小麥dms突變體株高與赤霉素代謝的關(guān)系

于東艷，朱欣欣，李巧云，姜玉梅，牛吉山

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

小麥dms突變體株高與赤霉素代謝的關(guān)系

于東艷，朱欣欣，李巧云，姜玉梅，牛吉山*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家小麥工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

為探究小麥dms突變體矮化的原因，用HPLC測定了大田植株發(fā)育過程中dms突變體矮株(D)、中等株(M)、高株(T)的莖稈赤霉素含量的變化；測量了噴施赤霉素后大田dms突變體株高的變化，并通過測量赤霉素處理后dms突變體幼苗胚芽鞘和第1葉長的長度變化，研究了dms突變體對赤霉素的敏感性。結(jié)果顯示，D、M、T株對赤霉素的敏感時期和敏感濃度不同，總體來講，T株敏感性最大，M株和D株次之；周麥18和T株幼苗的第1葉長度在200 μmol/L赤霉素處理下顯著增加，M株的第1葉長對赤霉素響應(yīng)不顯著，周麥18幼苗的胚芽鞘長度在100 μmol/L赤霉素處理下顯著增加，而T株和M株的胚芽鞘長度在各濃度赤霉素處理下均與空白對照無顯著差異，D株在相同培養(yǎng)條件下生長遲緩，多數(shù)種子腐爛或出現(xiàn)胚芽鞘畸形，證明其對赤霉素敏感性差或者不敏感；在不同的生長時期，dms突變體D、M、T株的內(nèi)源赤霉素含量都有很大變化，結(jié)合大田試驗發(fā)現(xiàn)，D株在內(nèi)源赤霉素含量最低的時期對外源赤霉素敏感，在內(nèi)源赤霉素含量較高的時期對外源赤霉素不敏感，不能簡單界定D株屬于赤霉素缺陷型突變體或赤霉素不敏感型突變體。

小麥；dms突變體； 矮稈； 赤霉素

植物矮化突變體是基礎(chǔ)理論研究與作物育種研究中很有價值的一類種質(zhì)資源。引起植株矮化的原因有很多，最常見的是激素代謝途徑的變異[1]。赤霉素是促進(jìn)植物莖稈伸長的關(guān)鍵物質(zhì)，許多小麥矮稈突變體是由于赤霉素合成或代謝途徑產(chǎn)生障礙導(dǎo)致的。依據(jù)植株對赤霉素的反應(yīng)，可把小麥矮化突變體分為赤霉素缺陷型和赤霉素不敏感型[2]。通過矮稈突變體對外源赤霉素的反應(yīng)，以及測定分析莖稈快速伸長期赤霉素含量變化，能有效驗證突變體的赤霉素代謝類型。發(fā)現(xiàn)較早的小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b對外源赤霉素響應(yīng)弱，屬于赤霉素不敏感型基因[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素能彌補(bǔ)小麥矮稈基因Rht12對小麥形態(tài)發(fā)育的影響，暗示Rht12突變體屬于赤霉素合成缺陷型突變體[4]。前期報告了一個小麥新突變體dms，其典型特征之一就是植株矮化，節(jié)間長度也顯著縮短[5]。但小麥dms突變體是否屬于赤霉素合成缺陷或赤霉素不敏感型突變體還不清楚，因此，進(jìn)行了dms突變體莖稈發(fā)育與赤霉素代謝間關(guān)系的研究，報道如下。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試品種周麥18由周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。突變體dms由國家小麥工程技術(shù)研究中心實驗室發(fā)現(xiàn)并保存，構(gòu)建了自交系。dms突變體M株的后代分3種表型，高株(T，約0.8 m)、中等株(M，約0.6 m)和矮株(D，不足0.3 m)。形態(tài)觀察顯示，M株的每個節(jié)間縮短了20～50 mm，D株的節(jié)間數(shù)比T株和周麥18少2個，且其節(jié)間長度也顯著縮短。T型植株后代不分離，但M型植株后代再次分離為T型、M型和D型植株，詳見前期報告[5]。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間赤霉素處理 田間試驗在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)滎陽農(nóng)場進(jìn)行。試驗設(shè)置空白對照(CK1)和負(fù)對照(噴施0.003%多效唑,CK2)，赤霉素濃度分別設(shè)置50、100、150、200 μmol/L，共6個小區(qū)，每個小區(qū)長3 m、寬2.5 m。2014年10月10日將dms突變體M植株上收獲的種子按行長2 m、行距 0.25 m進(jìn)行播種。為防止藥物揮發(fā)，相互影響，在處理之前將不同試驗小區(qū)用塑料膜屏障隔開。在每個小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選擇D、M、T型植株各15株，編號、標(biāo)記，在小麥拔節(jié)前(選擇3月12日)以及3月25日到4月19日對標(biāo)記植株進(jìn)行赤霉素和多效唑噴施處理，其中3月25日之后每隔3～5 d噴一次，并于下一次噴施之前對標(biāo)記的植株株高進(jìn)行測量。

