)數(shù),取平均數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 MTT法檢測(cè)感染J82細(xì)胞的增殖能力

收集兩組感染細(xì)胞,使用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,以每孔3 000個(gè)接種于96孔板,加入200 μl/孔培養(yǎng)基。分別于接種后第1,2,3,4,5天檢測(cè)每孔細(xì)胞的吸光度(A)值。每孔加入MTT試劑20 μl,使其終濃度達(dá)到5 mg/ml,在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h;4 h后吸去上清,加入200 μl/孔二甲基亞砜,在搖床充分振蕩,促進(jìn)結(jié)晶溶解。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)495 nm處每孔的吸光度(A)值。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-8085的靶基因

使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件OncomiR、RegRNA2.0、starbase v2.0和PICTAR2預(yù)測(cè)miR-8085可能的靶基因。TOP2A 3′UTR-MUT為突變型TOP2A 3′非翻譯區(qū)質(zhì)粒,TOP2A 3′UTR-WT為野生型TOP2A 3′非翻譯區(qū)質(zhì)粒。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J82細(xì)胞接種于6孔板,細(xì)胞匯合度為40%-60%時(shí),將miR-8085模擬物或miR-NC分別和TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至J82細(xì)胞,轉(zhuǎn)染嚴(yán)格依據(jù)Lipofectamine?3000說(shuō)明書(shū)操作。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒檢測(cè)每組J82細(xì)胞的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性,采用“螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性”表示每組J82細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測(cè)靶基因的表達(dá)

收集兩組感染細(xì)胞并提取總蛋白,每組分別提取30 μg蛋白溶液,在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳1.5 h,電轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜,5%脫脂牛奶配成的封閉液封閉3 h。在4 ℃搖床上,分別孵育CDK4(稀釋比為1 ∶1 000)、TOP2A(稀釋比為1 ∶2 000)、Cyclin B(稀釋比為1 ∶3 000)、Twist1(稀釋比為1 ∶500)、N-cadherin(稀釋比為1 ∶500)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)。一抗孵育12 h,加入對(duì)應(yīng)的二抗羊抗兔,室溫下孵育2 h。加入超敏ECL發(fā)光試劑,應(yīng)用凝膠成像儀顯影、拍照、分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中miR-8085的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,32例膀胱癌組織和癌旁組織中miR-8085的相對(duì)表達(dá)量分別為2.50±0.78和7.35±0.92,癌旁組織miR-8085的相對(duì)表達(dá)量是膀胱癌組織的2.94倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.94,P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與癌旁組織比較,**P<0.01圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中miR-8085的相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Expression of miR-8085 in bladder cancer tissue and paracancerous tissue

2.2 J82細(xì)胞感染miR-8085病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miR-8085的相對(duì)表達(dá)量分別為1.08±0.25和9.69±1.05,實(shí)驗(yàn)組miR-8085的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的8.97倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.99,P<0.01,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組J82細(xì)胞中miR-8085的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Expression of miR-8085 in J82 cells in control group and experimental group

2.3 miR-8085對(duì)J82細(xì)胞侵襲能力的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中穿膜J82細(xì)胞數(shù)分別為82.63±7.60和35.45±11.27個(gè)。與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組穿膜J82細(xì)胞數(shù)明顯較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.47,P<0.05,見(jiàn)圖3),miR-8085具有抑制膀胱癌J82細(xì)胞侵襲的能力。

與對(duì)照組相比,*P<0.05圖3 miR-8085對(duì)J82細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 3 Effect of miR-8085 on the invasion ability of J82 cells

2.4 miR-8085對(duì)J82細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組J82細(xì)胞在感染后第3,4,5天的A值低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.90,P<0.05;t=4.54,P<0.05;t=5.79,P<0.01),表明miR-8085具有抑制膀胱癌J82細(xì)胞增殖的能力。在第1,2天的A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為0.09,1.73,均P>0.05,見(jiàn)圖4)。

2.5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件miRNAMap、miRDB、RNAhybrid及miRanda分析,miR-8085的靶基因可能是TOP2A,結(jié)合區(qū)域序列見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 miR-8085對(duì)J82細(xì)胞增殖能力的影響Figure 4 Effect of miR-8085 on the proliferation of J82 cells

圖5 miR-8085與TOP2A 3′-UTR結(jié)合區(qū)域的序列Figure 5 Sequence of the binding region of miR-8085 and TOP2A 3′-UTR

