卡泊芬凈對糞腸球菌生物膜形成能力影響的初步研究

白 冰，林志偉，徐廣健，孫 翔，陳俊文，涂浩鵬，李多云，余治健，鄧啟文，鄭金鑫

(深圳大學(xué)附屬深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院 深圳市內(nèi)源性感染診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518052)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是導(dǎo)致泌尿道、血流、腹腔內(nèi)、盆腔內(nèi)，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)等感染的常見醫(yī)院感染致病菌之一。研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌可以在輸尿管支架、血管內(nèi)導(dǎo)管、膽道支架、硅膠胃造瘺裝置等表面形成生物膜。近年來研究[4-5]顯示，本地區(qū)糞腸球菌生物膜陽性率超過80%，泌尿系統(tǒng)糞腸球菌生物膜形成尤其嚴(yán)重。在本單位臨床診療過程中亦發(fā)現(xiàn)許多治療困難的糞腸球菌感染病例，提示生物膜形成是導(dǎo)致糞腸球菌反復(fù)慢性感染的一個重要因素。目前，臨床常用于糞腸球菌感染治療的藥物，如氨芐西林、萬古霉素和利奈唑胺，對糞腸球菌生物膜感染治療作用均不理想[6-8]。文獻(xiàn)[9]報道，卡泊芬凈對金黃色葡萄球生物膜具有較好的抑制效果。糞腸球菌生物膜形成比例更高，治療難度更大，卡泊芬凈在糞腸球菌生物膜形成中的作用尚未見報道。為了解卡泊芬凈對糞腸球菌生物膜形成的作用，篩選來源于臨床具有不同生物膜形成能力的菌株，初步探討卡泊芬凈對糞腸球菌生物膜形成的影響。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 在本院前期工作基礎(chǔ)上篩選生物膜強(qiáng)陽性糞腸球菌菌株(16C1)及不同生物膜形成能力的糞腸球菌菌株10株(16C289、16C67、16C83、16C106、16C173、16C25、16C56、16C205、16C8、16C51)[4-5]，菌株均保存于深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院微生物室。

1.2 儀器與試劑 Phoenix100TM自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(美國BD公司)，酶標(biāo)儀購自法國生物梅里埃公司，CTCA培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，卡泊芬凈購自MCE中國，結(jié)晶紫購自上海斯信科技有限公司，草酸銨購自海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 菌株均參照第3版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，運(yùn)用CATC腸球菌選擇培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，并采用美國BD Phoenix100TM自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)再次鑒定。

1.4 檢測卡泊芬凈對糞腸球菌浮游菌生長作用的影響 通過酶標(biāo)儀測定600 nm波長吸光度(OD 600 nm)吸光值，以檢測培養(yǎng)上清液中浮游菌含量。

1.5 糞腸球菌生物膜量的檢測 按照參考文獻(xiàn)方法[10]，通過體外96孔板法構(gòu)建糞腸球菌生物膜感染模型,采用結(jié)晶紫染色法檢測生物膜量的變化，重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔，取平均值為最終檢測結(jié)果。操作步驟簡述如下：將糞腸球菌株接種于TSB培養(yǎng)基，振搖過夜，用TSBG培養(yǎng)基(TSB含0.25%葡萄糖)1∶200稀釋后加入96孔培養(yǎng)板(Costar3599板，200 μL/孔)，加入含不同藥物的新鮮TSBG培養(yǎng)基(同時設(shè)卡泊芬凈干預(yù)組和對照組，干預(yù)組加卡泊芬凈，濃度為20 μmol/L，對照組加生理鹽水)，37 ℃靜置分別培養(yǎng)24、48和72 h后，分離培養(yǎng)上清，PBS洗培養(yǎng)板3次，1%的結(jié)晶紫染色20 min，ddH2O緩慢沖洗去掉未結(jié)合結(jié)晶紫，通過酶標(biāo)儀OD570吸光值檢測生物膜的量，比較生物膜變化情況，同時通過酶標(biāo)儀OD600吸光值檢測浮游菌含量，對培養(yǎng)上清液中的浮游菌生長進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組計(jì)量資料的差別比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料差別比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌菌株信息 納入糞腸球菌11株，均為臨床分離菌株，其中5株分離自尿(16C289、16C25、16C56、16C8、16C51)，2株分離自傷口分泌物(16C67、16C205)，其余4株分別分離自血(16C106)、胸腔積液(16C1)、膽汁(16C173)和痰(16C83)。