1.2.2 幼苗赤霉素處理 幼苗赤霉素處理參考郭保宏[6]的方法并加以改進(jìn)。隨機(jī)選取周麥18和dms突變體M植株后代的種子15粒，點(diǎn)播在鋪有雙層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每個種子位置固定并編序號。在溫度20 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)。赤霉素濃度設(shè)置0、15、50、100、150、200 μmol/L共6個梯度試驗。種子萌動后，每天用棉簽蘸取適量的赤霉素溶液涂抹在胚芽鞘上，待第1葉長出后用小噴壺噴施在第1葉上，噴至葉上水珠滴落為止。重復(fù)2次。待第1葉充分展開后(12 d左右，第2葉初露時)測量第1葉長度和胚芽鞘長度。試驗結(jié)束后將全部幼苗連同莖部剪下，提取DNA，用SSR標(biāo)記檢測幼苗的基因型。鑒定幼苗為D、M、T型后，分別計算D、M、T型幼苗第1葉長和胚芽鞘長的平均值。

1.2.3 幼苗表型的SSR標(biāo)記鑒定 由于不能從培養(yǎng)皿中的幼苗形態(tài)確定其成株時的表型，開發(fā)了SSR半定量鑒定方法。在嚴(yán)格控制PCR體系中DNA模板量時，T型株擴(kuò)增產(chǎn)物是M株的2倍，D株無條帶，以此判別籽粒的基因型。

以提取的幼苗基因組DNA為模板，用引物Xgwm95[7](上游序列：5′-GAT CAA ACA CAC ACC CCT CC-3′，下游序列：5′-AAT GCA AAG TGA AAA ACC CG-3′)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積10 μL，反應(yīng)液組成為1 × PCR buffer(含Mg+)、200 μmol/L dNTP、每條引物0.2 μmol/L，DNA模板50 ng，1 UTaq聚合酶。擴(kuò)增程序是95 ℃ 2 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、觀察。

1.2.4 內(nèi)源赤霉素含量的測定 從2015年3月29日至4月19日，每隔3～5 d在大田取D、M、T植株的幼莖最上節(jié)測量其內(nèi)源赤霉素的含量。為了對比小麥拔節(jié)前的赤霉素含量，在3月15日取樣一次調(diào)查赤霉素含量。將植株置于冰袋上運(yùn)回實驗室，剝?nèi)∮浊o，在液氮中研磨成粉末狀。提取方法參考Tang等[8]和Pan等[9]的方法：在10 mL離心管內(nèi)加入1 mL 80%甲醇，稱取質(zhì)量；將樣品粉末轉(zhuǎn)移到裝有冷甲醇的離心管中，再次稱質(zhì)量，2次稱得的質(zhì)量差即為樣品質(zhì)量；按照料液比1∶10補(bǔ)足甲醇，搖晃均勻，在4 ℃冰箱里避光浸提12 h，其間不時搖晃促進(jìn)充分浸提；用滅菌的干凈濾紙過濾提取液，用2 mL 80%甲醇洗滌濾渣，再次過濾；合并濾液，過C18固相萃取小柱(CleanertS C18，天津博納艾杰爾公司)凈化濾液；氮吹儀吹干，加80%甲醇定容至1 mL；過膜(0.22 μm)，Waters 2695高效色譜儀進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有株高、胚芽鞘長度和第1葉長的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素對dms突變體D、M和T型小麥株高的影響

