中國南瓜半短蔓種質(zhì)‘CmSd1’的鑒定和CmSd-1t基因定位

羅文龍　王青　李俊星　鐘玉娟　郭巨先　李桂花　陳木溪　黃河勛

摘 要：植株適度矮生可使株型更緊湊、空間利用率更高，有利于密植栽培、機械化采收和提高單位面積產(chǎn)量。以從多親本復(fù)交后代選育的中國南瓜半短蔓種質(zhì)‘CmSd1為材料，從表型鑒定、外源赤霉素響應(yīng)、遺傳分析和基因定位等方面進行研究。表型觀察發(fā)現(xiàn)，‘CmSd1的半短蔓表型主要是由于主蔓中下部節(jié)間變短所致;‘CmSd1對外源赤霉素表現(xiàn)為敏感且敏感度比長蔓對照更高，推測其半短蔓性狀與赤霉素代謝途徑密切相關(guān);遺傳分析表明，‘CmSd1的半短蔓性狀受1對顯性基因控制，暫命名為CmSd-1（t）;利用F2極端表型混合池進行重測序和BSA分析，將CmSd-1（t）初步定位到中國南瓜第3染色體末端Cmo_Chr03：9.985-10.828 Mb之間。CmSd-1（t）控制的顯性半短蔓材料，具有良好的農(nóng)藝性狀，在中國南瓜矮化育種中有較大的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：中國南瓜;半短蔓;赤霉素;基因定位

Abstract： The moderate dwarf of plants makes them more compact and higher space utilization， facilitating to grow with higher density， mechanized harvesting and hence producing a higher yield per unit area. Herein， we reported the phenotypic and genetic characterization of a semi-dwarf germplasm designated as ‘CmSd1 （Cucurbita moschata Semi-dwarf 1）， which was isolated from crossing progeny of multiple pumpkin varieties （C. moschata）. We found that the semi-dwarf phenotype of ‘CmSd1 was mainly resulted from shortened of internodes in the lower part of the vine. The ‘CmSd1 was more sensitive to exogenous gibberellin treatment than the normal long-vine variety， indicating that its semi-dwarf was associated with gibberellin metabolism. Genetic analysis revealed that semi-dwarf in the ‘CmSd1 was controlled by a dominant major-effect gene temporarily named as CmSd-1（t）. We then mapped the CmSd-1（t） to the region Cmo_Chr03：9.985-10.828 Mb at the end of chromosome 3 of the C. moschata genome， via bulked-segregant sequencing of F2 pools of extreme individuals. We concluded that the CmSd-1（t）， controlling semi-dwarf phenotype without significant negative effects on agronomic important traits， would have a great utilization foreground in developing moderated-dwarf pumpkin varieties.

Key words： Pumpkin （Cucurbita moschata）; Semi-dwarf; Gibberellins; Genetic mapping

半矮生資源的挖掘和利用，推動了第一次“綠色革命”，在全球范圍內(nèi)促成了糧食的大增產(chǎn)[1-2]。植株適度矮生可使株型更緊湊、空間利用率更高，有利于密植栽培、機械化采收和提高單位面積產(chǎn)量，也成為園藝作物育種的重要目標(biāo)。因此，挖掘創(chuàng)制矮生、半矮生材料，日漸受到育種家的重視。

南瓜為葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）的一年生蔓生藤本植物，是重要的世界性園藝作物。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國南瓜種植面積為110萬hm2，總產(chǎn)量超過3 000萬t，是世界南瓜生產(chǎn)和消費第1大國[3]。南瓜遺傳多樣性豐富，其栽培種包括中國南瓜（C. moschata）、印度南瓜（C. maxima）、美洲南瓜（C. pepo，即西葫蘆）、灰籽南瓜（C. mixta）和黑籽南瓜（C. ficifolia）。按主蔓長度，南瓜可以分為蔓生（長蔓）、半蔓生（半短蔓）和矮生（短蔓叢生）等類型;在生產(chǎn)上，美洲南瓜主要為矮生、半蔓生類型品種，印度南瓜主要為蔓生、半蔓生類型品種，而中國南瓜大多為長蔓品種，短蔓品種還很少[3-4]。

