CRISPR/Cas技術(shù)及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用

劉 忠 奇

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128；2中國種子集團(tuán)有限公司，北京100045）

基因編輯技術(shù)具有巨大的應(yīng)用價值。目前主要有類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）［1］、鋅指核酸酶（ZFN）［2］和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR Cas9和 CRISPR Cpf1）［3］三大基因編輯技術(shù)。由于基因組編輯技術(shù)克服了周期長、突破物種間生殖隔離限制及快速高效的優(yōu)勢而被科學(xué)界關(guān)注?；蚪M編輯技術(shù)可用于基因修復(fù)（Gene correction）、基因敲除 （Knock-out）和實現(xiàn)靶向（Targeted）插入目標(biāo)基因［4］。作為基因編輯技術(shù)的后起之秀，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其精準(zhǔn)性、高效性、低成本性和簡易性，而受到各界密切關(guān)注，而且在越來越多的研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。筆者擬介紹基因編輯CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理以及該系統(tǒng)在作物遺傳育種中的最新研究和應(yīng)用進(jìn)展，并就該項技術(shù)在植物遺傳育種應(yīng)用中的新思路及安全性提出新的方向。

1 CRISPR/Cas與ZFN、TALEN的作用機(jī)理及異同

目前應(yīng)用最廣泛的基因組編輯技術(shù)主要有ZFN（zinc finger nuclease）、TALEN（transcription activator-like effector nuclease）和 CRISPR/Cas，它們均能對植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)的替換、插入和定點敲除，其在作物重要性狀的遺傳改良和控制作物重要農(nóng)藝性狀基因的功能鑒定領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

ZFN技術(shù)是最早興起的第1代基因組編輯技術(shù)。ZFN是由一系列位點特異性的融合蛋白組成，主要包含鋅指蛋白的DNA結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域［5］。將鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合形成核酸內(nèi)切酶，利用它可以在各種復(fù)雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。但ZFN存在設(shè)計鋒指核酸酶耗時耗力、鋅指核酸酶上下游效應(yīng)等導(dǎo)致脫靶效應(yīng)、ZFN本身的細(xì)胞毒性等缺陷，制約了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。

TALEN是一種毒性蛋白，由黃單胞桿菌（屬植物病原菌）通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)釋放到宿主細(xì)胞中通過模擬真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子對宿主細(xì)胞實現(xiàn)重編程［6］。TALEN與ZFN類似，其原理一樣，均由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合而成。對每個新的目標(biāo)序列，兩種基因編輯技術(shù)都需要設(shè)計一個新的DNA長片段（500～1500堿基對）來合成相應(yīng)的目的蛋白。由于非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ形成二聚體才有內(nèi)切酶活性，ZFN和TALEN均需要合成兩個新的蛋白。綜上，上述兩種技術(shù)相對費時且效率低。

CRISPR/Cas是來源于細(xì)菌和古生菌抵抗病毒或外源質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)［7］，主要有3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。被廣泛應(yīng)用的主要是Ⅱ型系統(tǒng)，以 Cas蛋白（Cas9、Cpf1、C2c1和 C2c2）以及導(dǎo)向RNA（gRNA）為核心組份。主要依賴于核酸內(nèi)切酶在目標(biāo)位置產(chǎn)生雙鏈斷裂 （double strand breaks，DSBs），DSBs再通 過 非 同 源 末 端 連 接（NHEJ）和同源重組（HDR）兩種方式進(jìn)行修復(fù)。NHEJ在斷裂位點誘發(fā)堿基缺失或插入突變，故可針對不同靶位點設(shè)計不同單向?qū)NA（sgRNA）在特定的位點實現(xiàn)基因編輯，包括間隔序列的獲取、CRISPR/Cas系統(tǒng)的表達(dá)和CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源基因的干擾三個階段［8］。Cas9蛋白作為Ⅱ型系統(tǒng)的核心蛋白，具有加工產(chǎn)生 crRNA（CRISPR RNA）和切割外源核酸的功能，Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA（反式激活crRNA）三者共同作用即可對外源 DNA進(jìn)行靶向裂解［9～11］。CRISPR/Cas9對 DNA的靶向切割作用使其可以用來進(jìn)行基因組編輯。在特定的區(qū)域內(nèi)，CRISPR/Cas9可以同時編輯多個基因位點［12～17］。最近從氨基酸球菌屬中分離出的CRISPR/Cpf1（V-A）系統(tǒng)，在哺乳動物特定位點中的編輯效率更高［18］。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術(shù)，三者在編輯效率、特異性和設(shè)計上存在較大差異（表1）。

表1 三大基因編輯技術(shù)比較Table 1 Comparison of the differences between the threemajor gene editing technologies

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在植物基因功能研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)通過產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂激活植物內(nèi)源修復(fù)途徑（包括非同源粘性末端連接和同源重組修復(fù)）實現(xiàn)對靶位點的定點突變、缺失或者基因的插入與替換。