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-8085靶向結(jié)合TOP2A

TOP2A 3′UTR-WT核心序列為“UCUCCCA”,TOP2A 3′UTR-MUT突變序列為“AGAGGGU”。分別將miR-8085模擬物或miR-NC與TOP2A 3′UTR-MUT或TOP2A 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染至J82細(xì)胞中,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。miR-8085與TOP2A 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染可有效降低相對(duì)熒光素酶活性(t=12.75,P<0.01),miR-8085與TOP2A 3′UTR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯作用,表明miR-8085可直接靶向結(jié)合TOP2A基因(見(jiàn)圖6)。

2.7 J82細(xì)胞感染miR-8085慢病毒對(duì)TOP2A mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示,感染miR-8085慢病毒后的實(shí)驗(yàn)組J82細(xì)胞中TOP2A mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.20±0.03)明顯低于對(duì)照組(1.01±0.09),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.79,P<0.01),表明miR-8085可有效抑制TOP2A mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.miR-8085+TOP2A 3′UTR-MUT;2.miR-8085+TOP2A 3′UTR-WT;3.miR-NC+TOP2A 3′UTR-MUT;4.miR-NC+TOP2A 3′UTR-WT;與miR-8085+TOP2A 3′UTR-MUT比較,**P<0.01圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-8085靶向結(jié)合TOP2AFigure 6 Verification of the binding of miR-8085 to TOP2A by dual luciferase reporter assay

2.8 TOP2A蛋白、侵襲與增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明,感染miR-8085慢病毒后的實(shí)驗(yàn)組J82細(xì)胞中,TOP2A蛋白表達(dá)量明顯降低,細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白Twist1蛋白以及N-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin B蛋白以及CDK4蛋白表達(dá)減少(見(jiàn)圖7)。

圖7 miR-8085對(duì)TOP2A蛋白及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of miR-8085 on the expression of TOP2A protein and related proteins

3 討論

微小RNA(miRNA)由19-25個(gè)核苷酸構(gòu)成,通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老、轉(zhuǎn)移等各種生物學(xué)行為[4,5]。越來(lái)越多的研究表明,miRNA在膀胱癌的的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,miRNA機(jī)制研究已成為膀胱癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)[6,7]。如miR-497[8]、miR-139-5p[9]、miR-608[10]等miRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)量明顯減少,可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。如miR-556-3p[11]、miR-495[12]在膀胱癌組織中的表達(dá)量明顯增加,可顯著促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖。miR-8085是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,關(guān)于miR-8085的研究未見(jiàn)報(bào)道。miR-8085在膀胱癌中表達(dá)情況及其作用機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示,miR-8085在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著少于癌旁組織,miR-8085可能參與抑制膀胱癌的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步研究miR-8085對(duì)膀胱癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響,本研究以載有miR-8085的慢病毒感染膀胱癌J82細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和MTT法分析過(guò)表達(dá)miR-8085后,J82細(xì)胞侵襲和增殖能力的改變。與陰性對(duì)照慢病毒相比,miR-8085慢病毒可顯著抑制膀胱癌J82細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力,miR-8085具有抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的作用。

miRNA主要通過(guò)抑制靶基因的表達(dá),參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能[13]。本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件miRNAMap、miRDB、RNAhybrid及miRanda預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-8085可能的靶基因拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(TOP2A)。TOP2A參與構(gòu)成核基質(zhì),通過(guò)參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、基因重組等過(guò)程,影響細(xì)胞生物學(xué)行為[14]。TOP2A在正常細(xì)胞和組織中表達(dá)呈低水平狀態(tài),前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中表達(dá)明顯增加,參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等[15,16]。TOP2A在腫瘤的增殖和侵襲可能具有明顯的促進(jìn)作用[16]。有研究表明,TOP2A在膀胱癌中的表達(dá)明顯增加,且與膀胱癌患者的TNM分期和不良預(yù)后明顯相關(guān)[17]。因而,通過(guò)抑制TOP2A的表達(dá),可能具有抑制膀胱癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),miR-8085可直接靶向結(jié)合TOP2A mRNA的3′UTR區(qū)域。qPCR和Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示,過(guò)表達(dá)miR-8085在mRNA和蛋白水平上均可抑制TOP2A的表達(dá)。降低TOP2A蛋白的表達(dá)后,細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白Twist1和N-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin B和CDK4蛋白表達(dá)明顯降低,表明細(xì)胞侵襲能力和增殖能力受到明顯抑制。miR-8085是通過(guò)降低TOP2A基因的表達(dá),參與抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。

本研究確定了miR-8085和TOP2A的靶向調(diào)控關(guān)系,miR-8085可通過(guò)靶向抑制TOP2A基因的表達(dá),抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力,為進(jìn)一步研究miR-8085和TOP2A在膀胱癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。