甜瓜再生體系研究進展

武云鵬　張若緯　彭冬秀　張秀婷

摘 ? ?要：20世紀70年代以來，以細胞工程和基因工程為主題的現代生物技術應用于作物品種改良，把育種技術從宏觀水平提高到微觀水平，為品種改良提供了一條全新途徑。在甜瓜品種改良過程中，建立高效的甜瓜再生體系是甜瓜細胞工程和基因工程中的關鍵性基礎工作。對甜瓜進行遺傳轉化研究首先要建立一套甜瓜的離體再生體系。文章綜述了甜瓜再生體系建立的過程中，外植體基因型、部位、生理年齡、培養(yǎng)基組成、激素種類和濃度等主要因素對植株再生的影響，分析了目前甜瓜再生體系在建立中存在的問題，并展望了再生體系技術的應用前景，旨在為甜瓜再生體系的研究提供理論依據。

關鍵詞：甜瓜;再生體系;外植體

Abstracts： Since 1970s， modern biotechnology with cell engineering and genetic engineering as its theme has been applied to crop variety improvement， raising breeding technology from macro level to micro level， providing a new way for variety improvement. In the process of variety improvement of melon， the establishment of efficient regeneration system is the key in melon cell engineering and genetic engineering. In order to study the genetic transformation of melon， we must first establish a set of in vitro regeneration system of melon. In this paper， the effects of main factors such as explant genotype， location， physiological age， medium composition， hormone type and concentration on plant regeneration in the process of establishing the regeneration system of melon were summarized， the existing problems in the establishment of the regeneration system of melon were analyzed， and the application prospect of the regeneration system technology was prospected， aiming to provide theoretical basis for the research of the regeneration system of melon.

Key words： Melon; Rregeneration system; Explants

甜瓜（Cucumis melo L.）甘甜如蜜，香味濃郁，營養(yǎng)豐富，是國際市場暢銷的十大水果之一。隨著人們生活水平的逐漸提高，人們對甜瓜品質的要求越來越高，因此，生產上急需豐產、優(yōu)質、特色甜瓜新品種，但由于常規(guī)育種周期長、工作量大且易受環(huán)境因素影響。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，運用生物技術進行種質創(chuàng)新已成為甜瓜育種的最新途徑。甜瓜遺傳轉化研究過程中，高效再生體系的建立是轉化成功的首要環(huán)節(jié)。目前，已有很多關于甜瓜離體再生的報道。筆者就甜瓜離體再生的途徑、影響因素及存在的問題和未來發(fā)展前景進行了展望，旨在為甜瓜離體培養(yǎng)再生體系的研究提供一定的理論指導依據[1]。

1 外植體基因型

Ficcadenti等[2-3]研究表明，基因型是影響甜瓜組織培養(yǎng)進而獲得再生體系的一個內部因素，不同的甜瓜品種基因型不同，其外植體獲得再生體系的能力也不同。蔡潤等[4]認為，不定芽的再生能力是受基因型控制，材料本身的基因型影響了其對外源激素誘導作用的敏感性，還可能存在基因型間的互補作用。甜瓜基因型各異[5-6]，不定芽的再生頻率也差異顯著。付秋實等[7]證實，薄皮甜瓜誘導率明顯高于厚皮甜瓜。陶興林等[8]研究認為，薄皮甜瓜‘甘甜一號再生能力強于厚皮甜瓜‘綠寶石。張慧君等[9]以純合自交系‘M1-15‘M1-16‘M1-19‘M1-23的子葉節(jié)為材料，研究表明，不同基因型甜瓜之間的再生頻率差異較大，其中‘M1-15 甜瓜自交系為最佳基因型。陶興林[10]等選用‘綠寶石‘西域1號‘白蘭瓜等6份厚皮甜瓜材料研究，表明以‘綠寶石的不定芽生頻率最高，‘西域1號次之，而‘白蘭瓜不定芽發(fā)生頻率最低。于喜艷等[11]以厚皮甜瓜‘狀元‘伊麗莎白，薄皮甜瓜‘新玉‘白玉的子葉為材料，研究表明，薄皮甜瓜的子葉組織培養(yǎng)再生能力明顯強于厚皮甜瓜。由此可見，基因型的選擇對甜瓜再生頻率影響較大，選擇適合組織培養(yǎng)的基因型是試驗順利進行的保障。