2.1 基因敲除

王芳權(quán)等［19］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻品種南粳9108中的Pi21基因進(jìn)行敲除，獲得78.57%的突變效率，且靶位點突變類型較多。Wang等［20］通過 CRISPR/Cas9技術(shù)敲掉了六倍體植物小麥的TaMLO基因，獲得了抗白粉病小麥新品系。Gao等［21］通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除煙草的2個基因NtPDS和NtPDR6，發(fā)現(xiàn)16.2%～20.3%的插入或缺失頻率。劉耀光實驗室開發(fā)的多靶點CRISPR/Cas9系統(tǒng)，更加有效地實現(xiàn)了多基因定點突變及大片段缺失，他們在水稻中編輯了46個目標(biāo)位點，平均突變率為85.4%，且大部分為雙等位和純合狀態(tài)［13］。

2.2 基因插入或替換

胡雪嬌等［22］采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)矮化水稻恢復(fù)系申繁17和申繁24獲得了較野生型矮25%的SD1突變體，以SD1基因為靶基因，構(gòu)建基因編輯載體CRISPR-SD1，T0代獲得了純合的sd1突變體，T1代株系中分離出了不含轉(zhuǎn)基因序列的植株。Fang等［23］通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)以大豆疫霉菌的RXLR效應(yīng)基因Avr4/6作為靶標(biāo)進(jìn)行編輯，導(dǎo)致Avr4/6基因被NPTII基因替換。

Feng等［24］采用CRISPR/Cas9技術(shù)對擬南芥和水稻3個容易觀察表型的基因（ROC5、SPP和YSA）進(jìn)行了編輯，結(jié)果顯示在T1代轉(zhuǎn)基因株系中，SPP突變效率為5%，ROC5和YSA突變效率高達(dá)26%～84%。Lu等［25］利用單堿基編輯系統(tǒng)APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A），首次實現(xiàn)了對水稻氮轉(zhuǎn)運蛋白家族NRT1.1B和 DELLA家族SLR1的堿基替換。Upadhyay等［26］成功地運用基因編輯技術(shù)在懸浮細(xì)胞中，多重的sgRNA定位兩個不同識別位點，將兩個小麥內(nèi)源基因Ta INOX和Ta PDS突變掉，突變率達(dá)到18%～22%。

以上均表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)（敲除、插入或替換）在植物T0代轉(zhuǎn)化中是高效的，很容易找到靶標(biāo)基因完成編輯的純合子，篩選得到純合的T0代突變株系。這些基因能夠穩(wěn)定地遺傳給T1代，且符合孟德爾分離規(guī)律。

2.3 候選基因功能預(yù)測

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對小麥Ta MLO進(jìn)行定向突變，在原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植物中的鑒定結(jié)果表明，突變只發(fā)生在 A基因組上［27］。Gao等［28］通過CRISPR/Cas9技術(shù)定點編輯產(chǎn)生ABP1的無效突變體abp1，并發(fā)現(xiàn)abp1不對外源的生長素表現(xiàn)抗性，故認(rèn)為ABP1不是擬南芥生長素信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵因子。Sun等［29］運用CRISPR/Cas9設(shè)計了一個攜帶Cas9，兩個gRNA和作為同源性修復(fù)模板的一個供體片段的質(zhì)粒，試圖通過質(zhì)粒轟擊，在水稻ALS基因中同時替代兩個氨基酸殘基（W548到L和S627到I），從再生苗中隨機(jī)選擇52株進(jìn)行分析，測序結(jié)果表明，所有分析的植物中都發(fā)生了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源性修復(fù)，獲得了純合的抗除草劑水稻植株。

Svitashev等［30］使用127 nt的單鏈 DNA寡核苷酸作為修復(fù)DNA模板并與Cas9-ALS-gRNA RNP復(fù)合物共同轟擊，在玉米乙酰乳酸合酶基因（ALS2）中直接將對應(yīng)于氨基酸位置165處的Pro的DNA序列編輯為Se（P165S），產(chǎn)生氯磺隆抗性玉米植株。從1個再生植株中檢測到編輯的ALS2等位基因的DNA序列分析證實了P165S修飾的存在以及與相應(yīng)修復(fù)模板相關(guān)的其他核苷酸變化。進(jìn)一步的分子分析和后代測試表明，T1植株對氯磺隆具有抗性，且后代符合孟德爾分離規(guī)律。Yin等［31］利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1系統(tǒng)分別敲除水稻OsEPFL9基因（EPFL9基因為氣孔發(fā)育的正調(diào)節(jié)因子），獲得的純合突變體水稻背軸葉表面上的氣孔密度顯著降低。Xu等［32］針對水稻除草劑抗性基因BEL設(shè)計3個不同gRNAs，分析發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)突變效率在2%～16%，表型分析顯示轉(zhuǎn)基因植株對除草劑苯達(dá)松敏感。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在植物分子育種中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有簡單易行、突變效率高、成本低、多靶點同時突變等優(yōu)越性，能有效地應(yīng)用于水稻的遺傳改良?，F(xiàn)在利用CRISPR/Cas9技術(shù)開展與產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性相關(guān)的研究已有大量報道。

