煙草酶促棕色化反應(yīng)機理及其調(diào)控研究進展

楊 樹 勛

（甘肅省煙草公司隴南市公司，隴南746000）

酶促棕色化反應(yīng)是綠色植物細胞正常的生理生化反應(yīng)，在提高植物抗性、調(diào)節(jié)光合作用等方面發(fā)揮著積極的作用［1］。煙草酶促棕色化反應(yīng)是指煙葉在烘烤過程中，在氧化酶的作用下葉內(nèi)內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化，煙葉顏色由黃色逐漸變棕、變褐這一復雜的過程。煙草酶促棕色化反應(yīng)主要發(fā)生在煙葉變黃末期和定色期，由于葉內(nèi)氧化酶（主要是多酚氧化酶PPO）活性較強，煙葉含水率較高，葉內(nèi)含有較高的多酚類物質(zhì)，如咖啡酸、綠原酸、蕓香苷等，以及外界溫濕度條件適合，造成葉內(nèi)氧化還原平衡被打破，使細胞中的多酚類物質(zhì)被氧化而不能被還原，多酚類物質(zhì)被氧化成醌，醌聚合并與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，產(chǎn)生黑色素沉淀。隨著醌類物質(zhì)聚集，煙葉的基本黃色會逐漸喪失，呈現(xiàn)出不同程度的雜色，造成煙葉掛灰、蒸片、黑糟等；同時酶促棕色化反應(yīng)還會使煙葉葉片變薄，重量減輕，彈性變差，破碎度加大，燃燒力減弱，使煙葉的質(zhì)量下降。由于多酚類物質(zhì)是構(gòu)成煙葉品質(zhì)和香吃味的必備物質(zhì)，因此，酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生是造成煙葉質(zhì)量下降的重要原因之一。弄清酶促棕色化反應(yīng)機理及發(fā)生條件，對防止煙葉酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生，提高煙葉質(zhì)量具有重要意義。

1 煙草酶促棕色化反應(yīng)研究現(xiàn)狀

煙葉烘烤經(jīng)歷了陽光干燥階段、簡單加工階段、經(jīng)驗（簡單火管）烘烤階段、技術(shù)烘烤階段、科學烘烤階段五個階段［2］。自進入技術(shù)烘烤階段以來，人們對煙草酶促棕色化反應(yīng)的認識在逐漸深入。普遍認為：煙葉烘烤過程中，在變黃前期，由于煙葉細胞組織結(jié)構(gòu)完整，細胞中多酚氧化酶與咖啡酸、綠原酸、蕓香苷等多酚類作用底物各處于一定的區(qū)隔，二者不容易接觸［3］，而且此時細胞處于生命活動較旺盛狀態(tài)，既進行氧化作用又進行還原作用，氧化還原反應(yīng)能夠保持平衡，因此棕色化反應(yīng)不易發(fā)生。

在變黃后期及定色期，葉組織細胞逐漸死亡，細胞結(jié)構(gòu)開始自溶和解體，細胞膜透性增大，使多酚類物質(zhì)、氧氣可以自由進出細胞組織，多酚氧化酶、多酚類物質(zhì)、氧氣很容易接觸，多酚類物質(zhì)只能被氧化，很少被還原，使多酚類物質(zhì)被迅速氧化成醌類，醌類物質(zhì)積累和聚合成為深色物質(zhì)，同時造成煙葉質(zhì)量的下降，如下圖：

Akehurst研究表明［4］，綠原酸和蕓香苷是兩種影響煙葉等級較大的多酚類物質(zhì)，煙葉中多酚類物質(zhì)的含量與煙葉品質(zhì)和芳香吃味是一致的；烘烤過程中酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生，是造成烤后煙葉多酚類物質(zhì)含量低的主要原因。Johnson等人研究發(fā)現(xiàn)［5］，煙葉中多酚類物質(zhì)含量一般在 1.8% ～5.2%，一旦煙葉顏色完全變褐，多酚類物質(zhì)含量就會減少85%，煙葉的芳香吃味會因此而變差，雜氣加重。煙葉酶促棕色化反應(yīng)往往發(fā)生于變黃時間過長或定色太晚的情況下，此時除具有良好的氧化條件外，也與糖分消耗過度，使葡萄糖提供氫將醌還原的能力降低有關(guān)，導致醌類物質(zhì)積累，煙葉顏色變深。因此，煙草酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生既有內(nèi)部因素，也必須具備外部條件。

