兼具清防蠟效果和防腐效果的復合微生物菌劑*

余 燦，易紹金

（長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州 434023）

目前，微生物清防蠟技術(shù)已廣泛應用于油井清防蠟，取得了良好的效果和經(jīng)濟效益［1-5］。油田中的腐蝕給石油生產(chǎn)帶來了嚴重的影響和危害，其中硫酸鹽還原菌（SRB）及其代謝產(chǎn)生的硫化氫和S2-是最重要的腐蝕因素之一［6-8］。反硝化菌（DNB）可抑制 SRB 進而達到防止 SRB 的腐蝕已形成共識［9-14］。目前微生物菌劑只能單純得到清防蠟效果或防腐效果，即投加清防蠟菌劑可對油井起到清防蠟作用，投加DNB 菌劑可通過抑制SRB 從而達到防腐效果。本文采用的清防蠟菌劑為工業(yè)用微生物清防蠟菌劑，主要為石油烴降解菌（HDB），也含有少量DNB。通過在清防蠟菌劑中投加硝酸鹽，刺激原菌劑中DNB增長，再添加適量DNB菌種，使菌劑中HDB 的數(shù)量保持基本穩(wěn)定的同時，DNB 也能達到一定的數(shù)量（1.0×108個/mL 以上），從而形成復合微生物菌劑JH-01，以期實現(xiàn)清防蠟效果的同時兼具防腐效果，達到一劑兩用之目的。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

硝酸鈉，工業(yè)級，襄陽澤東化工集團有限公司；DNB菌種，實驗室保藏菌種；微生物清防蠟菌劑，工業(yè)級，湖北長大科技開發(fā)有限公司；A3 鋼片、J55 鋼片，常州清立環(huán)能化工科技有限公司；HDB-JH型石油烴降解菌測試瓶、DNB-JH型反硝化菌測試瓶，湖北長大科技開發(fā)有限公司；江蘇油田原油，25℃下的黏度為34.82 mPa·s，凝固點為40℃，含蠟量為21.12%，屬于高含蠟量原油；江蘇油田現(xiàn)場采出液，礦化度 27774.5 mg/L，Na2SO4水型，SRB 菌數(shù) 2.0×104個/mL，SO42-、S2-、Cl-、Na+質(zhì)量濃度分別為1090.6、12.3、4692.3、9641.1 mg/L；石油烴降解菌液體培養(yǎng)基配方［15］：K2HPO4·3H2O 4.8 g、KH2PO41.5 g、（NH4）2SO41 g、檸檬酸三鈉 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、酵母粉 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.002 g、蒸餾水1 L、2%液體石蠟、pH=7.2數(shù)7.4；反硝化菌液體培養(yǎng)基配方［16］：KNO32 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、酒石酸鉀鈉20 g、蒸餾水1 L。

THZ-412 恒溫振蕩器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；STARTER3100pH 計，奧豪斯儀器設(shè)備有限公司；SPX-300BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；13395H2X顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

（1）菌數(shù)的測定。采用細菌測試瓶法［17］和最大或然數(shù)計數(shù)法（MPN）［18］測定菌數(shù)。細菌測試瓶法參照石油天然氣行業(yè)標準SY/T 5329—2012《碎屑巖油藏注水水質(zhì)推薦指標及分析方法》進行。采用MPN中的雙管平行法計數(shù)樣品中的菌數(shù)。

（2）pH值的測定。參照國家標準GB 6920—86《水質(zhì)pH 值的測定玻璃電極法》，采用玻璃電極法測定pH值。

（3）防蠟率的測定。采用倒扣瓶法測定工業(yè)微生物清防蠟菌劑和JH-01 型復合菌劑的防蠟率［19］。取江蘇油田原油，以無菌水為空白組，原工業(yè)微生物清防蠟菌劑為對照組。

（4）腐蝕速率的測定。參照標準SY/T 5329—2012，采用掛片法測定腐蝕速率。將油田現(xiàn)場采出液（每瓶180 mL）分別與20 mL 無菌水和20 mL 微生物清防蠟劑混合均勻，在35℃和密閉厭氧狀態(tài)（模擬油井環(huán)形空間厭氧環(huán)境）下，將A3或J55鋼片置于上述混合液中30 d，測定混合液中的SRB菌數(shù)和鋼片的平均腐蝕速率。