不同時期D、M和T型植株的平均株高和顯著性結(jié)果見表1。對比D、M、T株對赤霉素的敏感時期和敏感濃度發(fā)現(xiàn)，D株和T株都對赤霉素敏感的時期只有3月15日和4月15日，但在3月15日D株的赤霉素敏感濃度比T株高，且在莖發(fā)育中后期(3月29日—4月11日)對赤霉素不敏感，提示其對赤霉素敏感度不如T株。T株在200 μmol/L赤霉素處理下，在3月15日—4月19日，株高較空白對照或負(fù)對照都有顯著提高。M株在4月3—7日對赤霉素不敏感，在3月29日和4月11—19日對赤霉素處理敏感，且敏感性都是較負(fù)對照多效唑處理而言，與空白對照并無顯著差異，提示M株對赤霉素的敏感性不如T株。

雖然赤霉素能對D株和M株產(chǎn)生影響，但并未使D株和M株的株高接近T株，說明赤霉素并不能使dms突變體的株高發(fā)育恢復(fù)正常。

2.2 赤霉素對dms突變體第1葉長和胚芽鞘長度的影響

表2顯示，周麥18種子的第1葉長在200 μmol/L赤霉素處理下比空白對照增加0.77 cm(6.6%)，達(dá)顯著水平(P=0.036)，胚芽鞘長度在100 μmol/L的赤霉素濃度下比空白對照增加0.20 cm(6.4%)，達(dá)顯著水平(P=0.018)；T株第1葉長在200 μmol/L赤霉素處理下比空白對照增加了0.90 cm(8.9%)，達(dá)到顯著水平(P=0.020)，而T株和M株的胚芽鞘長度以及M株第1葉長對外源赤霉素均不敏感。以上數(shù)據(jù)表明，周麥18和T株種子對赤霉素處理敏感，M株敏感性在給出的處理濃度下敏感性相對較差；D株種子發(fā)育遲緩，多數(shù)籽粒出現(xiàn)胚芽鞘和第1葉畸形生長，5 d左右種子腐爛，噴施赤霉素沒有促進(jìn)其正常生長，表明其對赤霉素不敏感或敏感性差。

2.3 幼苗表型的SSR標(biāo)記結(jié)果

SSR標(biāo)記鑒定D、M、T型植株的電泳結(jié)果如圖1所示。在嚴(yán)格控制PCR體系中DNA模板量時，T型株擴(kuò)增產(chǎn)物是M株的2倍，T型株條帶色深、帶寬，M株條帶色淺、帶窄，D株無條帶。

表1 不同時期多效唑和赤霉素處理下D、M、T株平均株高

注：*表示與空白對照的差異達(dá)0.05顯著水平，§表示與負(fù)對照多效唑處理的差異達(dá)0.05顯著水平。

表2 不同濃度赤霉素處理下dms突變體第1葉及胚芽鞘長度

注：*表示差異達(dá)到顯著水平。D株幼苗不正常生長，后期多數(shù)種子腐爛，表中未列出。

m：Marker； T：T型植株； M：M型植株； D：D型植株

2.4dms突變體不同類型植株內(nèi)源赤霉素含量變化

不同時期D、M、T株內(nèi)源赤霉素含量變化見表3。在3月29日—4月3日，D、M、T株內(nèi)源赤霉素含量較高，此時正值天氣轉(zhuǎn)暖，小麥莖稈處于快速生長期，但D株株高在3月29日和4月3日2個時期較空白對照或負(fù)對照并未顯著增加，小麥拔節(jié)前(3月15日)D株內(nèi)源赤霉素含量最低，但在外源赤霉素處理下株高較空白對照有顯著提高。這可能由于D株對赤霉素的敏感性具有階段性，也可能因為高濃度的赤霉素不利于D株的生長，這一點(diǎn)從4月15日D株內(nèi)源赤霉素再次大幅降低，但在外源赤霉素處理下株高較空白對照有顯著提高也可以說明。

表3 不同時期D、M、T株幼莖最上節(jié)平均赤霉素含量 μg/g

3 結(jié)論與討論

在對小麥矮稈基因的報道中，株高性狀都是通過測量小麥成熟后的株高得到的，如Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素能彌補(bǔ)小麥矮稈基因Rht12對小麥形態(tài)建成的影響。本研究在3月15日(小麥拔節(jié)前)，以及從3月19日小麥起身到4月中下旬小麥孕穗，調(diào)查了dms突變體D、M、T株小麥的株高變化以及不同時期對外源赤霉素的敏感情況，發(fā)現(xiàn)矮稈的D株只在3月15日和4月15日2個時期對赤霉素敏感，且這2個時期D株內(nèi)源赤霉素含量最低。由此推測D株矮化可能有兩方面原因：一方面，可能由于D株對赤霉素的敏感性具有階段性，在莖發(fā)育期能大量合成赤霉素，但是與此同時D株對赤霉素不敏感，從而導(dǎo)致了株高變矮；另一方面，在3月29日—4月3日D株內(nèi)源赤霉素增長幅度最大，但高濃度的赤霉素可能不利于D株的生長，導(dǎo)致了D株株高變矮。對dms幼苗做赤霉素處理的試驗證明，D株和M株對赤霉素的敏感性不如T株。大田赤霉素噴施試驗證明，各類型植株株高雖有所增加，但D株遠(yuǎn)未達(dá)到M株的水平，M株也遠(yuǎn)未達(dá)到T株的水平。

