紅楓品種“四季紅”休眠芽萌發(fā)誘導(dǎo)與培養(yǎng)

施帥男　陸葉　楊金海等

摘要：四季紅紅楓是一種重要的園林綠化樹種，為獲得足夠多的外植體材料并建立“四季紅”紅楓的離體快速繁殖體系，分別在自然條件和離體條件下利用植物激素對(duì)休眠芽進(jìn)行催芽處理。結(jié)果表明，在活體情況下噴施0.1 mg/L赤霉素能夠促進(jìn)休眠芽萌發(fā)。在離體培養(yǎng)條件下，通過在MS基本培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L TDZ、1.0 mg/L BA、1.0 mg/L NAA，休眠芽萌發(fā)率最高可達(dá)到73.3%。

關(guān)鍵詞：休眠芽；赤霉素（GA）；噻苯??；萌發(fā)培養(yǎng)；萌發(fā)率；紅楓

中圖分類號(hào)： S687.04+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0090-03

收稿日期：2014-11-12

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)基金（編號(hào)：13KJA220001）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（編號(hào)：PAPD）。

作者簡(jiǎn)介：施帥男（1989—），女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。E-mail：shishuainan99@163.com。

通信作者：施季森，教授。E- mail：jshi@njfuedu.cn。紅楓品種“四季紅”（Acer palmatum ‘Trompenburg）是槭樹科的落葉小喬木。其葉形優(yōu)美，紅色鮮艷持久，樹姿美觀，是一種非常美麗的觀葉稀有樹種[1]，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值?！八募炯t”的主要繁殖方法有播種繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖[2]，但是紅楓種子繁殖方式成活率較低，一般在30%～40%[3-4]，而扦插繁殖與嫁接繁殖效率受母樹年齡與環(huán)境因素影響較大。組織培養(yǎng)不僅可以克服種子繁殖中存在的諸多問題，而且可以克服扦插繁殖速度慢、難生根、繁殖率低的缺點(diǎn)，還能保持母體的遺傳特性，是解決優(yōu)良種苗快速繁殖的最佳方式。但是筆者觀察到紅楓“四季紅”品種的休眠芽不僅萌動(dòng)較慢，而且只有部分能夠展葉，其他多數(shù)休眠芽一直停留在休眠狀態(tài)，因此如果要建立該品種的離體快速繁殖體系，必須解決外植體材料來源困難的問題。為獲得足夠多的用于離體培養(yǎng)的外植體材料，本研究分別在活體條件和離體條件下外施植物激素，探討植物激素對(duì)紅楓休眠芽萌發(fā)的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

研究材料為南京橋林林業(yè)科技有限公司的紅楓“四季紅”品種的嫁接盆栽苗，地徑為3cm，苗高1m，休眠芽均處于休眠狀態(tài)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1活體條件下赤霉素對(duì)莖段休眠芽萌發(fā)的影響“四季紅”紅楓原種購(gòu)自加拿大，目前在市場(chǎng)上出現(xiàn)得很少，國(guó)內(nèi)只有少數(shù)公司進(jìn)行培育，市場(chǎng)供不應(yīng)求。本試驗(yàn)中用到的材料為嫁接再生植株，由于嫁接難度大因而材料稀少，因此，本試驗(yàn)選取24株嫁接盆栽苗，進(jìn)行不同濃度（0、0.05、0.10 mg/L）的赤霉素處理，每組8株。每隔3 d噴施1次，共處理9次，27 d后統(tǒng)計(jì)休眠芽萌發(fā)個(gè)數(shù)。

1.2.2離體條件下TDZ和NAA對(duì)休眠芽萌發(fā)的影響

1.2.2.1外植體滅菌處理從未經(jīng)GA處理的植株上剪下帶有休眠芽的莖段，每個(gè)莖段長(zhǎng)約4 cm，分別標(biāo)號(hào)，用于后期組織培養(yǎng)。剪取材料時(shí)用鑷子夾取，再放入收納袋，避免手指上的油脂觸碰到莖段，難以表面滅菌，造成后期組培污染。

在滅菌處理之前，先用自來水沖洗20 min，并用毛刷輕輕刷去上面的雜質(zhì)，然后設(shè)計(jì)不同滅菌方式。消毒處理采用3因子2水平的L4（23）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別利用70%乙醇（10、15 s）、吐溫80（加2滴、不加）和0.1% HgCl2（10、15 min）進(jìn)行處理。各處理后均用無菌水沖洗5遍，均處理30個(gè)外植體，25 d后統(tǒng)計(jì)污染率和萌發(fā)率，篩選出最佳滅菌方式。