（5）HDB 和DNB 的生理生化特征。將實驗室保藏的DNB菌種或清防蠟菌劑中分離提純的HDB分別用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有50 mL滅菌反硝化液體培養(yǎng)基或滅菌石油烴液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在35℃、150 r/min 下培養(yǎng)24 h。初篩后分別得到4 株DNB 菌株 JHF1數(shù) 4 和 5 株 HDB 菌株 JHS1數(shù) 5。將菌株通過平板劃線法和穿刺培養(yǎng)法培養(yǎng)2 d 后［20］，觀察菌落情況；革蘭氏染色后觀察菌落形態(tài)以及菌株生理生化特征。

2 結(jié)果與討論

2.1 工業(yè)用微生物清防蠟菌劑中HDB及DNB的菌數(shù)檢測

用細菌測試瓶法測得工業(yè)用微生物清防蠟菌劑中HDB的菌數(shù)為2.0×108個/mL，用細菌測試瓶法和MPN 法測得 DNB 的菌數(shù)為5.0×102個/mL，說明清防蠟菌劑中主要為HDB，同時存在少量DNB。

2.2 硝酸鹽加量對清防蠟菌劑中HDB及DNB菌數(shù)的影響

向工業(yè)用微生物清防蠟菌劑中加入不同量的硝酸鈉，在35℃、150 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)14 d，測得HDB 和DNB 的菌數(shù)見表1。硝酸鈉加量小于1.0 g/L 時，HDB 的菌數(shù)基本保持不變，具有一定的抗鹽性；當硝酸鈉加量達到1.0 g/L 以上時，HDB 菌數(shù)降低。隨硝酸鈉加量的增加，DNB的菌數(shù)先增加后降低，硝酸鈉加量為0.2 g/L 時的DNB 菌數(shù)最大。這可能是由于礦化度過高使菌體處于高滲溶液中，細胞皺縮失水，不利于微生物生長，菌數(shù)下降［20］。通過加入一定量的硝酸鈉雖然能讓清防蠟菌劑中的DNB 數(shù)量有所增加，但達不到預期效果（1.0×108個/mL以上），因此需要向其中加入DNB菌種以增加清防蠟菌劑中DNB的菌數(shù)。

表1 硝酸鈉加量對清防蠟菌劑中HDB及DNB菌數(shù)的影響

2.3 投加DNB菌種的清防蠟菌劑中HDB及DNB的數(shù)量

經(jīng)預實驗并考慮到成本，投加DNB 菌種量為0.2%（體積分數(shù)，后同）時即可獲得一定數(shù)量的DNB。向工業(yè)用微生物清防蠟菌劑中投加0.2%DNB 菌種后，再按每100 mL 菌劑加入不同質(zhì)量的硝酸鈉，在35℃、150 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)14 d，測得HDB 和DNB 的菌數(shù)見表2。隨硝酸鈉加量的增大，HDB 菌數(shù)基本保持穩(wěn)定。當額外投加0.2%DNB 菌種后，隨著硝酸鈉加量的增大，DNB菌數(shù)先增加后降低，在硝酸鈉加量為0.2 g/L時達到最大值（2.5×108個/mL），達到了預期效果。礦化度的增加抑制了 DNB 菌體的數(shù)量［20］。將投加 0.2% DNB 菌種和0.2 g/L硝酸鈉的清防蠟菌劑留存?zhèn)溆茫麨镴H-01型復合菌劑。