1.1 影響酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的內(nèi)部因素

酶促棕色化反應(yīng)受多種因素影響，是一個相當復雜的過程，煙葉自身素質(zhì)是酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的基礎(chǔ)。影響酶促棕色化反應(yīng)的內(nèi)在因子有：煙葉組織細胞結(jié)構(gòu)的破壞程度、煙葉組織的失水量、PPO活性。

（1）煙葉組織細胞結(jié)構(gòu)的破壞程度。在烘烤變黃過程中，隨著煙葉的呼吸作用，內(nèi)含物被大量消耗，葉內(nèi)不斷失水，細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，葉組織的生命活性趨于死亡（一般煙葉致死的環(huán)境溫度為50～52℃）［6］。細胞膜的選擇透性逐漸喪失，膜透性增大，原生質(zhì)結(jié)構(gòu)解體，將導致：一是原生質(zhì)大量外滲；二是氧自由進入葉組織；三是細胞內(nèi)各種物質(zhì)與酶混雜在一起；四是細胞內(nèi)糖分消耗過度，葡萄糖提供氫還原能力下降。從而使細胞正常的生理代謝功能喪失，生命活性降低，細胞中的氧化還原平衡被打破，從而導致酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生。

（2）煙葉組織的失水量。煙葉酶促棕色化反應(yīng)必須是在細胞尚處于有生命狀態(tài)下才能進行，而葉內(nèi)水分狀況決定著酶的活性強弱，因此，在變黃接近完成時，葉內(nèi)水分狀況是決定酶促棕色化反應(yīng)能否發(fā)生的必備條件。一般認為，變黃末期，煙葉失水量少于50%，就為酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，失水量大于50%，酶促棕色化反應(yīng)就很難發(fā)生［6～8］。

（3）PPO活性。PPO是一類普遍存在于植物、真菌和昆蟲質(zhì)體中，由核基因編碼，能與銅相結(jié)合的金屬蛋白酶［9］。它能分別催化單酚羥基和二羥基酚氧化為O-二酚和O-醌。PPO廣泛存在于植物體的各種器官或組織中，一般幼嫩部分含量較多，成熟部分含量較少。細胞化學和細胞免疫化學分析表明，PPO是一種質(zhì)體酶，存在于正常細胞的內(nèi)囊體的囊泡內(nèi)。植物PPO是許多果蔬等農(nóng)產(chǎn)品酶促褐變的主要原因。煙葉的酶促棕色化反應(yīng)是在PPO的催化作用下發(fā)生的。因此，PPO的活性及其在烘烤過程中的變化也就成為煙葉棕色化變褐與否的決定因素。在煙葉烘烤過程中，影響PPO活性的主要因素有環(huán)境溫度和水分。

生物酶都有其適應(yīng)的溫度范圍。一般情況下，溫度低時PPO活性低，隨著溫度的升高，PPO活性有升高的趨勢，但當超過一定的溫度時，隨著溫度的升高，PPO活性下降。溫度對PPO活性主要有兩個方面的影響：一方面，在適宜溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升或下降，酶活性降低；另一方面，活性酶的濃度下降。溫度對PPO活性的影響是兩個方面綜合作用的結(jié)果。戴亞等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PPO在溫度20～50℃范圍內(nèi)保持著較高的活力，并且其活性均在40℃左右時最高，在40℃以下PPO是相當穩(wěn)定的，但當溫度超過55℃時，易迅速鈍化失去活性。雷東鋒等［11］等研究煙草中 PPO在 35、40、45、50、55、60、65、70和75℃等烘烤溫度下的熱敏感性，發(fā)現(xiàn)35℃時PPO的活性最高，隨著溫度的升高，PPO活性逐漸降低。韓富根等［12］發(fā)現(xiàn)，在不同溫度下煙草PPO的活性或早或遲地都要出現(xiàn)一個高峰，溫度越高，活性上升越快，活性越強，酶活性持續(xù)的時間越短，反之亦然，當溫度在55℃以上時，就會迅速鈍化失去活性?？傊?，一般認為，烘烤的環(huán)境溫度不同，煙葉PPO活性強弱表現(xiàn)也不同，煙葉中PPO在35～40℃活性最高，穩(wěn)定性最好。

