益氣溫陽方聯(lián)合化療對結(jié)直腸癌晚期患者外周血Treg細(xì)胞影響研究

陶智怡 王金平 陸燁 姜洪心

[摘要] 目的 探討益氣溫陽方聯(lián)合化療對晚期（ⅢⅣ期）結(jié)直腸癌患者外周血Treg細(xì)胞比率的影響及益氣溫陽方的抗癌機(jī)制。方法 方便收集2017年01月—2018年06月收治的56例晚期結(jié)直腸癌患者，分為研究組及照組。對照組患者進(jìn)行化療，研究組患者在化療基礎(chǔ)上口服益氣溫陽方，兩組患者均以21 d為一周期。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測治療前及治療2周期后外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞表達(dá)水平。結(jié)果 對照組治療后的外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞比率較治療前下降不明顯[（5.51±0.87）%vs（5.03±1.21%]，治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.76，P>0.05），研究組治療后的外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞比率較治療前下降明顯[（5.59±1.45）%vs（4.28±1.23）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.51，P<0.01），且研究組治療后CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞比率明顯低于對照組[（4.28±1.23）vs（5.03±1.21）]，兩組治療后的組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.29，P=0.02）。另研究組Treg細(xì)胞的抑制率明顯高于對照組[（0.22±0.17）vs（0.09±0.13）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.18，P<0.01）。 結(jié)論 益氣溫陽方聯(lián)合化療能明顯降低ⅢⅣ期結(jié)直腸癌患者外周血Treg細(xì)胞比率。通過降低Treg細(xì)胞水平，調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸微環(huán)境來抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移可能是益氣溫陽方扶正以抗癌的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 益氣溫陽;結(jié)直腸癌;免疫逃逸;CD4+ CD25+ CD127low/-Treg

[中圖分類號] R276.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）04（c）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Yiqi Wenyang Decoction combined with chemotherapy on the peripheral blood Treg cells of patients with late stage （III IV） colorectal cancer. To investigate the anticancer mechanism of Yiqi Wenyang Decoction. Methods Convenient select a total of 56 patients with advanced colorectal cancer from January 2017 to June 2018 were collected. They were divided into control group and study group. The control group was given chemotherapy. The study group was given both Yiqi Wenyang Decoction and chemotherapy. The two groups were treated with 21 days as a treatment cycle. The expression level of CD4++ CD25+ CD127low/-Treg cells in peripheral blood was detected by flow cytometry before treatment and after 2 treatment cycles. Results The ratio of CD4++ CD25+ CD127low/-Treg cells in the peripheral blood of the control group was not significantly lower than that before treatment [（5.51±0.87）% vs （5.03±1.21%]， which did not make significant difference between the ratio before treatment and the ratio after treatment （t=1.76， P>0.05）. The ratio of CD4+ CD25+ CD127low/-Treg cells in the peripheral blood of the study group was significantly lower than that before treatment [（5.59±1.45）% vs （4.28±1.23）%]， which was statistically significant （t=3.51， P<0.01）. And the ratio of CD4+ CD25++ CD127low/-Treg cells in the study group was significantly lower than that in the control group [（4.28±1.23） vs （5.03±1.21）]， and the difference between the two groups after treatment was statistically significant （t=2.29， P=0.02）. The inhibition rate of Treg cells in the study group was significantly higher than that in the control group [（0.22±0.17） vs （0.09±0.13）]， which was statistically significant （t=3.18， P<0.01）. Conclusion Yiqi Wenyang Decoction combined with chemotherapy could significantly decrease the peripheral blood Treg cells of patients with late stage （III IV） colorectal cancer. Through decreasing the level of Treg cells and regulating tumor immune escape microenvironment to inhibit tumor growth may be one of the Yiqi Wenyang Decoctions mechanisms of strengthening the body resistance to fight cancer.

