羅非魚腐皮病病原菌分離鑒定及其對中草藥敏感性試驗

高桂生，張艷英，高光平，史秋梅*，李星燦，韓紅升，黃曉媛，繳寶豐，宋青春

(1.河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島066600； 2.秦皇島糧豐海洋生態(tài)科技股份有限公司，河北 秦皇島066600； 3.河北皓海生物科技有限公司，河北 秦皇島066004)

羅非魚腐皮病病原菌分離鑒定及其對中草藥敏感性試驗

高桂生1，張艷英1，高光平1，史秋梅1*，李星燦1，韓紅升2，黃曉媛2，繳寶豐2，宋青春3

(1.河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島066600； 2.秦皇島糧豐海洋生態(tài)科技股份有限公司，河北 秦皇島066600； 3.河北皓海生物科技有限公司，河北 秦皇島066004)

為了研究羅非魚腐皮病的防治方法，通過形態(tài)學觀察、生化特性等鑒定方法，從患腐皮病的羅非魚體內分離到1株溫和氣單胞菌，并進行致病性試驗和中草藥藥敏試驗。致病性試驗結果顯示，分離細菌對羅非魚有較強的致病作用。中草藥藥敏試驗結果顯示：五倍子、烏梅、沙棘、蘇木4種單味中草藥對分離細菌有較強的抑菌作用，石榴皮次之，陳皮、石菖蒲、魚腥草、馬齒莧、穿心蓮、桉樹葉、薄荷等無抑菌作用，且五倍子+烏梅的組方抑菌效果最強。

羅非魚； 腐皮病； 溫和氣單胞菌； 分離鑒定； 中草藥

腐皮病是淡水魚類嚴重的細菌性疾病之一[1-2]，孫其煥等[3]報道了尼羅羅非魚的潰爛病和腐皮病，唐士良等[4]發(fā)現了鰱、鳙魚的腐皮病。魚類的潰爛病和潰瘍病主要是淡水、海水和冷水性魚類的體表發(fā)生潰瘍，潰瘍多數發(fā)生在體表局部某些特定的部位，如發(fā)生在魚體的頭部、魚體背鰭和腹鰭以后的軀干部分、背鰭兩側等。有些病例無特定發(fā)生部位，潰瘍在多個部位均可發(fā)生，有的是全身性體表大面積的潰瘍。其病原主要有氣單胞菌、弧菌、愛德華氏菌、假單胞菌等。這些致病菌中多數為條件致病菌，有單一菌致病，也有多種菌混合感染。目前，對腐皮病的防控和治療主要依賴傳統(tǒng)的化學消毒劑、抗生素，但長期使用這些藥物，會使致病菌的耐藥性不斷增強。用中草藥替代抗生素是水產疾病防治的發(fā)展趨勢[5-6]，為此，本試驗分離鑒定羅非魚腐皮病病原菌，并進行中草藥敏感性試驗，旨在尋求健康綠色的藥物來治療腐皮病，以期為魚類細菌性疾病防治提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 病料來源

病料取自昌黎縣某養(yǎng)殖場因腐皮病瀕臨死亡的羅非魚?；疾◆~體質量170～210 g，體長13～17 cm。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

ID 32 E腸桿菌科細菌鑒定試紙條購自北京威泰科生物技術有限公司，革蘭氏染色試劑購自海博生物技術有限公司，普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯購自北京路橋技術股份有限公司，5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基自制，藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司，自動化微生物鑒定生化試劑盒購自北京威泰科生物技術有限公司。陳皮、馬齒莧、石菖蒲、穿心蓮、魚腥草、烏梅、蘇木、五倍子、薄荷、沙棘、桉樹葉、石榴皮等12種中草藥購自秦皇島百草堂大藥房。

1.3 儀器設備

雙人單面凈化工作臺SW-CJ-2FD由蘇州凈化設備有限公司生產，電熱恒溫培養(yǎng)箱 HPX-9162MB由上海博迅實業(yè)有限公司生產，自動化微生物鑒定系統(tǒng)由北京威泰科生物技術有限公司生產。

1.4 細菌分離培養(yǎng)