在產(chǎn)量方面，王加峰等［33］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對調(diào)控水稻千粒重的基因TGW6定點編輯，T0代材料中該基因突變頻率約為90%，其中純合缺失突變率高達(dá)51%，T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。

Zhang等［34］利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小麥粒長和粒重調(diào)控基因Ta GASR7和穗密度調(diào)控基因Ta DEP1進(jìn)行定點編輯，獲得的Ta GASR7純合。Soyk等［35］采用 CRISPR/Cas9技術(shù)對番茄抗成花基因SP5G進(jìn)行定向編輯，突變體材料番茄開花及成熟時間提前約2周，且產(chǎn)量顯著增加。

在品質(zhì)方面，Tang等［36］利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因OsNramp5，顯著降低秈稻谷粒中的鎘含量，開發(fā)具有低Cd積累和無轉(zhuǎn)基因的新秈稻品系。中國水稻研究所［37］和東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所［38］同時采用CRISPR/Cas9技術(shù)對控制水稻香味的BADH2基因進(jìn)行敲除，結(jié)果表明突變體材料中香味物質(zhì)顯著增加。Ma等［13］利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變直鏈淀粉合成酶基因OsWaxy，突變體直鏈淀粉含量從14.6%下降至2.6%，獲得了糯性品質(zhì)。

在抗性方面，Li等［39］將 CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于編輯大豆的乙酰乳酸合成基因1（ALS1）并獲得了氯磺隆抗性基因。Wang等［20］通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲掉了六倍體植物小麥的Ta MLO基因，獲得了抗白粉病小麥新品系。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，利用NHEJ修復(fù)方式建立了基于CRISPR/Cas9的基因組定點插入及替換系統(tǒng)，在水稻內(nèi)源基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）中實現(xiàn)基因替換，頻率為2.0%，靶向基因插入，頻率為2.2%，所獲OsEPSPS基因的水稻對草甘膦具有抗性［40］。Liu等［41］利用CRISPR/Cas9基因修飾增強(qiáng)水稻抗稻瘟病能力，設(shè)計針對水稻OsERF922基因的CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922），從50個T0轉(zhuǎn)基因水稻中鑒定出21個C-ERF922誘導(dǎo)的突變體（突變率42.0%），獲得了6個抗稻瘟病株系。

在篩選不育系方面，主要利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對秈稻和粳稻品種的溫敏不育基因TMS5的野生型基因進(jìn)行突變，可快速培育出溫敏不育系。2016年，張大兵等利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯粳稻品種空育131內(nèi)源基因csa，獲得了粳型光敏核雄性不育系［40］。同年 11月，莊楚雄等利用 CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進(jìn)行特異性編輯，創(chuàng)制了一批溫敏核雄性不育系［41］。

4 CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶問題及應(yīng)對策略

CRISPR/Cas作為一種新型的應(yīng)用技術(shù)，雖然具有高效、廉價和易操作的優(yōu)勢，但是也有多變效應(yīng)，即脫靶問題。為了提高效率，越來越多的研究著眼于控制CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶突變。gRNA和同源序列中選擇具有最少的錯配位點和脫靶位點的目的位點［42～44］，有助于確保 CRISPR/Cas9的識別特異性。由于Cas9核酸酶在植物中有較高的編輯效率和特異性［45］，選擇合適的靶點顯得尤其重要，因此在農(nóng)作物中比較容易得到一個脫靶率非常低的純合突變體。有研究者將Cas9轉(zhuǎn)換成切口酶，同樣能夠幫助減少脫靶突變，確保CRISPR/Cas9定點切割的效率。CasOT是最近發(fā)明的一個靈活的選擇工具，能夠識別整個基因組中潛在的脫靶位點［44］。新型小核酸酶Cpf1是可代替Cas9的有效工具，具有更高的精確性和更簡便的操作性，能降低脫靶效應(yīng)。

5 展望

基因組編輯技術(shù)在植物育種的背景下進(jìn)行應(yīng)用，重點是開發(fā)新品種。優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)，創(chuàng)新新型基因組編輯育種技術(shù)，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的DNA-free剪切酶技術(shù)，有助于提高基因組編輯技術(shù)的精確性和高效率性。

此外，基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物在國際上尚沒有明確的定論，其監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)也存在爭議。所以加強(qiáng)基因編輯作物的監(jiān)管法規(guī)建設(shè)十分必要，應(yīng)組織科學(xué)界、管理者、產(chǎn)業(yè)界等共同研討，制定切實可行的法規(guī)，嚴(yán)格監(jiān)控其應(yīng)用范圍和程度，在符合安全標(biāo)準(zhǔn)的情況下發(fā)展基因組編輯育種技術(shù)。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯的作物可以不引入外源基因，得到純合的突變體，與天然植物基因突變一樣，具有穩(wěn)定的遺傳能力，隨著全基因組測序的完成和更多有利性狀或基因被發(fā)現(xiàn)，基因編輯技術(shù)必將在植物育種界對新種質(zhì)資源的創(chuàng)制和農(nóng)藝性狀的精準(zhǔn)改良產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。