由‘蜜本南瓜及其衍生出的中國南瓜品種，是典型的大果型南瓜，曾占我國南瓜種植面積的80%以上，在很大程度上推動了我國南瓜品種的良種化。蜜本類型南瓜的選育和推廣，在我國農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整中起到重要作用。然而，近十多年來，以此類型為代表的中國南瓜品種同質(zhì)化嚴(yán)重，產(chǎn)量、品質(zhì)提高緩慢，也難以滿足機械化生產(chǎn)的需求。針對這些問題，我們將中國南瓜矮化育種作為一個重點育種方向，加大短蔓、半短蔓材料的挖掘和創(chuàng)新創(chuàng)制。筆者以一個從多親本復(fù)交后代選育的中國南瓜半短蔓材料為對象，從表型鑒定、噴施外源赤霉素處理、遺傳分析和基因定位等方面進行分析，以期為后續(xù)開展分子標(biāo)記輔助育種和基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國南瓜半短蔓自交系，暫命名為‘CmSd1（C. moschata Semi-dwarf 1），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所自主選育和保存?！瓹mSd1是由德國奶油南瓜‘Sperli Early Butternut F1（C. moschata）自交后代，與‘一串鈴1號（C. moschata）自交后代、蜜本南瓜（C. moschata）自交后代復(fù)交，經(jīng)16代連續(xù)自交定向篩選，于2016年定型后自交純化而獲得。經(jīng)過2017—2018年共4代鑒定，‘CmSd1均表現(xiàn)為半短蔓，植株健壯，橢圓形瓜，單瓜質(zhì)量在2.0 kg以上，主要農(nóng)藝性狀良好。

利用‘CmSd1與3個有代表性的大果型中國南瓜長蔓自交系（‘D205‘D214‘D220，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育）雜交，F(xiàn)1都表現(xiàn)為半短蔓。以長蔓自交系‘D205作為對照進行表型鑒定，并利用‘CmSd1與‘D205雜交產(chǎn)生的F1、F2群體開展遺傳分析。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗 田間試驗于2018年晚季（8—11月）在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗基地（廣州）完成。自交系及雜交后代催芽育苗，在2片真葉時移栽。待主蔓伸長后，及時進行植株吊蔓、整枝。

1.2.2 外源赤霉素處理 試驗所用藥品赤霉素（GA3）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。GA3處理設(shè)4個質(zhì)量濃度處理，分別為0、100、300和600 mg·L-1;每個處理設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)處理9株。待幼苗處于3葉期，于傍晚將不同濃度的GA3噴施在供試植株葉片上，至有液滴形成。此后，每隔3 d噴施1次，連續(xù)噴施5次。在第5次噴施GA3后第3天，每個處理分別從每個重復(fù)取3株共9株，用直尺測量株高，然后取其平均值。

1.2.3 表型性狀調(diào)查與統(tǒng)計分析 在整個生長期間，觀察南瓜材料主蔓伸長情況。在移栽20 d時，對主蔓是否伸長進行調(diào)查和標(biāo)記;到生長中后期（移栽60 d），調(diào)查的第1節(jié)莖粗、前15節(jié)蔓長和前30節(jié)蔓長。

1.2.4 極端個體混合池測序和BSA分析 在F2群體選取20個長蔓個體，取等量葉片混合提取DNA，作為長蔓極端混合池;選取20個半短蔓個體，取等量葉片混合提取DNA，作為半短蔓極端混合池。將極端混合池的高質(zhì)量基因組DNA，依次進行DNA片段化、片段純化、末端修復(fù)、3′端加A、連接測序接頭、片段大小選擇和PCR擴增構(gòu)建測序文庫（雙末端150 bp），進而通過Illumina Hiseq平臺進行測序。2個混合池測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾，然后利用BWA[5]比對到中國南瓜基因組（C. moschata cv. Rifu， 下載地址ftp：//cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/Cucurbita_moschata/v1/），再通過SAMtools[6]和Varscan 2[7]檢測SNP。利用獲得的SNP計算平方歐氏距離（squared Euclidean distance， ED2）進行BSA分析[8]，以確定候選基因在染色體上的區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國南瓜半短蔓材料‘CmSd1的表型特征