人工處死瀕臨死亡的羅非魚后，用清水沖洗干凈，用乙醇消毒體表。以無菌操作剖開魚體，從肝、脾、腸病灶處取病原菌，再用無菌接種環(huán)取樣劃線，分別接種到培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，并進行溶血試驗和染色鏡檢。

1.5 生化特性鑒定

對分離到的細菌進行純化培養(yǎng)，挑取單個優(yōu)勢菌落接種到培養(yǎng)皿中純化培養(yǎng)。無菌條件下取純化培養(yǎng)的單個菌落于3 mL 0.85% NaCl懸浮培養(yǎng)基中，制備濁度相當于0.5麥氏單位的菌懸液。用移液器取待鑒定的已混勻的菌懸液55 μL，加入到ID 32 E腸桿菌科細菌鑒定試紙條中的每個生化反應杯中，28 ℃培養(yǎng)14～24 h，在自動化微生物鑒定系統(tǒng)儀器上進行生化鑒定。

1.6 致病性試驗

取健康的羅非魚5尾(昌黎縣某養(yǎng)殖場提供)，其中1尾(編號5)作為對照組，其他4尾(編號為1—4)每尾注射含分離菌的肉湯0.3 mL(約含5.0×106cfu)。試驗期間正常投喂換水，觀察羅非魚的變化，記錄羅非魚的發(fā)病及死亡情況，取瀕死或發(fā)病的魚心、肝、腎等進行細菌分離鑒定。

1.7 中草藥藥敏試驗

用打孔法做藥敏試驗，進行3個重復。首先進行單味中草藥藥敏試驗，然后根據12種單味藥的藥敏試驗結果，挑選出排列前4位的中草藥再組方進行藥敏試驗。中草藥藥液的制備：先取陳皮、馬齒莧、石菖蒲、穿心蓮、魚腥草、烏梅、蘇木、五倍子、薄荷、沙棘、桉樹葉、石榴皮12種中草藥各100 g，分別用水浸泡1 h后，將500 mL蒸餾水加入100 g中草藥中，煎制30 min，待液體剩下100 mL時，過濾即得到質量濃度為1 g/mL的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆?。藥敏試驗：在超凈工作臺中，取適量細菌培養(yǎng)物涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上；用滅菌的不銹鋼小管在培養(yǎng)基上打孔(孔徑6 mm左右)，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分與平皿融合(以防藥液滲漏)；加入各單味中草藥藥液(藥液加至滿而不溢為止)。將平皿培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h后查看結果,單味中草藥及組方的抑菌直徑取平均值。判定標準：無抑菌圈為耐藥；抑菌圈7～10 mm為低度敏感；抑菌圈11～15 mm為中度敏感；抑菌圈≥16 mm為高度敏感。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及剖檢變化

羅非魚患腐皮病后游動緩慢，食欲減退，抵抗力下降，嚴重時停止攝食，魚體失去平衡。體表局部發(fā)炎，頭部、背部、腹部、尾柄、體側部分出現黃豆至蠶豆大小的紅斑，嚴重的表皮、肌肉潰爛，呈洞穴狀，有的露出骨骼和內臟，嚴重者有整個身體表皮爛掉，最后死亡。剖檢可見病魚臟器粘連,肝臟充血腫大，膽囊充盈，腸有大量黏液。

2.2 細菌分離培養(yǎng)結果

分離細菌于28 ℃培養(yǎng)24 h后，均生長出細菌菌落。菌落呈圓形，光滑濕潤，邊緣整齊，半透明，灰白色菌落(圖1)。菌落轉接到5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)12～24 h，呈β型溶血(圖2)。染色結果顯示，分離細菌為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓，有個別菌體稍彎曲(圖3)。

圖1 營養(yǎng)瓊脂上的分離細菌菌落

圖2 分離細菌在血液瓊脂上培養(yǎng)結果

圖3 分離細菌革蘭氏染色結果

2.3 分離細菌生化特性鑒定結果

由表1可知，分離細菌酯酶、精氨酸雙水解酶、d-海藻糖、d-麥芽糖、 β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖等試驗均為陽性，L-阿拉伯糖、d-甘露醇、丙二酸鹽、D-阿拉伯糖醇、L-天冬氨酸芳胺酶、 β-葡萄糖苷酶、鳥氨酸脫羧酶、5-酮基葡糖酸鹽、賴氨酸脫羧酶等試驗均為陰性。綜上，分離細菌培養(yǎng)特性和生化特性符合溫和氣單胞菌的特征。