由于生物的生理生化反應(yīng)必須在溶膠狀態(tài)下進行，所以煙葉的水分狀況決定著其生命活動的強弱。當煙葉失水量超過50%時，細胞原生質(zhì)的粘性增大，限制了底物的流動性，PPO活性受到抑制。綜上，學界認為：PPO在溫度45～50℃、相對濕度60%以上時被活化，在溫度55℃、相對濕度60%以下時受到抑制。

1.2 影響酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的外部因素

在正常的烘烤過程中，酶促棕色化反應(yīng)是很少發(fā)生的，煙葉棕色化變褐的程度也極其微小，對煙葉質(zhì)量的影響效應(yīng)并不顯著。但是，當烘烤操作技術(shù)不當時，會誘導酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。哈斯勒（Hassler）研究發(fā)現(xiàn)［5］，在烘烤環(huán)境溫度低于 44℃時煙葉變褐速度極為緩慢，當升高到57℃時，僅6 min棕色化反應(yīng)過程就可全部完成。誘導煙葉酶促棕色化反應(yīng)的外部因素有兩個：一是烘烤溫度，二是烤房內(nèi)空氣的相對濕度。兩者共同影響煙葉含水量和葉內(nèi)多酚氧化酶的活性，從而制約酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。一般認為，當煙葉變黃后，如溫度超過44℃、環(huán)境相對濕度60%以上、煙葉失水量少于50%三個條件同時具備時，將導致酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生，否則酶促棕色反應(yīng)就不容易發(fā)生［7］。

1.3 對酶促棕色化反應(yīng)的調(diào)控

有學者認為［13］，可以從三個方面對酶促棕色化反應(yīng)進行調(diào)控。一是調(diào)控多酚類物質(zhì)的含量。通過品種選育、合理的農(nóng)業(yè)栽培措施、使用植物生長調(diào)節(jié)劑等，降低酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。有研究指出，烘烤前用抑制劑處理能使多酚含量達到人們所要求的范圍。二是調(diào)控多酚氧化酶的活性。通過調(diào)整烤房內(nèi)的氣體成分、熱處理、高壓、輻射和超聲處理等破壞酶促反應(yīng)賴以發(fā)生的生理生化環(huán)境，從而降低PPO的活性。韓富根等［12］通過試驗表明，酶促褐變最適宜的pH范圍在4～7，降低介質(zhì)中的pH，可以控制PPO的活性，抑制其催化作用。還可通過噴灑、浸泡化學抑制劑或者直接加入緩沖液等方法來抑制PPO的活性。肖厚榮等［14］研究表明，胱氨酸對煙草中的PPO有抑制作用，當胱氨酸與PPO的分子比達到16 000∶1時，PPO的活性被完全抑制。三是降低氧的濃度。降低烘烤環(huán)境中氧氣的濃度可有效減少棕色化反應(yīng)的發(fā)生。有研究指出，在烘烤過程中，當氧氣濃度在0.01%時，酶促褐變基本上不會發(fā)生；當氧氣濃度高于0.5%時，隨著氧氣濃度的增加，煙葉褐變程度逐漸加重［15］。

在生產(chǎn)上普遍認可的調(diào)控酶促棕色化反應(yīng)的方法是：在煙葉基本變黃后，控制好溫、濕度及煙葉含水量，在溫度45℃以前，失水超過50%，進入定色階段后，緩慢升溫，加快排濕，達到煙葉小卷筒，定色階段保持60%以下的相對濕度，及時鈍化和終止PPO活性，防止煙葉氧化變褐。