2.2 卡泊芬凈對生物膜強(qiáng)陽性糞腸球菌(16C1)生物膜形成的影響 選擇1株生物膜強(qiáng)陽性臨床菌株(16C1)作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)株，同時設(shè)卡泊芬凈干預(yù)組和對照組，干預(yù)組加卡泊芬凈，濃度為20 μmol/L，對照組加生理鹽水。浮游菌抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，卡泊芬凈對16C1菌株的浮游菌生長無明顯影響(圖1A)，對16C1菌株的生物膜形成有抑制作用(圖1B、C)。

2.3 卡泊芬凈對10株生物膜陽性的糞腸球菌生物膜形成的影響 為進(jìn)一步證實(shí)卡泊芬凈對糞腸生物膜形成能力的作用，收集來源于臨床生物膜形成能力不同的10株糞腸球菌，研究卡泊芬凈對糞腸球菌生物膜形成和浮游菌生長的影響，結(jié)果顯示，卡泊芬凈對10株糞腸球菌臨床株的浮游菌生長無明顯影響(見圖2A)，但可明顯抑制菌株形成生物膜(見圖2B和圖3)。

A：通過酶標(biāo)儀OD600 吸光值檢測培養(yǎng)上清液中的浮游菌生長情況，卡泊芬凈對菌株生長無影響；B：采用結(jié)晶紫染色法，通過酶標(biāo)儀OD570 吸光值，比較生物膜變化情況，結(jié)果顯示，卡泊芬凈對菌株形成的強(qiáng)陽性生物膜有顯著的抑制作用；*: 卡泊芬凈干預(yù)組 vs 對照組，P<0.05(student’s t檢驗(yàn))；C：生物膜結(jié)晶紫染色的原始結(jié)果，結(jié)晶紫染色越深表示生物膜越強(qiáng)

圖1 卡泊芬凈對糞腸球菌16C1株浮游菌生長及生物膜形成的影響

Figure 1 Effect of caspofungin on growth of planktonic and biofilm bacteria ofE.faecalis16C1 strain

A：通過酶標(biāo)儀測OD600 吸光值，檢測培養(yǎng)上清液中的浮游菌生長情況，卡泊芬凈對菌株生長無影響；B：采用結(jié)晶紫染色法，通過酶標(biāo)儀測OD570 吸光值比較生物膜的量，結(jié)果顯示卡泊芬凈對菌株形成生物膜有明顯的抑制作用； *: 干預(yù)組 vs 對照組，P<0.05(student’s t檢驗(yàn))

圖2 卡泊芬凈對10株糞腸球菌臨床株浮游菌生長及生物膜形成的影響

Figure 2 Effect of caspofungin on growth of planktonic and biofilm bacteria of 10 clinicalE.faecalisstrains

每株菌設(shè)3個復(fù)孔，a、c、e、g為對照組，b、d、f、h為卡泊芬凈干預(yù)組；a1～a3、b1～b3為16C289株，a4～a6、b4～b6為16C173株，a7～a9、b7～b9為16C8株，c1～c3、d1～d3為16C67株，c4～c6、d4～d6為16C25株，c7～c9、d7～d9為16C51株，e1～e3、f1～f3為16C83株，e4～e6、f4～f6為16C56株，g1～g3、h1～h3為16C106株，g4～g6、h4～h6為16C205株； 生物膜結(jié)晶紫染色越深，表示生物膜越強(qiáng)