表1 分離細菌主要生化特性鑒定結果

注：陽性為+，陰性為-。

2.4 分離細菌致病性試驗結果

將分離菌株接種到健康羅非魚體內，試驗魚感染后6 h表現為游動緩慢、不覓食，體表見潰瘍。感染后12 h內死亡率達60%，對照組未見異常，剖檢發(fā)現魚腹腔內有血樣腹水，肝臟有充血，發(fā)病癥狀與自然感染的羅非魚癥狀相似，在感染死亡的魚中分離菌株進行培養(yǎng)鑒定，有與注射菌株形態(tài)、生化一致的細菌，表明分離菌株是羅非魚體表腐爛病的病原菌。

2.5 分離細菌中草藥藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，五倍子、烏梅、沙棘、蘇木有較強的抑菌效果，石榴皮次之，陳皮、石菖蒲、魚腥草、馬齒莧、穿心蓮、桉樹葉、薄荷等無抑菌作用。根據12種單味藥的藥敏試驗結果，挑選出排列前4位的五倍子、烏梅、沙棘、蘇木組成組方1(五倍子、烏梅)、組方2(五倍子、沙棘)和組方3(五倍子、蘇木)，并進行藥敏試驗，結果顯示，組方1 抑菌效果最強(表2)。

表2 各單味中草藥和組方平均抑菌圈直徑 mm

3 結論與討論

羅非魚腐皮病是最常見的一種細菌性疾病，本研究從患腐皮病的羅非魚內臟分離到的細菌，經形態(tài)學和生化試驗鑒定為溫和氣單胞菌。致病試驗結果表明，分離菌有強的致病性。唐士良等[4]通過對鰱魚、鳙魚腐皮病的病原初步鑒定后，認為其與腐敗極毛桿菌相似；王肇贛等[7]將尼羅羅非魚腐皮病的病原鑒定為嗜水氣單胞菌嗜水亞種；蕭克宇等[1]、姚東瑞等[8]將泥鰍腐皮病、潰爛病的病原菌鑒定為溫和氣單胞菌。本研究結果與前人研究報道基本一致。

溫和氣單胞菌普遍存在于自然界中，世界各地均有分布[9]，感染譜廣，是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一,能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血動物如日本鰻鱺敗血腹水病、異育銀鯽溶血性腹水病、團頭魴、斑點叉尾回魚、泥鰍、羅非魚、鯉魚的出血性敗血癥等[10-15]。史秋梅等[16]報道了溫和氣單胞菌引起的鱉紅底板病、紅脖子病。溫和氣單胞菌屬條件致病菌,其主要致病原因是產生的各種溶血素和細胞毒素、腸毒素等多種毒素[17]，這些毒素具有多種生物學活性,一旦條件適宜，溫和氣單胞菌便大量繁殖,其毒素可引起生物體廣泛而復雜的病理變化。因此，在羅非魚集約化養(yǎng)殖過程中,尤其是越冬期間,控制水質和環(huán)境生態(tài)是防治該病的關鍵。本研究結果表明，溫和氣單胞菌對五倍子、烏梅、沙棘、蘇木4種單味中草藥及五倍子、烏梅組方敏感，發(fā)病時可以選擇敏感藥物及其組方進行治療。

[1] 蕭克宇，蔣武成，李年文，等.泥鰍腐皮病病原與防治的研究[J].湖南農學院學報，1992，18(S3)：706-712.

[2] 陳含華,鮑林才,陳明昌,等.甲魚瘡疹病和腐皮病的防治[J].內蒙古農業(yè)科技,2004(B12):198.

[3] 孫其煥，黃琪琰，蔡完其.尼羅羅非魚潰爛病的病原研究及防治[J].淡水漁業(yè)，1986(5)：9-12.

[4] 唐士良，柳傳吉，項文良.鰱、鳙腐皮病及其防治方法的初步研究[J].水產學報，1965，2(1)：33-52.