2 煙草酶促棕色化反應(yīng)研究中存在的問題

國內(nèi)外學者對煙草酶促棕色化反應(yīng)機理進行了一系列的研究，雖取得了一些成果，但對煙草酶促棕色化反應(yīng)的認識還不夠深入，對煙草酶促棕色化反沒有形成一個統(tǒng)一、完整的認識，也沒有找出酶促棕色化反應(yīng)的核心控制因子。主要存在以下問題：

一是對于發(fā)生煙草酶促棕色化反應(yīng)的條件以烤房內(nèi)溫度、相對濕度等外部條件為主，沒有揭示出煙草酶促棕色化反應(yīng)的核心要素。

二是對煙草PPO活性適宜溫度認識有差距。戴亞等［10］認為PPO在40℃左右活性最高，而雷東鋒等［11］認為煙草PPO在35℃時活性最高，但在此溫度范圍內(nèi)一般并不發(fā)生棕色化反應(yīng)。韓富根等［12］認為，當溫度在55℃以上時，PPO就會迅速鈍化失去活性。而哈斯勒［5］認為，當溫度升高到57℃時，僅6 min棕色化反應(yīng)過程就可全部完成。

三是在酶促棕色化反應(yīng)過程中對酶的氧化性研究較多，而忽視了酶的還原性。

四是煙葉組織細胞結(jié)構(gòu)破壞程度的問題。傳統(tǒng)認為煙葉組織致死的環(huán)境溫度為50～52℃，超過此溫度，煙葉組織生命趨于死亡，細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)。但當操作不當時，在50～52℃前酶促棕色化反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生。

五是在酶促棕色化反應(yīng)的調(diào)控方面，總結(jié)出了調(diào)控多酚類物質(zhì)的含量、PPO的活性、降低氧的濃度等多種方法，但這些方法在生產(chǎn)中實施難度大，有些方法還可能對煙葉質(zhì)量造成傷害。

六是對煙草酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生機理沒有一個系統(tǒng)的、能廣泛涵蓋內(nèi)、外條件的概述。

七是忽視了能量代謝的作用。煙草酶促棕色化反應(yīng)過程是一個可逆過程，在酚被氧化成醌的同時，醌也被還原成酚，從能量代謝的角度看還原反應(yīng)也需要吸收能量。

八是長期以來我國傳統(tǒng)煙草教科書中棕色化反應(yīng)化學式［3］不正確，醌的苯環(huán)上碳原子有五個共價鍵、氧原子有三個共價鍵。

3 煙草酶促棕色化反應(yīng)的科學原理初探

3.1 煙草酶促棕色化反應(yīng)的實質(zhì)

煙葉烘烤過程是煙葉葉片衰老死亡的過程［16］。在烘烤過程中，在葉片沒有變黃前，組織細胞結(jié)構(gòu)完整、能量充足、抗逆性好、生命活性較強，氧化還原作用保持平衡，即使烤房內(nèi)溫濕度較高，也不會發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)。隨著衰老的加深，細胞組織的抗逆功能、自我修復功能、還原功能衰退，提供還原反應(yīng)需要的能量衰減。在葉片變黃后（變黃后期及定色期），雖然葉片組織尚處于有生命狀態(tài)，但葉組織生命趨于、臨近死亡，生命活性較弱。同時葉片含水率較高，煙葉失水率不超過50%，細胞原生質(zhì)處于溶膠狀態(tài)下，底物具有流動性。如溫濕度控制不當，超出了葉組織細胞生命的極限溫度，葉組織細胞逐漸死亡，細胞結(jié)構(gòu)開始自溶和解體，細胞膜及內(nèi)囊體膜上的蛋白質(zhì)逐漸變性失活，膜的選擇透性逐漸喪失，底物與酶之間的區(qū)隔被破壞，膜透性增大，使多酚類物質(zhì)、活性氧、PPO很容易接觸。細胞組織酶的氧化活性與還原活性此消彼長，平衡被打破，酶的氧化活性占據(jù)優(yōu)勢，加之細胞內(nèi)糖分消耗過度，葡萄糖提供氫還原能力下降，還原反應(yīng)需要的能量衰竭，使氧化反應(yīng)與還原反應(yīng)平衡被打破，氧化反應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢。多酚類物質(zhì)只能被氧化，很少被還原，使多酚類物質(zhì)被迅速氧化成醌類，從而導致酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生，如下圖：

