蠐螬提取物對實驗性兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞不同時間窗TIMP-2表達的影響※

● 馬駿旭 蔣鵬飛 彭 俊 彭清華，3▲

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是臨床常見的視網(wǎng)膜血管病，目前尚無特效療法，新生血管(RNV)是RVO的主要并發(fā)癥。蠐螬首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可治療目疾，有破血、行瘀、散結(jié)、明目之功。蠐螬提取物可促進RVO出血的吸收、抑制RNV[1-2]，本文通過建立視網(wǎng)膜靜脈阻塞的動物模型，進一步探討了蠐螬對RNV的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1實驗動物選用40只健康有色家兔，不限雌雄，體重1.8～2.3kg(合格證號：湘醫(yī)動字第30-015號)。

1.2主要實驗藥品和試劑蠐螬提取物[制備方法參考陽長明的方法[3]，具體為：蠐螬400g(湖南東潤聯(lián)合醫(yī)藥有限公司中藥材部)，清洗10遍以上，浸泡一晚，后洗至無臭味。加蒸餾水5kg，加37%HCl至PH值為2。高壓蒸汽鍋蒸2小時。紗布(4～5層)過濾，溶液中加40%NaOH至PH值為6.5～6.8。冷卻后隔水加熱，濃縮至1600mL(1mL溶液=0.25g生藥)。裝瓶，壓蓋，蒸汽高溫滅菌，冷藏保存。]；復(fù)方血栓通片(揚州中惠制藥有限公司，批號：B14002362976)；25%烏拉坦(上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：MFCD00007966)；20%熒光素鈉(上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：71018944)；一抗為兔抗TIMP-2多克隆抗體(武漢默沙克生物科技有限公司，批號：kt50111)；二抗為生物素標(biāo)記的IgG(武漢默沙克生物科技有限公司，批號：kt600010)。

1.3主要實驗儀器顯微圖象分析系統(tǒng)(Mias-2000型)、凝膠成像系統(tǒng)[美國，Bio-Rad(Gel Doc XR +)]、電子秤(上海天平儀器廠， JY0001)、微量移液器[德國，eppendorf(1ml/200ul/10ul)]、PCR儀(德國，Biometra)、水平電轉(zhuǎn)槽(北京六一儀器廠，DYCP-40C)、垂直板電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24D)、臺式高速冷凍離心機(Thermo)、超純水儀(millipore公司)、恒溫?fù)u床(金壇，THZ-82A)、紫外可見分光光度計(上海spectrum公司，SP-752)、水平搖床(北京六一儀器廠，WD-9405B)。

2 實驗方法

2.1動物分組將40只有色家兔按隨機數(shù)字表法分為空白組(A組)、模型組(B組)、復(fù)方血栓通組(C組)、蠐螬提取物組(D組)，每組10只動物(20只眼)。

2.2造模方法應(yīng)用光化學(xué)動力法[4]制作實驗性RVO模型，B、C、D組雙眼散瞳后，麻醉動物，用激光對兔雙側(cè)視網(wǎng)膜靜脈進行照射，同時避開伴行的動脈，看到有明顯的遠端靜脈擴張時停止。

2.3動物給藥方法A、B組予生理鹽水5mL·Kg-1灌胃；C組予復(fù)方血栓通0.1g·kg-1溶于生理鹽水中制成混懸劑，5mL·Kg-1灌胃；D組予蠐螬提取物1.5mL·kg-1灌胃。各組均為每日1次，持續(xù)至造模后3wk，于造模后1wk、3wk每組各隨機處死5只動物。

2.4取材方法兔子處死后，摘除眼球，視網(wǎng)膜組織經(jīng)酒精脫水、石蠟包埋后，做4μm厚的切片，烘干備用。

2.5檢測方法

2.5.1 熒光素眼底血管造影(FFA) 造模后1wk、3wk對兔行FFA檢查，使用Mias-2000型顯微圖象分析系統(tǒng)測量無灌注區(qū)(non perfusion area，NPA)和視盤(optic disk，OD)的面積并求出比值(S=N/D)[5]。分為有無灌注區(qū)、無新生血管(甲類)和有無灌注區(qū)、有新生血管(乙類)。