對半短蔓材料‘CmSd1和長蔓自交系‘D205的表型進行持續(xù)觀察。移栽20 d（生長前期），‘D205有8～10片真葉，節(jié)間在6～8節(jié)之后明顯拉長，使其主蔓迅速伸長;而‘CmSd1生長相對較慢，只有6～8片真葉，且全部節(jié)間都很短，主蔓沒有伸長（圖1-A）。‘CmSd1在13～15節(jié)后，節(jié)間才逐漸伸長。到生長中期（移栽40 d），可以觀察到‘CmSd1主蔓基部節(jié)間明顯比‘D205要短（圖1-B～C）。生長中后期（移栽60 d），‘CmSd1與‘D205主蔓基部節(jié)間的長度差異更為明顯，但2者中上部節(jié)間（25～30節(jié)）長度差異不明顯（圖1-D）。結(jié)合前15節(jié)和前30節(jié)蔓長（表1），推測‘CmSd1基部節(jié)間相對更短是導(dǎo)致其主蔓更短的主要原因。此外，‘D205瓜為長條形（圖1-E），‘CmSd1瓜為橢圓形（圖1-F），2者瓜都較大，其F1瓜型呈長棒形。半短蔓材料‘CmSd1綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)異，在大果型南瓜育種中的潛在應(yīng)用價值較大。

2.2 噴施外源赤霉素能促進中國南瓜半短蔓材料的生長和伸長

植物激素能夠?qū)χ参锏纳L和發(fā)育進行調(diào)控，其中赤霉素對株高（蔓長）的影響最大。對長蔓自交系‘D205和半短蔓材料‘CmSd1噴施不同濃度的GA3進行處理，以分析其對外源赤霉素的敏感性。結(jié)果表明，在相同處理下2個材料的株高差異都達到極顯著水平;相對于對照（噴施清水），噴施GA3的2個材料節(jié)間都明顯伸長，使得株高均極顯著高于對照，且觸須提早出現(xiàn)（圖2-A～C）。但是，半短蔓材料‘CmSd1株高增幅要更大，說明該材料對噴施GA3更加敏感（圖2-D）?？梢?，‘CmSd1對外源赤霉素敏感，且敏感度比長蔓材料更高，推測其半短蔓性狀很可能與赤霉素合成或信號傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。

2.3 中國南瓜半短蔓材料‘CmSd1的遺傳分析

利用‘CmSd1與‘D205雜交產(chǎn)生的F1、F2群體開展遺傳分析，其中F2群體在生長前期（移栽20 d后）的表現(xiàn)如圖3-A所示。移栽20 d后，‘D205主蔓已明顯伸長，而F1表現(xiàn)為全部節(jié)間很短、主蔓沒有伸長，與‘CmSd1完全一致。以‘D205和‘CmSd1為對照，對F2群體進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)主蔓未伸長和已伸長的單株數(shù)量分別為144株和51，符合3∶1的分離比（χ2檢驗p=0.71>0.05）。由此可知，在生長前期，‘CmSd1主蔓未伸長相對‘D205主蔓已伸長為顯性，是受1對基因調(diào)控的質(zhì)量性狀。

‘CmSd1和F1主蔓在13～15節(jié)后逐漸伸長，在生長中后期（移栽60 d）對前15節(jié)蔓長、前30節(jié)蔓長和第1節(jié)莖粗進行調(diào)查。F1前15節(jié)蔓長與‘CmSd1基本一致，明顯短于‘D205;其前30節(jié)蔓長要比‘CmSd1更長，但仍然明顯比‘D205短（表1和圖3-B）。F2群體前15節(jié)蔓長為較明顯的雙峰分布（圖3-A），而前30節(jié)蔓長則表現(xiàn)為偏向于‘CmSd1的偏態(tài)分布（圖3-B）?？梢姡捎凇瓹mSd1與‘D205的節(jié)間長度差異主要在下部節(jié)位，而上部節(jié)間長差異不明顯，因此F2群體蔓長在中后期表現(xiàn)為主效QTL控制的數(shù)量性狀遺傳。此外，F(xiàn)2群體第1節(jié)莖粗分布符合正態(tài)分布（圖3-D），表明此性狀由微效基因控制，與蔓長沒有相關(guān)性。綜合分析，我們認為‘CmSd1的半短蔓表型是由中下部節(jié)間變短所致，受1對顯性基因控制，暫命名為CmSd-1（t）。