[Key words] Yiqi Wenyang; Colorectal cancer; Immune escape， CD4+ CD25+ CD127low/-Treg

結(jié)直腸癌是全球最常見腫瘤之一，中晚期結(jié)直腸癌患者化療后多因藥毒攻伐導(dǎo)致臟腑虛損，處于“脾腎陽虛”狀態(tài)，治療以健脾溫腎，扶正抗癌為主。本研究以結(jié)直腸癌ⅢⅣ期患者作為研究對象，觀察益氣溫陽方聯(lián)合化療對結(jié)直腸癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的影響，討論益氣溫陽方對腫瘤免疫逃逸的作用。

在腫瘤發(fā)展過程中[1]免疫逃逸是腫瘤形成的關(guān)鍵。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，它參與腫瘤免疫逃逸過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，大多數(shù)腫瘤患者Foxp3+Treg細(xì)胞升高往往提示預(yù)后不良[1-3]。聯(lián)合使用CD4+，CD25+和CD127可表達(dá)高純度的Foxp3+Treg細(xì)胞，腫瘤患者外周血CD4+CD25+ CD127low/-Treg水平與腫瘤預(yù)后成負(fù)相關(guān)[4]，能在一定程度上反映腫瘤治療療效[5-6]。該研究截止至2018年6月，共方便選取研究對象56例，現(xiàn)報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便收集蘇州市立醫(yī)院（東區(qū)）收治的結(jié)直腸癌晚期（ⅢⅣ期）患者56例作為研究對象，其中男37例，女19例，年齡35～81歲，平均（61.98±10.74）歲。對照組30例，研究組26例。所有入選患者均符合《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》中的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)活檢或手術(shù)病理確診為結(jié)直腸癌。根據(jù)《AJCC癌癥分期手冊》第7版結(jié)直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅲ期18例，Ⅳ期38例。兩組間性別構(gòu)成和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)末次化療后1個月，未行放療、生物治療、中藥及其他抗癌治療;②無嚴(yán)重心、肝、腦、腎等器質(zhì)性損害和骨髓造血功能障礙者;③卡氏評分（Kamofsky）≥60分;④預(yù)計生存期>4個月;⑤簽署知情同意書，自愿接受治療，依從性好，可隨訪;本試驗得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn);②合并其他嚴(yán)重疾?、勰X轉(zhuǎn)移引起精神意識障礙及精神病不能合作者;④過敏體質(zhì)及對藥物過敏者;⑤患者嘔吐頻繁，或厭服中藥。

1.2? 主要試劑和儀器

中藥藥材：益氣溫陽方：黃芪30 g（批號：1703120 09），黨參10 g（批號：170201005），茯苓10 g（批號：170418014），炙甘草10 g（批號：161129006），炒白術(shù)10 g（批號：170308002），薏苡仁30 g（批號：170115010），制附子10 g（批號：170415001），干姜6 g（批號：1612140 03），仙靈脾10 g（批號：170215010）（生產(chǎn)廠家：蘇州天靈中藥飲片廠）。煎煮工藝：蘇州天靈中藥飲片廠自動化煎煮設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)煎煮工藝。檢測試劑：Fluorescein isothiocyanate （FITC）-CD4 +（BD Biosciences， Franklin Lakes， NJ， USA）;antigen-presenting cells （APC）-CD25 +（BD Biosciences）;PE-CD127（BD Biosciences）;溶血素（BD Biosciences）;檢測儀器：流式細(xì)胞儀（BD FACS Diva軟件）;分析流式數(shù)據(jù)軟件：BD FACS Diva軟件。

1.3? 方法

1.3.1? 治療方法? 對照組結(jié)合患者既往治療方案，參照《NCCN結(jié)腸癌臨床實踐指南》，選擇FOLFOX或FOLFIRI方案的化療，并根據(jù)患者一般情況調(diào)整化療劑量。研究組在對照組基礎(chǔ)上予以中藥益氣溫陽方（藥物組成：黃芪30 g，黨參10 g，茯苓10 g，炙甘草10 g，炒白術(shù)10 g，薏苡仁30 g，制附子10 g，干姜6 g，仙靈脾10 g），并根據(jù)患者證型進(jìn)行適當(dāng)劑量調(diào)整;水煎服，分早晚2次服。21 d為1個治療周期，每周期第8天開始服用中藥，持續(xù)服用14 d，2組患者進(jìn)行治療2周期。

1.3.2? 標(biāo)本采集? 第一周期治療前以及第二周期21 d治療后，清晨空腹使用肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝充分混勻確認(rèn)無凝血，20℃～25℃室溫保存，6 h內(nèi)進(jìn)行流式抗體染色。