表2 投加DNB菌種的清防蠟菌劑中HDB及DNB的菌數(shù)隨硝酸鈉加量的變化

2.4 清防蠟菌劑培養(yǎng)過程中pH值的變化及原因分析

分別量取不同硝酸鈉加量下，投加0.2% DNB菌種和未投加菌種的清防蠟菌劑50.0 mL，測定菌劑在 35℃、150 r/min 條件下培養(yǎng) 0、48、96、240 h 的pH 值，結(jié)果見表3。隨著培養(yǎng)時間的延長，投加DNB菌種前后的清防蠟菌劑pH值總體都呈現(xiàn)了下降的趨勢。投加0.2% DNB 菌種的清防蠟菌劑pH值降幅小于未投加的降幅。當硝酸鈉加量為0.2 g/L 時，培養(yǎng) 96 h 后的 pH 值又回到 7.02。在培養(yǎng)240 h后，未投加DNB菌種的清防蠟菌劑pH值降至5.70 左右，而投加了0.2% DNB 菌種的清防蠟菌劑pH 值基本都回升至初始pH 值。結(jié)合HDB 和DNB的代謝特性可知，HDB在代謝過程中會產(chǎn)生低分子有機酸使pH值降低，DNB代謝會利用HDB產(chǎn)生的低分子有機酸使pH值升高。當菌劑中HDB菌數(shù)較多而DNB 較少時，隨著培養(yǎng)時間的延長，pH 值受HDB 代謝產(chǎn)物的影響導致pH 值下降。pH 值過低或者過高均不利于菌體的正常生長發(fā)育。當菌劑中同時存在大量HDB 和大量DNB 時，受HDB 和DNB 的共同影響，菌劑的pH 值保持在一個穩(wěn)定的水平，這讓DNB 和HDB 在數(shù)量上保持一個動態(tài)平衡。因此從菌劑的pH值變化可以側(cè)面反映出菌劑中各菌體數(shù)量的整體趨勢。

表3 硝酸鈉加量對投加DNB菌種前后清防蠟菌劑pH值的影響

2.5 防蠟效果實驗研究

用倒扣瓶法測得原工業(yè)微生物清防蠟菌劑（對照組）和JH-01 型復合菌劑（實驗組）的防蠟率見表4。原工業(yè)用微生物清防蠟劑和JH-01 型復合菌劑的防蠟率均大于80%，防蠟性能良好。

表4 工業(yè)微生物清防蠟菌劑的防蠟率

2.6 防腐效果

將油田現(xiàn)場采出液與無菌水（空白組）、原工業(yè)用微生物清防蠟劑（對照組）、20 mL JH-01型復合菌劑（實驗組）混合后，測得三者對A3和J55鋼片的平均腐蝕速率見表5。在密閉厭氧狀態(tài)下掛片30 d后，對照組中的SRB菌數(shù)變化不大，甚至有所增加，雙平行樣測得的平均腐蝕速率也均大于標準SY/T 5329—2012規(guī)定的0.076 mm/a；而實驗組的SRB菌數(shù)明顯降低，平均腐蝕速率均低于0.076 mm/a。表明JH-01 型復合菌劑的投加會減少SRB 菌數(shù)，從而降低腐蝕速率。

表5 工業(yè)用微生物清防蠟劑對掛片腐蝕速率的影響*

2.7 HDB和DNB的種類及生理生化特征

HDB菌株JHS1數(shù)5和DNB菌株JHF1數(shù)4的菌落形態(tài)和菌株生理生化特征如表6所示。HDB 菌呼吸類型主要為兼性厭氧，同時也有少量的好氧和專性厭氧，大多數(shù)不能運動；DNB 菌呼吸類型主要為兼性厭氧，一株為專性厭氧，革蘭氏染色均為陰性。清防蠟菌劑中的HDB 與DNB 多為兼性厭氧菌，可以共存于同一環(huán)境中。

表6 HDB菌株與DNB菌株的形態(tài)及生理生化特征

3 結(jié)論

工業(yè)用清防蠟菌劑中含有大量的石油烴降解菌（HDB）和少量的反硝化菌（DNB）。向其中投加少量硝酸鈉可使DNB 菌數(shù)增加，但增幅有限；當硝酸鈉加量大于0.2 g/L時，DNB菌數(shù)逐漸降低。在工業(yè)用清防蠟菌劑中投加0.2%DNB菌種和0.2 g/L的硝酸鈉，可得到既具有防蠟效果也具有一定防腐效果的JH-01 型復合菌劑?？赏ㄟ^培養(yǎng)過程中pH 值的變化來判斷清防蠟菌劑中HDB和DNB菌數(shù)之間的關(guān)系。清防蠟菌劑中的HDB與DNB多為兼性厭氧菌，二者兼容性良好。