以上結(jié)果說明，dms突變體D株矮化的原因不能簡單界定為對赤霉素不敏感或者赤霉素合成缺陷，其矮化的真正原因需要進(jìn)一步研究。

[1] Dill A,Jung H S,Sun T P.The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA[J].PNAS,2001,98(64):14162-14167.

[2] 王月華,韓烈保,曾會明,等.植物赤霉素矮化突變體研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2006,26(8): 22-27.

[3] Peng J R,Richards D E,Hartley N M,etal.Green revolution genes encode mutant gibberellin response modulators[J].Nature,1999,400(6741):256-261.

[4] Chen L,Ha L G,Anthony G C,etal.Exogenous GA3application can compensate the morphogenetic effects of the GA-responsive dwarfing geneRht12 in bread wheat[J].PLoS One,2014,9(1):1-11.

[5] Duan Z B,Shen C C,Li Q Y,etal.Identification of a novel male sterile wheat mutantdmsconferring dwarf status and multi-pistils [J].Journal of Integrative Agriculture,2015,14(9):1706-1714.

[6] 郭保宏.小麥矮稈遺傳型對赤霉酸反應(yīng)的初步研究[J].作物品種資源,1989(3):13-15.

[7] Roder M S,Korzun V,Wendehake K,etal.A microsatellite map of wheat[J].Genetics,1998,149(4):2007-2023.

[8] Tang Y,Wang L,Ma C,etal.The use of HPLC in determination of endogenous hormones in anthers of bitter melon[J].Journal of Life Sciences,2011,5(2):139-142.

[9] Pan X Q,Ruth W,Wang X M.Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Nature Protocols,2010,5(6):986-992.

Relationship between Plant Height and GA Metabolism indmsMutant in Wheat

YU Dongyan,ZHU Xinxin,LI Qiaoyun,JIANG Yumei,NIU Jishan*

(National Engineering Research Center for Wheat/Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to explore the relationship between stem development and gibberellin metabolism indmsmutant in wheat,GA contents in the upper internodes ofdmswere determined by HPLC,the plant heights were measured after application of exogenous GA3in field; the length of coleoptiles and the first leaves were measured after application of exogenous GA3on the seeds ofdmsmutant and Zhoumai 18 in lab.The result showed that the sensitive period and concentration of dwarf(D),middle(M) and tall(T) plants to GA3were different.In general,the sensibility of T plants to GA3was the highest,followed by M and D plants.The lengths of the first leaves of Zhoumai 18 and T plants increased significantly after application of 200 μmol/L GA3,whereas there was no significant difference for M plants at any GA3concentration compared with control.The coleoptile length of Zhoumai 18 increased significantly after application of 100 μmol/L GA3,however,there was no significant difference for T and M plants at any GA3concentrations.The data of D plants were failed to get due to low seed vigour and abnormal development,which might be the consequence of poor GA3sensibility.The GA3content in the D,M,T plants ofdmsmutant fluctuated.Combined with the field experiment,it showed that the time when D plants were sensitive to exogenous GA3was exactly the period when its GA3content dropped to the lowest,whereas when D plant had a higher GA3concentration,it became insensitive to exogenous GA3.Thus,D plants ofdmsmutant could not be simply categorized as a GA biosynthesis deficient mutant or a GA insensitive mutant.

wheat;dmsmutant; dwarf; gibberellin

2015-11-24

國家“863”項目(2012AA101105)；國家自然科學(xué)基金項目(31571646)

于東艷(1991-)，女，河南信陽人，在讀碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。E-mail：1039387135@qq.com

*通訊作者：牛吉山(1965-)，男，山西陽城人，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：jsniu@263.net

S512.1

A

1004-3268(2016)05-0018-05