1.3.3? 指標(biāo)檢測? 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+ CD25+CD127low/-細(xì)胞：使用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。取100 uL全血，分別加入抗人 （FITC）-CD4+、 （APC）-CD25+、PE-CD127各5 uL，另設(shè)同型對照管，補(bǔ)償管，渦旋震蕩后，4℃避光孵育15 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，渦旋后室溫孵育15 min。以2 mL PBS1800 r/min離心洗滌5 min，棄上清，將細(xì)胞懸浮于0.5 mL PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機(jī)檢測。設(shè)定淋巴細(xì)胞為Rl門內(nèi)細(xì)胞，CD4+細(xì)胞為R2門內(nèi)細(xì)胞，測定CD25+CDl27low/-細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比。

1.4? 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，實驗數(shù)據(jù)以均值x，標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩組間比較采用兩獨立樣本χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)系數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

①對該研究中56例結(jié)直腸癌患者數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析顯示，治療后兩組患者外周血CD4+ CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比率都存在部分患者上升、部分患者下降（上升9例，下降47例），總體Treg細(xì)胞比率較治療前下降（P<0.05），圖1。

②研究組與對照組患者在治療前外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞比率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對照組患者治療后與治療前Treg細(xì)胞比率未顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），研究組治療后與治療前Treg細(xì)胞比率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。研究組治療后外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞比率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.29，P=0.02）。

③研究組治療后的Treg細(xì)胞比率較對照組下降明顯，研究組Treg細(xì)胞的抑制率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。說明益氣溫陽方聯(lián)合化療對于結(jié)直腸癌患者Treg細(xì)胞的抑制程度高于單純化療。

3? 討論

腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）是腫瘤學(xué)近年來最重要的研究方向[7]。針對腫瘤免疫逃逸機(jī)制的治療在部分類型的腫瘤患者取得了長期緩解的療效[8]。在免疫編輯的過程中，免疫逃逸是腫瘤形成的關(guān)鍵。免疫逃逸的機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞的自身修飾、代謝和腫瘤微環(huán)境的兩方面改變[9]。腫瘤微環(huán)境中存在大量包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在內(nèi)的抑制性免疫細(xì)胞。Treg細(xì)胞能夠分泌IL-10，TGF-β等因子抑制效應(yīng)性T細(xì)胞及NKT等的增殖和功能，對于效應(yīng)性T細(xì)胞抗腫瘤有抑制作用，在多種實體腫瘤的免疫逃逸中起重要的作用[10]。

中醫(yī)認(rèn)為結(jié)直腸癌病位在大腸，脾腎虧虛為本，邪毒瘀滯為標(biāo)，二者互為因果，互相影響。化療是廣泛性細(xì)胞殺傷性的抗癌方法，結(jié)直腸癌化療后患者表現(xiàn)出納差消瘦、神疲乏力、畏寒腹瀉、面色晦暗、舌淡暗苔白、脈沉遲無力等癥狀，處于“脾腎陽虛”的免疫抑制狀態(tài)。

在“人是一個有機(jī)整體”的理論指導(dǎo)下，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為分析病理機(jī)制時應(yīng)首先著眼局部病變引起的整體反應(yīng)。在結(jié)直腸癌化療后，“脾腎陽虛”的機(jī)體整體狀態(tài)為腫瘤提供了有利的生長、逃逸環(huán)境，循環(huán)腫瘤細(xì)胞、休眠細(xì)胞和微轉(zhuǎn)移灶則成為腫瘤復(fù)發(fā)的種子。腫瘤微環(huán)境中發(fā)生的免疫逃逸正是腫瘤作用于機(jī)體、機(jī)體免疫對腫瘤的整體反應(yīng)。因此，治療時宜扶正培本，減輕化療毒副反應(yīng)，改善機(jī)體腫瘤內(nèi)環(huán)境、及糾正機(jī)體腫瘤免疫功能抑制狀態(tài)。化療后聯(lián)合益氣溫陽方治療體現(xiàn)了中醫(yī)扶正以抗癌的思想。