1.2.2.2培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)本試驗(yàn)根據(jù)報(bào)道的美國(guó)紅楓組培方法[5-6]，以MS+1.0 mg/L BA為基礎(chǔ)，分別測(cè)定TDZ和NAA對(duì)休眠芽萌發(fā)的影響。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度和種類采用2因素3水平L9（32）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），其中TDZ的濃度分別為 0、0.5、1.0 mg/L，NAA的濃度分別為0.50、0.75、1.00 mg/L。

培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L、瓊脂6.4 g/L，pH值為5.7，分裝至三角瓶中后于121 ℃高壓滅菌20 min。每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理接10瓶，3次重復(fù)。接種后每天觀察休眠芽的萌動(dòng)趨勢(shì)，25 d后統(tǒng)計(jì)接種數(shù)（除去污染數(shù)）、萌芽率并觀察芽的長(zhǎng)勢(shì)，尋找最合適的培養(yǎng)基。培養(yǎng)期間及時(shí)隨機(jī)取出污染的瓶子，以避免交叉污染，因此統(tǒng)計(jì)的接種數(shù)為去除污染數(shù)后的總數(shù)。

1.2.2.3培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)材料于（25±2） ℃光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h，在相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，每25 d繼代培養(yǎng)1次。

1.2.2.4數(shù)據(jù)分析方法培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的污染率、萌芽率等指標(biāo)。指標(biāo)計(jì)算方法如下：污染率=（污染的休眠芽數(shù)目/接種的休眠芽數(shù)目）×100%；萌芽率=（未污染休眠芽萌動(dòng)數(shù)目/未污染的休眠芽數(shù)目）×100%。

用Excel軟件計(jì)算在活體條件下試驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)的顯著性，用SPSS軟件分析離體條件下最佳組合培養(yǎng)基。

2結(jié)果與分析

2.1赤霉素處理對(duì)莖段休眠芽萌發(fā)的影響

根據(jù)不同處理?xiàng)l件下休眠芽萌發(fā)情況（圖1），休眠芽的萌發(fā)率隨著所施GA濃度升高而升高。當(dāng)赤霉素濃度為 0.10 mg/L 時(shí)，萌發(fā)率最高，平均每天萌發(fā)2個(gè)休眠芽，27 d后，平均每株萌發(fā)數(shù)達(dá)到20個(gè)（圖2-C）；赤霉素濃度為 0.05 mg/L 時(shí)，平均每天萌發(fā)1個(gè)休眠芽，27 d后，平均每株萌發(fā)數(shù)達(dá)到12個(gè)（圖2-B）；而對(duì)照組平均每6 d左右萌發(fā)1個(gè)休眠芽，27 d后只有頂部枝條發(fā)芽，平均每株萌發(fā)8個(gè)（圖2-A）。經(jīng)GA處理后，休眠芽萌發(fā)時(shí)間提前，在處理3 d后，休眠芽開始萌發(fā)，而對(duì)照組則在處理6 d后開始萌發(fā)。將處理27 d后各組休眠芽萌發(fā)個(gè)數(shù)用Excel進(jìn)行顯著性分析可以得出，P值為0.043<0.05，說明赤霉素對(duì)休眠芽萌發(fā)促進(jìn)效果顯著，濃度為0.10 mg/L時(shí)萌發(fā)效果最好。

2.2離體條件下休眠芽萌發(fā)培養(yǎng)

2.2.1不同消毒方式的影響選擇適當(dāng)?shù)南緞┙M合并確定合適的消毒時(shí)間是建立外植體無菌體系的重要基礎(chǔ)。本試驗(yàn)對(duì)“四季紅”紅楓帶芽莖段用70%乙醇表面消毒20～30 s，無菌水沖洗5次，然后用0.1%HgCl2滅菌5～7 min（加或不加吐溫80）進(jìn)行表面滅菌，用無菌水沖洗5次后，接種到休眠芽萌發(fā)培養(yǎng)基上，消毒劑組合效果見表2。