2 外植體部位

有研究報道表明，不同外植體之間的再生能力差異顯著，同一外植體不同部位的再生能力也有很大差異[12]。喬永旭[13]研究了‘鑫福999品種不定芽的誘導率高低順序為：子葉>真葉>下胚軸，并且下胚軸誘導出的愈傷組織玻璃化比例大。孔維萍等[14]研究認為，5～7 d苗齡的子葉近胚軸端具有較高的誘導率，而根尖不能誘導愈傷組織的形成。趙燕等[15]研究認為，以子葉作為外植體誘導愈傷組織，3～5 d后子葉即明顯增大增厚，為原來的2～3倍，同時發(fā)生卷曲，葉脈處顏色變淡;下胚軸形成愈傷組織的情況與子葉相似，只是時間略有后移，說明這2種外植體均為甜瓜誘導愈傷組織的良好材料。肖守華等[16]研究認為，莖尖和子葉切塊的不定芽誘導率均較高，而莖段、下胚軸、真葉誘導不定芽分化很低或根本誘導不出不定芽。馬國斌等[17]研究認為，未成熟子葉是甜瓜離體培養(yǎng)的最佳外植體，不僅再生能力強，不定芽分化率高，而且對培養(yǎng)基的適應性也較廣。毛娟等[18]以厚皮甜瓜‘黃河蜜3號近軸端、遠軸端子葉及下胚軸為外植體為試驗材料，研究發(fā)現，甜瓜外植體類型之間的分化水平差異很大，下胚軸和遠軸端子葉不能分化不定芽，而6 d苗齡的近軸端子葉膨大明顯，產生大量不定芽，芽體單獨成苗的數量較多。李曉慧等[19]以網紋甜瓜‘眾云-184 d苗齡的子葉近胚軸端、子葉遠胚軸端和下胚軸為試驗材料，結果表明，子葉近胚軸端誘導率最高，不定芽多發(fā)生在子葉與胚軸連接處;而子葉遠胚軸端為外植體子葉變黃老化，不定芽再生率較低;下胚軸為外植體，幾乎沒有不定芽的產生。由此可見，甜瓜再生以子葉近軸端為外植體較適宜。

3 外植體生理苗齡

甜瓜誘導不定芽過程中，外植體苗齡是重要影響因素之一，由于外植體生理年齡不同，愈傷組織的誘導率和生長速率有明顯的差別。賈卓男等[20]研究認為，取苗齡為5 d的‘頂峰3號甜瓜子葉為外植體，其不定芽的誘導率最高。杜姍姍等[21]研究認為，取苗齡為5 d的新疆甜瓜‘伽師子葉為外植體，其不定芽的誘導率最高。侯麗霞等[22]研究證實，取苗齡為4～6 d的‘魯薄1號（自交系）甜瓜子葉柄為外植體，不定芽分化率最高，其他苗齡無菌苗的子葉柄分化率較低。施先鋒等[23]報道，在相同的誘導培養(yǎng)基中，4 d苗齡的子葉誘導不定芽數目最多，7 d苗齡的子葉誘導不定芽數目最少。田芳等[24]取‘黃旦子甜瓜子葉為外植體，研究不同日齡子葉對不定芽誘導率的影響，其中2～8 d的子葉基部均能誘導出不定芽，而2 d的子葉誘導率最高，達到了80%;隨著日齡的增加，誘導率逐漸降低，第10天時的子葉則完全不能誘導產生不定芽，因此確定2 d齡時由黃變綠的子葉為最佳外植體。池慧芳等[25]研究認為，以甜瓜品種‘紅城7號為試驗材料，種子消毒后接種于MS培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3 d后，取子葉為外植體，接種到誘導培養(yǎng)基上，外植體不定芽分化率最高。