益氣溫陽方以黃芪四君子湯加四逆湯為主方。黃芪四君子湯益氣健脾，四逆湯扶正溫陽，聯(lián)合薏苡仁健脾勝濕，仙靈脾溫煦腎陽，共奏益氣溫陽之功?；A(chǔ)與臨床研究[11-13]證實益氣溫陽類中藥對于腫瘤免疫逃逸有調(diào)節(jié)作用。譚佳妮等[11]通過荷瘤小鼠試驗，證實含有益氣中藥的消癌解毒方具有顯著抑制結(jié)腸癌增殖的作用，其機(jī)制可能與減少外周血內(nèi)Treg細(xì)胞的分布及腫瘤組織中 Foxp3 的表達(dá)進(jìn)而影響其下游信號通路傳導(dǎo)相關(guān)。周波等[12]通過對胃癌 IV期患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散能降低胃癌IV期患者外周血 CD4+CD25+Tregs[（28.87±8.54）%vs（10.12±4.32）%]。在該次研究中，兩組結(jié)直腸癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比率在治療前后都存在部分患者上升、部分患者下降，總體Treg細(xì)胞比率較治療前下降（P<0.05）。這說明Treg細(xì)胞檢測在一定程度上能反應(yīng)治療效果。研究中選取研究組與對照組患者在治療前外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞比率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而研究組治療后的Treg細(xì)胞比率（4.28±1.23）%較對照組（5.03±1.21）%下降明顯（P<0.05）;研究組Treg細(xì)胞的抑制率（0.22±0.17）顯著高于對照組（0.09±0.13），有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。說明益氣溫陽方聯(lián)合化療對于結(jié)直腸癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細(xì)胞的抑制程度高于單純化療。通過降低結(jié)直腸癌患者外周血Treg細(xì)胞水平，調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸微環(huán)境來抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移可能是益氣溫陽方扶正以抗癌的機(jī)制之一。臨床運(yùn)用益氣溫陽法聯(lián)合化療能夠更好的提高患者的腫瘤免疫功能，提高其生存質(zhì)量。因益氣溫陽法對腫瘤免疫逃逸的調(diào)節(jié)作用，將其與靶向治療相結(jié)合以提高靶向藥物療效并作用于臨床可能是未來的研究方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Mittal D， Gubin MM， Schreiber RD， et al. New insights into cancer immunoediting and its three component phases-elimination， equilibrium and escape[J].Current Opinion in Immunology， 2014， 27（1）：16-25.

[2]? Parodi A， Traverso P， Kalli F， et al. Residual tumor micro-foci and overwhelming regulatory T lymphocyte infiltration are the causes of bladder cancer recurrence[J]. Oncotarget， 2016， 7（6）：6424-6435.

[3]? Olguín JE， Medina-Andrade I， Molina E， et al. Early and Partial Reduction in CD4+Foxp3+Regulatory T Cells during Colitis-Associated Colon Cancer Induces CD4+and CD8+T Cell Activation Inhibiting Tumorigenesis[J]. Journal of Cancer， 2018， 9（2）：239.

[4]? Wei T， Zhang J， Qin Y， et al. Increased expression of immunosuppressive molecules on intratumoral and circulating regulatory T cells in non-small-cell lung cancer patients[J]. American Journal of Cancer Research， 2015， 5（7）：2190.

[5]? 鐘銳，馮龍.CD4 + CD25 + CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在晚期胃癌中的表達(dá)及意義[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（15）：2065-2066.

[6]? Kond lková K， Vokurková D， Krejsek J， et al. Regulatory T cells （TREG） and their roles in immune system with respect to immunopathological disorders[J]. Acta Medica， 2010， 53（2）：73-77.

[7]? Couzin-Frankel J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy[J]. Science， 2013，342（6165）：1432-1433.

[8]? Yu Wang. Breakthrough and Obstacles of Clinical Cancer Immunotherapy[J].Medicine and Philosophy，2015，36（2B）：10-11.

[9]? Beatty GL， Gladney WL. Immune? escape? mechanisms as a guide for cancer immunotherapy[J]. Clin? Cancer Res， 2015， 21（4）： 687-692.

[10]? Wang J， Yang J. Identification of CD4+CD25+CD127- regulatory T cells and CD14+HLA-DRlow/- myeloid-derived suppressor cells and their roles in the prognosis of breast cancer[J]. Biomedical Reports， 2016， 5（2）：208.

[11]? 譚佳妮， 石文靜， 沈衛(wèi)星，等. 消癌解毒方對結(jié)腸癌的抑制作用及對Treg細(xì)胞的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2017， 33（5）：515-518.

[12]? Liu B， Guo PR， Sheng YW， et al. Effects of ganoderma lucidum polysaccharide on chemotherapy effect and immune escape in T24 bearing mice[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment， 2015， 42（5）：459-465.

[13]? 周波，戴飛躍.參苓白術(shù)散對胃癌IV 期患者外周血CD4+CD25+Tregs 的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，35（5）：50-52.

（收稿日期：2019-01-21）