方差分析結(jié)果表明，根據(jù)污染率試驗(yàn)結(jié)果，吐溫80對(duì)外植體滅菌效果影響最大，其次是0.1% HgCl2滅菌時(shí)間，最后是乙醇滅菌時(shí)間。綜合污染率及萌發(fā)率試驗(yàn)結(jié)果，A2B1C1為最優(yōu)組合，即乙醇處理30 s，含吐溫80的0.1%HgCl2滅菌 5 min，該處理?xiàng)l件下污染率為4.60%，與其他處理差異極顯著（P<0.01）。吐溫80可增加滅菌液的溶解度，使消毒液能充分與植物材料接觸，不會(huì)造成材料的損傷，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，吐溫并未對(duì)萌發(fā)率造成干擾。

2.2.3離體培養(yǎng)條件下TDZ和NAA對(duì)休眠芽萌發(fā)的影響由表3可以看出，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及配比對(duì)休眠芽的萌發(fā)效果存在一定的差異。當(dāng)濃度為0.5 mg/L TDZ與不同濃度NAA配比時(shí)，萌發(fā)率最好。如表3所示，1.00 mg/L NAA和0.5 mg/L TDZ組合為正交試驗(yàn)最佳組合，休眠芽的萌發(fā)率最高，萌發(fā)率為73.3%，而且萌發(fā)狀態(tài)較好，在接種培養(yǎng)10 d后芽苞膨大（圖3-B），隨后開始慢慢展葉，20 d后展出新葉（圖3-C），30 d后基于穩(wěn)定，35 d后完全展葉，葉柄長(zhǎng)約1 cm（圖3-D）。其次，0.75 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ，萌發(fā)率為66.7%；最后為0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L TDZ，萌發(fā)率為66.7%。當(dāng)TDZ濃度提高到1.0 mg/L時(shí)，萌發(fā)率明顯下降，0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L TDZ萌發(fā)率為20%，0.75 mg/L NAA +0.5 mg/L TDZ萌發(fā)率為40%，1.00 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ萌發(fā)率為60%。由此看出，在相同濃度TDZ條件下休眠芽萌發(fā)率隨NAA濃度升高而升高。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)TDZ濃度高于0.5 mg/L時(shí)，莖段底部玻璃化現(xiàn)象的頻率增加，玻璃化程度加重將抑制植物的生長(zhǎng)，萌發(fā)率開始下降。這與謝寅峰等的青錢柳休眠芽萌發(fā)誘導(dǎo)研究結(jié)果[7]一致。

3結(jié)論與討論

赤霉素是一種高效廣普性植物激素，赤霉素處理會(huì)促進(jìn)植物可溶性糖和蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)植物細(xì)胞及莖段伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)大，加速生長(zhǎng)和發(fā)育，使作物提早成熟[8]。薛志成用 5～10 mg/L赤霉素溶液處理15 min，有利于馬鈴薯休眠芽的萌發(fā)[9]。本研究首次對(duì)“四季紅”紅楓休眠芽噴施赤霉素，探討外源激素對(duì)休眠芽萌發(fā)的影響，在3組試驗(yàn)中，對(duì)照組萌發(fā)率明顯低于試驗(yàn)組，說明赤霉素有利于“四季紅”紅楓休眠芽的萌發(fā)，而且萌發(fā)速率隨著濃度的升高而升高。結(jié)果顯示，當(dāng)赤霉素濃度為0.10 mg/L時(shí)，休眠芽萌發(fā)效率最佳。

外源植物激素對(duì)外植體的形態(tài)建成及其調(diào)控起著十分重要的作用，其種類的選擇和濃度的搭配影響著植株的再生方式。TDZ是科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的具有植物細(xì)胞分裂素活性的一類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以促進(jìn)植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眠，并且可以通過配合其他植物激素和生理活性物質(zhì)的作用來調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程[10-13]。Hutchison等利用熱帶果樹的帶腋芽莖段為外植體，在培養(yǎng)基中添加TDZ，已成功誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)[14-16]。本試驗(yàn)參考美國(guó)紅楓MS+1.0 mg/L BA的培養(yǎng)條件，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的TDZ和NAA，結(jié)果顯示，當(dāng)添加0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L NAA時(shí)，能快速有效的促進(jìn)休眠芽萌發(fā)。

本試驗(yàn)分別在自然條件和離體條件下，初步探討了四季紅紅楓休眠芽萌發(fā)的影響因子，通過調(diào)整外源激素的濃度，達(dá)到休眠芽快速萌發(fā)的效果，為穩(wěn)定而高效的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

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