2.4 中國南瓜半短蔓基因CmSd-1（t）的快速定位

為了對半短蔓基因CmSd-1（t）進行定位，在F2群體取移栽20 d主蔓已伸長（隱性）和未伸長（顯性）的個體各20個，分別構(gòu)建極端表型混合池進行基因組重測序和BSA分析。其中，隱性混合池取樣個體前15節(jié)平均長105.06 cm，前30節(jié)平均長338.94 cm;顯性混合池取樣個體前15節(jié)平均長54.12 cm，前30節(jié)平均長220.77 cm。利用2個池的SNP頻率計算平方歐式距離（ED2），繪制散點圖和擬合曲線進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)在第3染色體末端的ED2顯著高于其他區(qū)域（圖4）。進一步比較分析該區(qū)域SNP頻率在2個池的差異，將半短蔓基因CmSd-1（t）初步定位在中國南瓜第3染色體末端Cmo_Chr03：9.985-10.828 Mb。

3 討 論

植株適度矮生可使株型更緊湊、空間利用率更高，有利于密植栽培、機械化采收和提高單位面積產(chǎn)量。水稻中，除了sd-1之外，雖然已鑒定了超過70個基因可以導(dǎo)致矮桿、半矮稈性狀，但這些基因除了引起矮化還會影響其他農(nóng)藝性狀，使其難以應(yīng)用于培育矮桿抗倒伏品種[9]。因此，挖掘和創(chuàng)制具有良好農(nóng)藝性狀的矮生資源尤顯重要。

目前，南瓜屬作物矮生性狀的研究還較少，而且主要集中在美洲南瓜（西葫蘆）和印度南瓜。已報道的中國南瓜矮生（叢生）資源僅有Bu和cga，2者均表現(xiàn)為主蔓極短，植株叢生[10-11]。由于中國南瓜（尤其是大果型中國南瓜）在生產(chǎn)上以爬地栽培、采收老瓜為主，矮化叢生較為不利，因而這些矮生材料的直接育種利用價值有限。本研究對自主創(chuàng)制的一個中國南瓜半短蔓材料‘CmSd1進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其半短蔓表型主要是由中下部節(jié)間相對更短導(dǎo)致（圖1），到生長中后期蔓長相對于長蔓自交系短約1/3（表1）。相比其他已知的中國南瓜矮生材料，‘CmSd1的半短蔓（半矮生）表型明顯不同，更適于爬地栽培，單瓜大（2.0 kg以上），在育種中應(yīng)用價值更高。

研究者們利用大量突變體逐漸揭示了植物激素調(diào)控株高的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，其中赤霉素代謝和信號傳導(dǎo)途徑起到關(guān)鍵作用[12]。大多數(shù)植物矮化是由于突變體內(nèi)赤霉素和油菜素內(nèi)酯合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到影響，少數(shù)與生長素、獨腳金內(nèi)酯有關(guān)[13]。水稻“綠色革命”基因sd-1就是編碼赤霉素生物合成途徑關(guān)鍵酶GA20ox的基因GA20ox-2發(fā)生突變，導(dǎo)致節(jié)間縮短而不影響穗部性狀，使植株矮化、株型更緊湊和更耐肥，最終推動單位面積產(chǎn)量大幅提高[2]。本研究中鑒定的半短蔓材料‘CmSd1對赤霉素敏感，且敏感度比長蔓自交系更高。由此推測，‘CmSd1的半短蔓表型可能與由于赤霉素代謝或信號傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。此外，激素代謝和信號通路存在廣泛的互作，某種激素含量的改變往往會引起其他激素的變化，從而導(dǎo)致植株矮化，同時影響到生長發(fā)育和其他性狀?！瓹mSd1 在前期的生長速度比長蔓材料更慢，暗示其生長發(fā)育可能受到多種激素相互作用的影響。

