桂北果蔗甘蔗桿狀病毒的分子檢測與分析

劉許輝，杜希夷，賈清云，莫星煜，毛鳳玲，黃 幸，邱巧玲，文愛忠

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院桂林分院/桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，桂林541006）

甘蔗桿狀病毒（Sugarcane bacilliform viruses，SCBV）屬于桿狀DNA病毒屬，是危害甘蔗的主要病毒之一，嚴重影響甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)［1］。在多數(shù)情況下，SCBV侵染后甘蔗葉部會出現(xiàn)褪綠斑塊、斑駁或各種長度的褪綠條紋，葉片皺縮，莖節(jié)間出現(xiàn)裂縫，植株束頂矮化，但是有些甘蔗品種在感染SCBV后，植株并無明顯癥狀［2，3］。目前，在世界 20多個國家和地區(qū)的甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了 SCBV侵染［2～4］，我國也陸續(xù)在廣東［5］、廣西［6］和云南［7］的甘蔗上檢測到SCVB。果蔗作為我國南方的優(yōu)勢經(jīng)濟作物，兼具豐富的營養(yǎng)和藥用價值［8］，是廣受人們喜愛的冬季時令水果。廣西是我國果蔗種植面積最大的省份，桂北種植面積約占廣西的10%［9］，果蔗產(chǎn)業(yè)對促進當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展有著重要的作用。由于果蔗品種單一，多年采用無性繁殖，易受甘蔗花葉?。╯ugarcane mosaic disease，SMD）、甘蔗黃葉?。╯ugarcane yellow leaf disease，SYLD）和宿根矮化病（ratoon stunting disease，RSD）等種苗傳播病害的危害［10～12］，而所引起的病害癥狀與 SCBV類似［13］，造成果蔗SCBV侵染情況易被忽視。很多文獻報道了糖蔗受SCBV侵染的情況，但針對果蔗的報道較少。本研究采集桂北地區(qū)種植的果蔗樣品進行PCR檢測分析，以為當(dāng)?shù)卣莆赵摬『Πl(fā)生情況及防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

采樣地點在桂林市陽朔縣福利鎮(zhèn)、臨桂區(qū)五通鎮(zhèn)、桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗示范基地。其中福利鎮(zhèn)采樣品種為未脫毒拔地拉，五通鎮(zhèn)采樣品種為青皮果蔗，脫毒果蔗拔地拉為桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的脫毒健康種苗，紫皮果蔗、羅漢果蔗、廣東黃皮、同安果蔗為桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗示范基地引進品種。每個品種隨機采集11個樣，因未脫毒拔地拉種植面積最大，集中連片達670 hm2以上，采集了22個樣品進行檢測。每個果蔗品種均采集了表現(xiàn)褪綠斑點、斑駁及無癥狀果蔗葉片，共88份樣品。

1.2 試驗方法

從甘蔗地采回的樣品放4℃冰箱保存。每個樣分裝若干管并做好標記，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。

采用“天根新型植物基因組DNA提取試劑盒”對甘蔗樣品的DNA進行提取，提取步驟按試劑盒說明書操作。

提取的DNA樣品用微量分光光度計測定濃度和質(zhì)量。

SCBV病毒檢測。冰上配置如下體系：DNA樣品（陽性對照甘蔗DNA，陰性對照甘蔗DNA，空白對照水和88份果蔗樣品DNA）1μL，2×Es Taq Mix 10 μL（天根），SCBV檢測引物Sc-F/Sc-R各1μL，ddH2O補足反應(yīng)體系至20μL。短暫離心后，PCR儀上進行如下條件反應(yīng)：預(yù)變性2min，變性30 s，退火30 s，延伸30 s，40個循環(huán)，終延伸2min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，預(yù)期目標條帶大小約為640 bp。

2 PCR檢測結(jié)果

以甘蔗總DNA為模板，用檢測引物進行PCR檢測。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳之后，如果出現(xiàn)預(yù)期大小條帶，則判定樣品為病毒陽性，否則為陰性。

經(jīng)檢測，采自桂北地區(qū)栽培的88份樣品中有2份（A-11，A-17）為 SCBV陽性，檢出率2.3%，樣品均為未脫毒果蔗拔地拉，表現(xiàn)有、無癥狀的樣品各1份；樣品脫毒拔地拉、青皮果蔗、紫皮果蔗、羅漢果蔗、廣東黃皮、同安果蔗檢測均為陰性（圖1）。

圖1 樣品SCBV的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

SCBV侵染甘蔗引起的癥狀差異很大，有時還表現(xiàn)隱癥［2］。在本研究檢測侵染的樣品中，表現(xiàn)有、無癥狀的樣品各1份，因此僅用葉片的癥狀表現(xiàn)來確定植株是否受到SCBV侵染的判斷并不可靠。通過拔地拉果蔗脫毒與未脫毒檢測對比初步表明，種植脫毒種苗是有效的防治措施。有研究表明，SCBV與甘蔗花葉病毒同時侵染時會發(fā)生協(xié)同作用，導(dǎo)致甘蔗花葉病毒癥狀明顯加重，SCBV的病毒粒子顯著增多［16］；SCBV與甘蔗花葉病毒、甘蔗黃葉病毒和宿根矮化病菌幾種病毒之間存在復(fù)合感染現(xiàn)象［6］，而脫毒苗可有效脫除種苗內(nèi)的甘蔗花葉病毒、甘蔗黃葉病毒和宿根矮化病菌［14，15］，進而減少誘導(dǎo)或復(fù)合SCBV侵染的發(fā)生。因此，進行脫毒蔗種的研發(fā)和推廣是解決種苗受主要甘蔗病毒、病菌感染的有效防治措施。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，目前在桂北最大的果蔗連片種植區(qū)已經(jīng)存在SCBV侵染，引進的品種未受侵染。因此，應(yīng)重視對SCBV的檢測與防控，積極推進種植果蔗健康脫毒種苗，同時結(jié)合市場需要引栽不同品種，避免因品種單一而造成區(qū)域性重大病害的發(fā)生。