八月瓜葉、果皮和果肉中酚類、VC含量及其抗氧化能力分析

劉永玲，謝國(guó)芳，，王威，楊雙雙，趙治兵

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550005）

八月瓜（Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.）為木通科木通屬落葉藤本植物，其果實(shí)又稱木通子、八月扎、八月炸、預(yù)知子等，是一種集藥用、食用于一身的野生經(jīng)濟(jì)植物，分布于我國(guó)南部、長(zhǎng)江流域和西北地區(qū)[1-4]。八月瓜果實(shí)、葉、種子和根中富含糖、維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸、油脂、木質(zhì)素、多酚、黃酮及抗衰老等成分[5-6]，可鮮食，也可釀酒、制醋、加工成果脯等食品[7-8]。民間多用于治療小便赤澀、淋濁水腫、胸中煩熱、喉痹咽痛、遍身拘痛、婦女經(jīng)閉、乳汁不通等疾病[9-10]。

植物中一般存在大量的黃酮和酚類化合物，黃酮類化合物具有抗菌、消炎和抗氧化等功能[11-12]，酚類化合物具有改善心腦血管疾病，抗癌、抗氧化、防福射、抗病毒、抗腫瘤，調(diào)節(jié)人體氧化酶機(jī)制等功效[13-15]，因此黃酮和酚類兩類化合物都具有重要的生理學(xué)保健功能。八月瓜可食部分為果肉，營(yíng)養(yǎng)豐富，但八月瓜果皮約占整個(gè)果實(shí)質(zhì)量的10%～15%，是八月瓜加工的主要副產(chǎn)物[16]，另外八月瓜種植期間大量的幼果需要摘除廢棄，給環(huán)境造成一定污，若能從三葉木通果皮和葉中提取分析用途廣泛的酚類成分和黃酮類化合物，不僅有效解決了三葉木通果皮廢棄帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，也為副產(chǎn)品的深層次加工提供依據(jù)，明顯提高三葉木通的可利用途徑和經(jīng)濟(jì)效益。

本文以貴州省野生八月瓜葉、果皮和果實(shí)為試驗(yàn)材料，對(duì)VC、總酚、總黃酮和9 種酚類成分含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)對(duì)總還原力（total reducing assay power，TRPA）、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）和ABTS+自由基清除能力的測(cè)定進(jìn)行體外抗氧化能力評(píng)價(jià)，以期為合理開發(fā)利用八月瓜資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八月瓜葉和果實(shí)采自貴州省遵義縣沙灣鎮(zhèn)八一村，經(jīng)貴陽(yáng)學(xué)院副教授楊碧仙鑒定為木通科木通屬植物三葉木通 Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.的葉和果實(shí)，將八月瓜貯藏于4 ℃采樣箱運(yùn)回貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室，果肉和果皮分離，果肉去籽后，-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、鞣花酸、蘆丁和槲皮素（9 種酚類分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95.0%）、甲醇、三氟乙酸（色譜純，純度≥99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）分析純、福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑：上海聚源生物科技有限公司；Trolox 試劑、三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽 [2，2-azinobis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：美國(guó) Sigma 公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A 高效液相色譜儀、UV-2550 型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；KQ5200DE 超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；IKA A11 研磨機(jī)：IKA 公司（德國(guó)）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：Waters 公司（中國(guó)上海）。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 酚類物質(zhì)測(cè)定

1.3.1.1 供試品溶液的制備

稱取10 g 樣品研磨成漿，取2 g 果漿于10 mL 離心管中，加入4.0 mL 70%甲醇溶液，50 ℃超聲波輔助提取30 min，冷卻后10 000 r/min 離心15 min，將上清液過(guò)濾到10 mL 的容量瓶中，加入3.0 mL 70%甲醇溶液于殘?jiān)性偬崛?0 min，在4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，合并上清液，用70%甲醇溶液定容，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾后待測(cè)，取1.0 mL 轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中等待進(jìn)樣，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

1.3.1.2 酚類物質(zhì)分析

準(zhǔn)確稱取9 種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制成1.00 mg/mL 的酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，保存于-4 ℃冰箱備用。

C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），溶液 A（甲醇）和溶液 B（3 ‰ 三氟乙酸）：0～5 min，12 % A；5 min～10 min 12%～25%A；10 min～15 min，25% A；15 min～20 min，25%～30%A；20 min～25 min，30%A；25 min～35 min 30 %～35% A；35 min～40 min，35% A；40 min～50 min，35 %～50 % A；50 min～55 min，50 %～60 % A；55 min～60 min，60 % A。柱溫：30 ℃；流動(dòng)相速率：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)：280 nm。