4 培養(yǎng)基類型

在甜瓜組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的選擇是影響外植體誘導的關鍵因素之一。甜瓜組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，部分學者運用BM3、Miller等培養(yǎng)基。王愛玲等[26]研究表明，以甜瓜‘紅心脆和‘早皇后子葉為外植體，在1/2 MS培養(yǎng)基中均適宜生根，根粗壯且分枝多，繁殖數較高。黃丹楓等[27]以網紋甜瓜‘夏七號無菌苗的子葉、胚軸為試驗材料，接種于改良MS培養(yǎng)基（用N6的大量元素代替MS的大量元素）上，其愈傷組織誘導率分化率均為最高。張鐵剛等[28]以厚皮甜瓜‘皇后為試驗材料，將無菌苗接種于MSB（MS鹽溶液和B5培養(yǎng)基的有機成分）培養(yǎng)基中，其叢生芽誘導率最高，達86%。盛慧等[29]以‘哈研3號薄皮甜瓜為試驗材料研究發(fā)現，外植體在含有Agar 1.0%的1/2MS培養(yǎng)基中生根率最高。王建設等[30]認為，‘伊麗莎白子葉在BM3（MS鹽溶液、3 g·L-1蔗糖、100 mg·L-1肌醇、1 mg·L-1維生素B1）培養(yǎng)基中不定芽誘導率最高。丁海濤等[31]研究認為，在Miller培養(yǎng)基中，‘伽師瓜子葉誘導率為40%～60%之間，而再生苗的誘導率最高，為90%。孫蘭英等[32]認為，當植株根系發(fā)達后，進行移栽，移栽前進行馴化處理可提高成活率，移栽前將再生苗轉移至蛭石培養(yǎng)基上，可促進葉片伸展、根系生長，且移栽時不易傷根，縮短了緩苗時間，從而大大提高成活率。在組織培養(yǎng)過程中，由于不同基因型、不同外植體之間的內源激素種類和濃度不盡相同，因此，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的選擇，是甜瓜再生體系順利建立的前提。