從外觀顏色看，酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生在煙葉變黃后；從內(nèi)部結(jié)構(gòu)看，酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生在煙葉細胞將死但未死，細胞生命處在生命活性較弱向死亡過度時期，膜的選擇透性逐漸喪失；從內(nèi)含物看，氧化反應(yīng)的底物充足而還原反應(yīng)的底物少；從酶的活性看，隨著細胞的衰老死亡，酶的還原活性下降快，酶的氧化還原活性平衡被打破；從能量代謝的角度看，隨著煙葉的衰老，細胞組織提供還原反應(yīng)所需能量的功能下降；從細胞抗逆力看，隨著細胞的衰老，生命活力的下降，細胞抗逆力下降，細胞組織的致死溫度下降，當濕煙葉組織溫度達到或超過38℃時（變黃后濕煙葉組織細胞致死溫度為38℃），細胞組織逐漸死亡，顏色變褐。

3.2 煙草酶促棕色化反應(yīng)的條件

雖然煙草酶促棕色化反應(yīng)機理非常復雜，調(diào)控因子多且各因子之間互相影響，但其發(fā)生煙草酶促棕色化反應(yīng)的核心要素是一致的。發(fā)生煙草酶促棕色化反應(yīng)必須具備以下三個條件：一是煙葉葉片變黃后，即發(fā)生在變黃后期、定色期；二是葉片失水率不超過50%，原生質(zhì)尚處于溶膠狀態(tài)；三是濕煙葉組織溫度超過38℃。只有達到以上三個條件，才會導致酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生。

3.3 煙草酶促棕色化反應(yīng)的調(diào)控

生產(chǎn)實踐證明，只要理清了煙草酶促棕色化反應(yīng)機理及關(guān)鍵控制因子，找出煙草酶促棕色化反應(yīng)的本質(zhì)，生產(chǎn)上防止酶促棕色化反應(yīng)這一矛盾就會迎刃而解?？傊?，在煙葉烘烤過程中只要控制好以下幾點就能防止酶促棕色化反應(yīng)的發(fā)生：在變黃期保持一定的失水速度，在變黃的同時使葉片的含水量保持在一個適宜的范圍內(nèi)并逐漸減少；煙葉變黃后加快失水，延長時間；在煙葉達到充分凋萎、主脈發(fā)軟（失水30%）前組織溫度不超過37℃；在定色期煙葉小卷筒（失水50%）前煙葉組織溫度不超過38℃；在煙葉烘烤過程中煙葉組織溫度與失水進程協(xié)調(diào)，水、溫同步。否則就可能發(fā)生棕色化反應(yīng)，使煙葉變褐，從而導致質(zhì)量下降。

4 展望

雖然前人對煙草酶促棕色化反應(yīng)機理及調(diào)控因子進行了大量研究，并取得了一定成就，但煙草酶促棕色化反應(yīng)中有許多問題尚不清楚，有待進一步研究完善。筆者認為，在研究煙草酶促棕色化反應(yīng)機理上，不但要從微觀上破解酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的成因，而且要用動態(tài)的、聯(lián)系的觀點從宏觀上加深對酶促棕色化反應(yīng)發(fā)生的認識與理解，分清主要矛盾和矛盾的主要方面及在其一定條件下相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律，找準酶促棕色化反應(yīng)的核心要素，才能抓住酶促棕色化反應(yīng)的實質(zhì)，更好地為優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)服務(wù)，使煙葉生產(chǎn)在我國的經(jīng)濟建設(shè)上發(fā)揮更大的作用。