1.3.2 VC、總酚和總黃酮含量測(cè)定

VC含量測(cè)定采用比色法測(cè)定[17]，以100 g 鮮樣品中抗壞血酸的質(zhì)量（mg）表示，即mg AAE/100 g Fw；總酚含量測(cè)定采用福林酚比色法測(cè)定[18]，以每克鮮樣品中沒食子酸的質(zhì)量（mg）表示，即mg GAE/g Fw；總黃酮含量測(cè)定參照丁建海等的方法[19]，以每克鮮樣品中蘆丁的質(zhì)量（mg）表示，即 mg RE/g Fw。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）參照 Todorovic 等的方法[20]，以每克樣品中Trolox的含量（mmoL）表示，即mmoL TE /g；總還原力（total reducing assay power，TRPA）參照 Oliveira 等的方法[21]，以每克樣品中所含Trolox 的含量（mmoL）來(lái)表示，即mmoL TE/g；ABTS+自由基清除能力參照 Wootton-Beard 等的方法[22]，以每克樣品中所含Trolox 的含量（mmoL）表示，即 mmol TE/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 進(jìn)行整理，測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素差異分析（single factor difference analysis，ANOVA）和皮爾森（Pearson’s）相關(guān)性分析，使用GraphPad Prism 7.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和八月瓜樣品高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）色譜圖

多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和八月瓜樣品的HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和八月瓜樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of standard and leaves，peels and pulp of Akebia trifoliate

由圖1看出，在1.3.1.2 色譜條件下，9 種多酚化合物的標(biāo)準(zhǔn)品得到了較好的分離（圖1A），野生八月瓜葉、果皮和果肉樣品溶液色譜圖（圖B、C、D）中的9 個(gè)目標(biāo)峰，其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的9 個(gè)色譜峰保留時(shí)間一致。在此色譜條件下，八月瓜葉、果皮和果肉中的酚類成分得到較好的分離。

2.2 分光光度法測(cè)定八月瓜各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

分光光度法測(cè)定八月瓜各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及選用波長(zhǎng)見表1。

表1 回歸方程Table 1 Regression equation

由表1可知，抗壞血酸、總酚、總黃酮、抗氧化能力（FRAP）、總還原力（TRPA）和 ABTS+自由基清除能力的回歸方程均具有較好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2的范圍在 0.998 0～0.999 9。

2.3 八月瓜葉、果皮和果肉中活性成分分析

八月瓜葉、果皮和果肉中酚類成分含量見表2。

表2 八月瓜葉、果皮和果肉中酚類成分分析Table 2 Phenolic compositions analysis in the leaves，peels and pulp of Akebia trifoliate

由表2知，八月瓜葉、果皮和果肉中各成分含量差異顯著（P＜0.05），各部位活性成分含量大小順序?yàn)椋喝~＞果皮＞果肉，其中葉中沒食子酸、兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、鞣花酸、蘆丁、槲皮素、抗壞血酸和總酚含量相對(duì)較高，其中沒食子酸含量 （[715.64±4.69）μg/g Fw]是果皮、果肉的6 倍和12 倍；兒茶素含量（[9.16±0.41）μg/g Fw]是果皮、果肉的 3 倍和 17 倍；p-香豆酸含量（[0.6±0.06）μg/g Fw]是果皮的7.5 倍，果肉中未檢測(cè)到；阿魏酸含量（[7.88±0.43）μg/g Fw]是果皮、果肉的1.3 倍和88 倍；鞣花酸含量（[147.61±0.87）μg/g Fw]是果皮、果肉的12 倍和9 倍；蘆丁在葉中含量（[50.24±1.53）μg/g Fw]是果皮和果肉的10 倍，蘆丁在果肉和果皮中的含量差異不顯著（P＞0.05）；槲皮素含量（[27.36±0.77）μg/g Fw]是果皮、果肉的 6 倍和 9 倍；抗壞血酸含量（[200.12±0.23）mg/100 g FW]是果皮、果肉的7 倍和81 倍；總酚（[3.44±0.11）mg/g FW]含量是果皮、果肉的1.3 倍和43 倍。而果皮中綠原酸和表兒茶素含量相對(duì)較高，其中綠原酸含量（[52.82±0.71）μg/g Fw]是葉、果肉1.2 倍和123 倍；表兒茶素含量 （[1.08±0.10）μg/g Fw]是葉、果肉3 倍和18 倍。八月瓜葉和果皮中總黃酮含量差異不顯著（P＞0.05），葉和果皮中總黃酮含量是果肉（[0.19±0.00）μg/g Fw]的24 倍。綜上所述，八月瓜除了可食用部分果肉，其葉和莖均含有較高的活性物質(zhì)且不同部位間存在顯著差異。