5 生長調節(jié)劑的種類及濃度

植物生長調節(jié)劑種類及濃度是影響外植體分化的重要因素之一，由于不同品種甜瓜的基因型存在差異，不同甜瓜品種的外植體在含有不同種類和濃度生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中的誘導率不盡相同。王建設等[30]研究認為，以伊麗莎白子葉為外植體，接種于MB3+IAA1.5 mg·L-1+KT6.0 mg·L-1+CuSO4·5H2O 1.0 mg·L-1誘導培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導率最高。丁海濤等[31]將成熟甜瓜種子無菌苗的子葉接種于含有Miller+6-BA 5.0 mg·L-1+ZT 0.01 mg·L-1+3%蔗糖的培養(yǎng)基中，其子葉愈傷組織誘導率最高。付秋實等[33]將薄皮甜瓜‘IVF05子葉接種于誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ABA 0.5 mg·L-1中，在此培養(yǎng)基上產生的愈傷組織比較少，能正常分化的不定芽較多并明顯伸長，不定芽生長較快。王愛玲等[34]研究認為，誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1和MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1，最有利于甜瓜‘黃醉仙下胚軸誘導愈傷組織。田芳等[24]研究認為，以‘黃旦子為試驗材料研究發(fā)現，苗齡為2 d的子葉接種于MS+6-BA 1.2 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1誘導培養(yǎng)基中，其不定芽誘導率最高。池慧芳等[25]將3 d苗齡的‘紅城7號子葉接種于含有MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中，其子葉愈傷組織誘導率最高。張競秋等[35]研究認為，取5～7 d苗齡的‘河套蜜瓜子葉為外植體，接種于MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導率最高。張鐵剛等[28]研究認為，以新疆甜瓜‘皇后子葉為外植體，接種于MS+6-BA 1.0 mg·L-1誘導培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導率最高。褚麗敏等[36]研究表明，網紋甜瓜‘頂峰3號試管苗在MS+6-BA 0.4 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基中最適合增殖培養(yǎng)，發(fā)現影響玻璃苗形成的主要因素是6-BA濃度，相對不同濃度的IBA影響較少，從誘導率、生長勢及玻璃化現象的發(fā)生等綜合因子分析，1 L培養(yǎng)基添加0.2～0.4 mg BA、0.05 mg IBA較為適宜。Baruch Leshem等[37]研究發(fā)現，在以子葉為外植體，研究根系再生過程中，加入鈣離子拮抗劑Nifedipin（硝苯地平）總是能抑制根系的生長，研究表明，鈣離子在根系生長發(fā)育過程中起著至關重要的作用。R.C. Yadav等[38]研究證實，將甜瓜子葉接種于MS+6-BA 0.05 mg·L-1（瓊脂糖含量0.8%）培養(yǎng)基中，有利于不定芽的生長和伸長，而最適合生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.01 mg·L-1（瓊脂糖含量0.8%）。Yan Zhao等[39]研究表明，適合子葉誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1，最適生根培養(yǎng)基為MS+ZT 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1。

6 問題和展望

隨著科學技術的發(fā)展和組培條件的改善，甜瓜離體組織培養(yǎng)技術更多的應用于新品種改良和生物育種等方面。經過近幾十年的發(fā)展，甜瓜離體組織培養(yǎng)和再生體系的研究已取得了很大進展[39]，但仍有一些問題急需解決。雖然甜瓜組織培養(yǎng)已經取得很大進展，但是試驗只能在實驗室進行，和常規(guī)營養(yǎng)體繁殖相比成本高，難以實現工廠化育苗，因此在甜瓜組織培養(yǎng)過程中，基因型、外植體、生長調節(jié)劑的選擇和控制方面還有待進一步研究，以提高甜瓜再生苗繁殖系數并降低繁殖成本。不同基因型甜瓜再生差異較大，今后工作應擴大試驗材料和生長調節(jié)劑的濃度范圍，找到適合甜瓜品種再生的通用生長調節(jié)劑的濃度范圍;在甜瓜組織培養(yǎng)過程中，外植體的選擇是甜瓜再生的關鍵因素之一，前人[9，11，23]研究表明，以甜瓜子葉為外植體，其愈傷組織誘導和不定芽分化率最高，而胚軸分化能力較低，因此，今后的工作應改善試驗條件，摸索一套適合甜瓜胚軸繁殖的再生體系。還應該把甜瓜組織培養(yǎng)與細胞工程、基因工程有機結合，以求縮短育種年限，創(chuàng)造出更多的有價值的種植資源，并應用于品種改良中。在今后的甜瓜再生體系建立的過程中，應制定一套適應性廣的試驗手冊，包含不同種類和濃度的生長調節(jié)劑水平，培養(yǎng)基的配方等，力求提高不同基因型甜瓜外植體的再生能力。

近幾年來，隨著基因工程和分子生物學的深入發(fā)展，更多的科技推動著組織培養(yǎng)技術的向前發(fā)展，甜瓜離體再生體系會不斷完善[1]。運用甜瓜組織培養(yǎng)等先進技術手段進行種質創(chuàng)新，進而實現甜瓜品質改良，已經成為甜瓜遺傳育種研究的新途徑，也為進一步進行甜瓜轉基因等方面的研究提供技術保障。高效的甜瓜離體再生體系將在未來育種工作方面有著廣闊的應用前景[40]。

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