2.5.2 光鏡觀察方法 將取材的切片染色，做免疫組化組織學(xué)檢測TIMP-2表達，在光學(xué)顯微鏡下主要觀察視網(wǎng)膜組織變化。

3 結(jié)果

3.1FFA檢查結(jié)果造模后1wk，B組中央靜脈熒光滲漏、出血，C、D兩組滲漏、出血較B組少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后3wk，B組滲漏、出血的靜脈周圍已經(jīng)出現(xiàn)無灌注區(qū)與新生血管；C組滲漏、出血與1wk時相比明顯減小，與B組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；D組滲漏、出血基本吸收，與B組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，與C組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。S=N/D結(jié)果見表1。

表1 各組不同時間窗S=N/D的平均值結(jié)果

注：與B組比較，＊P<0.05；與1wk時相比，#P<0.05

3.2HE染色結(jié)果A組：視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列正常。B組：造模后1wk，視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞排列較亂，尚無新生血管索；造模后3wk，出現(xiàn)大量的新生血管索。C組：造模后1wk，視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞排列紊亂；造模后3wk，視網(wǎng)膜組織水腫較造模后1wk減輕，無新生血管索。D組：造模后1wk，視網(wǎng)膜組織水腫，細(xì)胞排列大致清晰；造模后3wk，視網(wǎng)膜組織水腫減輕，無新生血管索。見圖1。

圖1 各組視網(wǎng)膜組織HE染色(×400)

注：①-⑦分別表示A組正常視網(wǎng)膜、B組造模后1wk、B組造模后3wk、C組造模后1wk、C組造模后3wk、D組造模后1wk、D組造模后3wk的視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果。

3.3TIMP-2染色結(jié)果造模后第1wk：各造模組TIMP-2表達均高于A組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，B組TIMP-2表達與C、D組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而C、D組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。造模后3wk：各造模組視網(wǎng)膜組織中TIMP-2表達均有不同程度減弱，D組的TIMP-2表達與1wk時相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而B組、C組的TIMP-2表達與1wk時相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；C、D組TIMP-2表達均較B組強，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，C、D組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組TIMP-2陽性表達的平均光密度值

注：與A組比較，◇P<0.05；與B組比較，▲P<0.05；與1wk時比較，★P<0.05

4 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的第二大致盲性視網(wǎng)膜血管病[6-8]，發(fā)病率較高，但目前尚不明了其發(fā)生機制[9-12]。

蠐螬是金龜子的幼蟲，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚，青翳白膜?！薄侗静菥V目》言其性微溫，味咸，有破血、行瘀、散結(jié)、通乳、解毒、消瘡、明目的功能?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蠐螬對視網(wǎng)膜靜脈阻塞所致的視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)有改善作用[1-2]，能夠治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞所致的視網(wǎng)膜病理損傷。

金屬蛋白酶(MMPs)家族包括多個結(jié)構(gòu)相似、能夠消化基質(zhì)和基膜的酶[13-17]，在視網(wǎng)膜靜脈阻塞后并發(fā)視網(wǎng)膜新生血管的過程中，此家族蛋白可誘導(dǎo)新生血管的靶基因MicroRNA-188-5p[18]在新生血管的基底膜大量表達，遷移至內(nèi)皮形成新生血管。而金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)家族是一組能抑制MMPs活性的多功能因子，通過對MMPs的抑制，在正常視網(wǎng)膜組織改建和各種病理過程中發(fā)揮重要作用。TIMP-2是21kD的非糖基化蛋白，含有192個氨基酸殘基，對MMPs家族介導(dǎo)的新生血管形成有特別的抑制作用。李貞等[19]研究表明：TIMPs可抑制視網(wǎng)膜病的血管新生，機制可能是抑制了TIMP-2對VEGF的抑制作用。希望通過對TIMPs的研究，可以為視網(wǎng)膜新生血管及纖維增殖的治療尋找一條新的途徑。

本實驗通過對FFA檢查結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，蠐螬提取物組實驗兔RNV生成情況明顯低于模型組。HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示，蠐螬提取物組視網(wǎng)膜組織損傷程度減輕，出血、滲出、水腫等病理改變均較模型組明顯減輕，而與復(fù)方血栓通組相比無明顯差別，說明蠐螬提取物能促進實驗性RVO模型出血的吸收，改善視網(wǎng)膜缺血缺氧的狀態(tài)，可以增強實驗性RVO模型中TIMP-2的表達，從而可以抑制實驗性RNV的形成，與復(fù)方血栓通有相當(dāng)?shù)淖饔谩?/p>