圖3 采用結(jié)晶紫染色法檢測10株糞腸球菌臨床株生物膜量的變化

Figure 3 Detection of biofilm quantity of 10 clinicalE.faecalisstrains by crystal violet staining

3 討論

細(xì)菌生物膜通常由多糖、蛋白質(zhì)和核酸組成，將細(xì)菌包裹在內(nèi)。生物膜中細(xì)菌常處于休眠狀態(tài)，抗菌藥物往往難以穿透作用于細(xì)菌，導(dǎo)致臨床常用抗菌藥物對生物膜治療效果普遍較差[11]。臨床常用于抗糞腸球菌感染治療的藥物，如氨芐西林、萬古霉素和利奈唑胺等均對清除糞腸球菌生物膜效果不理想，探尋生物膜治療有效藥物和策略仍然是臨床面臨的難點(diǎn)問題之一[12]。目前，針對糞腸球菌生物膜的治療可供選擇的方案主要集中在以下方向：(1)以磷霉素為基礎(chǔ)聯(lián)合其他藥物，特別是聯(lián)合利福平，治療腸球菌生物膜感染可有一定療效，但僅有部分清除生物膜效果，而且對強(qiáng)陽性生物膜仍無明顯清除效果[13-14]。(2)以達(dá)托霉素或利奈唑胺為基礎(chǔ)，聯(lián)合利福平或慶大霉素可對部分菌株形成的生物膜感染有一定治療作用，但對較強(qiáng)生物膜感染仍無法取得滿意療效[15]。

卡泊芬凈是一種新型多肽類抗真菌藥,作用靶點(diǎn)為真菌細(xì)胞壁?？ú捶覂敉ㄟ^非競爭性抑制β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶阻止真菌細(xì)胞壁的β-(1,3)-D-葡聚糖合成, 破壞真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致細(xì)胞破裂、溶解, 起到抗真菌的作用。卡泊芬凈由于安全性高，不良反應(yīng)較少，目前，已被廣泛用于侵襲性真菌感染的治療，對假絲酵母菌和曲霉菌感染均具有良好的療效，同時研究證實(shí)其對真菌尤其是假絲酵母菌生物膜形成具有較好的抑制作用[16]。在白假絲酵母菌形成生物膜的動態(tài)過程中，卡泊芬凈可以抑制生物膜的形成，并顯著減少生物膜的彌散，因此，卡泊芬凈在抗真菌感染同時具有明顯的抗白假絲酵母菌生物膜的作用[17-18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈對光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌形成的生物膜也有治療作用。若將卡泊芬凈與其他藥物或化合物聯(lián)合使用還有協(xié)同抗白假絲酵母菌生物膜的作用，卡泊芬凈與植物防衛(wèi)素HsAFP1存在明顯的協(xié)同抗生物膜作用[19-20]。

深入研究發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈可以抑制和清除細(xì)菌生物膜。在金黃色葡萄球菌生物膜形成過程中，卡泊芬凈主要通過抑制金黃色葡萄球菌膜定位N-乙酰基葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性，抑制生物膜重要組分胞外多糖的生成，破壞生物膜結(jié)構(gòu)，穿透性升高，進(jìn)而顯著增強(qiáng)莫西沙星和德拉沙星對生物膜中細(xì)菌的殺菌效果[9]。金黃色葡萄球菌中膜定位N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶由icaA基因編碼。分析BLAST、DNAMAN等生物信息，對比金黃色葡萄球菌icaA基因序列(Genebank：NC_002662.1)與糞腸球菌OG1RF全基因序列 (Genebank：GCA_000172575.2)，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌中并不具有icaA基因，意味著卡泊芬凈對糞腸球菌生物膜的抑制與金黃色葡萄球菌有不同的機(jī)制，因此卡泊芬凈通過何種具體機(jī)制影響糞腸球菌生物膜的抑制作用仍有待進(jìn)一步研究。