通過對半短蔓材料‘CmSd1與長蔓自交系的雜交后代群體進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)半短蔓表型受1個顯性基因調(diào)控，暫命名為CmSd-1（t）。利用極端池進行BSA測序分析，我們將CmSd-1（t）初步定位于中國南瓜基因組第3染色體末端Cmo_Chr03：9.985～10.828 Mb之間（圖4）。在南瓜屬作物上，包括qCmB2（定位于印度南瓜第3連鎖群）[14]、qCpDy1和qCpDm1（定位于美洲南瓜第20連鎖群）[15]、dm1[16]（印度南瓜）、Bu（中國南瓜，比較定位至黃瓜5 號染色）[17]等多個矮生性狀相關(guān)的基因/QTL已得到定位。然而，由于南瓜屬作物的基因組發(fā)展較晚，對不同栽培種的比較基因組研究還較少，筆者定位的CmSd-1（t）和上述基因/QTL是否是等位基因或同源基因還有待進一步深入分析。上述這些基因/QTL控制的矮生表型均為短蔓叢生，尤其是攜帶中國南瓜矮生基因Bu的突變體表現(xiàn)為對外源赤霉素低敏感。相比這些已知的基因/QTL，CmSd-1（t）調(diào)控顯性半短蔓表型，對外源赤霉素高度敏感，由此推測，CmSd-1（t）調(diào)控蔓長的分子機制與已知南瓜矮生基因/QTL可能是不同的，有可能是新的南瓜矮生基因。

綜上所述，CmSd-1（t）控制半短蔓表型且對其他重要農(nóng)藝性狀無不利影響，在中國南瓜育種中的潛在價值較大，有必要對其開展精細定位、分子克隆和功能研究，從而為更加科學(xué)合理地利用其開展南瓜矮化育種提供支撐。

參考文獻

[1] SASAKI A，ASHIKARI M，UEGUCHI-TANAKA M，et al.Green revolution： a mutant gibberellin-synthesis gene in rice[J].Nature，2002，416（6882）：701.

[2] HEDDEN P.The genes of the Green Revolution[J].Trends in Genetics，2003，19（1）：5-9.

[3] 方智遠.中國蔬菜育種學(xué)[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，2017.

[4] 雷逢進，王曉民，馬理軍，等.不同矮蔓性西葫蘆產(chǎn)量與其構(gòu)成因素的關(guān)系[J].中國瓜菜，2013，26（3）：23-26.

[5] LI H，DURBIN R.Fast and accurate short read alignment with burrows-wheeler transform[J].Bioinformatics，2009，25（14）：1754-1760.

[6] LI H，HANDSAKER B，WYSOKER A，et al.The sequence alignment/map format and SAMtools[J].Bioinformatics，2009，25（16）：2078-2079.

[7] KOBOLDT D C，ZHANG Q，LARSON D E，et al.VarScan 2：somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing[J].Genome Research，2012，22（3）：568-576.

[8] HILL JT，DEMAREST BL，BISGROVE BW，et al.MMAPPR：mutation mapping analysis pipeline for pooled RNA-seq[J].Genome Research，2013，23（4）：687-697.

[9] LIU C，ZHENG S，GUI J，et al.Shortened basal internodes encodes a gibberellin 2-oxidase and contributes to lodging resistance in rice[J].Molecular Plant，2018，11（2）：288-299.

[10] 李云龍，李海真，崔崇士，等.與南瓜矮生基因連鎖的分子標(biāo)記[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（2）： 279-282.

[11] WU T，CAO J，QIN Z，et al.Identification of a novel ga-related bush mutant in pumpkin （Cucurbita moschata Duchesne）[J].Pakistan journal of botany，2015，47（4）：1359-1366.

[12] WANG Y，ZHAO J，LU W，et al.Gibberellin in plant height control：old player，new story[J].Plant Cell Reports，2017，36（3）：391-398.

[13] 白麗君，尹淑霞.植物矮化突變體的來源及矮化機理研究進展[J].生物技術(shù)通報，2014（6）：34-39.

[14] ZHANG G，REN Y，SUN H，et al.A high-density genetic map for anchoring genome sequences and identifying QTLs associated with dwarf vine in pumpkin （Cucurbita maxima Duch.）[J].BMC Genomics，2015，16（1）：1101.

[15] XIANG C，DUAN Y，LI H，et al.A high-density EST-SSR-based genetic map and QTL Analysis of dwarf trait in Cucurbita pepo L.[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（10）：3140.

[16] WANG R，HUANG H，LIN Y，et al.Genetic and gene expression analysis of dm1，a dwarf mutant from Cucurbita maxima Duch.ex Lam，based on the AFLP method[J].Canadian Journal of Plant Science，2014，94（2）：293-302.

[17] 王深浩.中國南瓜矮生基因Bu的比較定位及其矮生性狀的生理研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.