[5] 梁利國，邴旭文，張曉君，等.18種中草藥煎液對溫和氣單胞菌的抑、殺菌效果[J]．淡水漁業(yè)，2010，40(1)：66-69.

[6] 趙亮,趙瑞萍,李向陽,等.中草藥飼料添加劑在畜禽上應用研究進展[J].山西農業(yè)科學,2014,42(2):206-208.

[7] 王肇贛，徐伯亥.尼羅羅非魚腐皮病致病菌的研究[J].水產學報，1985，9(3)：217-221．

[8] 姚東瑞，邴旭文，朱明，等.泥鰍病原溫和氣單胞菌分子鑒定及耐藥性研究[J].海洋與湖沼，2010，4(5)：756-762.

[9] 董傳莆，林天龍，陳日升.日本鰻鱺敗血腹水病病原研究[J].水產科學，2002，21(1)：5-9.

[10] 孫其煥，孫佩芳，金麗華.異育銀鯽溶血性腹水病病原的研究[J].水產學報，1991，15(2)：130-139.

[11] 張滿隆，馮麗芝.武昌魚敗血癥及其防治[J].齊魯漁業(yè)，2003，20(4)：35-36.

[12] 蘇應兵，鄒桂偉，袁科平.斑點叉尾(魚回)暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè)，2006，36(5)：37-41.

[13] 蔡完其，孫佩芳.羅非魚溫和氣單胞菌病的病原研究和藥敏試驗[J].中國水產科學，2002，9(3)：243-246.

[14] 陳懷青，陸承平.家養(yǎng)鯉科魚暴發(fā)性傳染病的病原研究[J].南京農業(yè)大學學報，1991，13(4)：87-91．

[15] 劉敏，韓英.鯉魚溫和氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].東北農業(yè)大學學報，2005，36(4)：486-489.

[16] 史秋梅，湯生玲，高桂生，等.甲魚暴發(fā)性傳染病的病原分離及治療試驗[J].中國獸醫(yī)學報，1998，18(4)：346-348.

[17] 朱國炳，王永坤，葛頤昌.兩種氣單胞菌致病力的比較試驗[J].福建畜牧獸醫(yī),1997(5):8-9.

Isolation,Identification of Pathogenic Bacteria of Rotten Skin Disease inTilapiamossambicaand Sensitivity Test to Chinese Herbal Medicine

GAO Guisheng1,ZHANG Yanying1,GAO Guangping1,SHI Qiumei1*,LI Xingcan1,HAN Hongsheng2,HUANG Xiaoyuan2,JIAO Baofeng2,SONG Qingchun3

(1.Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hebei Province,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao 066600,China; 2.Qinhuangdao Liangfeng Haiyang Biologicag Co.,Ltd,Qinhuangdao 066600,China; 3.Hebei Hao Hai Biologicag Co.,Ltd,Qinhuangdao 066604,China)

To investigate the prevention and treatment method of rotten skin onTilapiamossambica,Aeromonassobriawas isolated fromTilapiamossambicawith rotten skin disease and determined by bacterial morphology observation and biochemical characteristics.Meanwhile,animal regression test demonstrated that it had a relatively strong pathogenicity.The result of sensitivity test to Chinese herbal medicine showed that allnut,dark plum,sea-buckthorn and sappan wood had a strong bacteriostasis,Pericarpium granati had taken second place；but pericarpium citri reticulatae,Acorustatarinowii,houttuynia cordata,purslane,Herbaandrographitis,eukalyptusblatter and herba menthae haplocalycis had no bacteriostasis.Among these Chinese herbal medicine,allnut and dark plum had the strongest bacteriostasis.

Tilapiamossambica; rotten skin;Aeromonassobria; isolation and identificatiaon; Chinese herbal medicine

2016-01-22

河北省科技廳獎勵性后補助項目(15926620H)；秦皇島市科技局科技支撐計劃項目(201401A067，201402B043)

高桂生(1964-)，男，河北玉田人，副教授，碩士，主要從事水產養(yǎng)殖動物疾病防治研究。 E-mail:ggs1964@163.com

*通訊作者：史秋梅(1965-)，女，河北樂亭人，教授，博士，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail:shiqiumei@126.com

S855.1

A

1004-3268(2016)05-0148-04