2.4 八月瓜葉、果皮和果肉中抗氧化活性分析

八月瓜葉、果皮和果肉的抗氧化能力見圖2。

圖2 八月瓜葉、果皮和果肉的抗氧化能力分析Fig.2 Antioxidant activity analysis in Akebia trifoliate of leaves，peels and pulp

由圖2可知，八月瓜各部位提取物抗氧化活性差異較大，葉和果皮的抗氧化活性顯著高于果肉（P＜0.05），隨著質(zhì)量濃度增加，八月瓜葉、果皮和果肉抗氧化能力、總還原力和ABTS+自由基清除能力均呈顯著增加趨勢(shì)，且葉的抗氧化活性與果皮的差距變大，葉的ABTS+自由基清除能力是果皮的2 倍是果肉的3 倍。

回歸分析結(jié)果顯示，八月瓜葉、果皮和果肉對(duì)FRAP、ABTS+自由基清除能力和TRPA 均有較好的抗氧化活性，八月瓜葉質(zhì)量濃度與TRPA 的相關(guān)方程為：y=0.136x+0.537 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.985 5，果皮質(zhì)量濃度與TRPA 的相關(guān)方程為：y=0.128 3x+0.281 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 7，果肉質(zhì)量濃度與TRPA 的相關(guān)方程為：y=0.012 1x+0.030 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 4；八月瓜葉質(zhì)量濃度與FRAP 的相關(guān)方程為：y=0.788 7x+1.013 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.984 7，果皮質(zhì)量濃度與FRAP 的相關(guān)方程為：y=0.441 3x+1.246 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 2，果肉質(zhì)量濃度與FRAP 的相關(guān)方程為：y=0.037 7x+0.042 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.983 3；八月瓜葉質(zhì)量濃度與ABTS+自由基清除能力的相關(guān)方程為：y=14.568x+12.409，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 7，果皮質(zhì)量濃度與ABTS+自由基清除能力的相關(guān)方程為：y=11.673x+2.441 2，相關(guān)系數(shù) R2=0.981 3，果肉質(zhì)量濃度與ABTS+自由基清除能力的相關(guān)方程為：y=3.985x+2.431 1，相關(guān)系數(shù) R2=0.981 8。

2.5 酚類物質(zhì)及抗氧化活性的相關(guān)性分析

八月瓜葉、果皮和果肉的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示。

表3 八月瓜中各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients of different indices

總酚與綠原酸、阿魏酸呈極顯著正相關(guān)（r 分別為0.922 和 0.999），與兒茶素呈顯著正相關(guān)（r 為 0.880）；總黃酮與綠原酸、阿魏酸和總酚呈極顯著正相關(guān)（r 分別為 0.988、0.965 和 0.970）；TRPA 與兒茶素、阿魏酸、總酚和總黃酮呈極顯著正相關(guān)（r 分別為0.927、0.989、0.990 和0.931），與沒食子酸、綠原酸、p-香豆酸和抗壞血酸呈顯著正相關(guān) （r 分別為 0.826、0.869、0.835 和0.844）；FRAP 與阿魏酸、總酚、總黃酮和 TRPA 呈極顯著正相關(guān)（r 分別為 0.997、0.999、0.965 和 0.989），與兒茶素、綠原酸呈顯著正相關(guān)（r 分別為0.886 和0.913）；ABTS+自由基清除能力與兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗壞血酸、總酚、TRPA 和FRAP 呈極顯著正相關(guān)（r 分別為 0.962、0.891、0.965、0.901、0.966、0.990 和 0.970），與沒食子酸、鞣花酸、蘆丁、槲皮素和總黃酮呈顯著正相關(guān)（r 分別為 0.887、0.830、0.839、0.872 和 0.880）。

3 結(jié)論與討論

邵顯會(huì)[23]分析了三葉木通不同部位總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)黃酮含量從高到低依次是根（5.72%）＞葉（4.5%）＞果皮（2.0%）＞果肉（0.2%），張孟琴等[24]分析了三葉木通果皮黃酮含量（2.32%），本研究發(fā)現(xiàn)不同部位黃酮含量的總體趨勢(shì)和邵顯會(huì)等研究一致，但含量顯著低于邵顯會(huì)和張孟琴等報(bào)道，且總黃酮在果皮和葉中含量差異不顯著；歐陽(yáng)玉祝等[25]用離子沉淀法分離了果皮中總多酚，總多酚提取率為5.103 7%，顧仁勇等[26]響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2萃取八月瓜幼果多酚，八月瓜幼果多酚萃取得率可達(dá)6.41%，本研究發(fā)現(xiàn)八月瓜不同部位多酚含量的總體趨勢(shì)與陸俊等[27]的研究一致，但含量顯著低于文獻(xiàn)報(bào)道，本次試驗(yàn)八月瓜不同部位黃酮和總酚含量低于文獻(xiàn)報(bào)道的主要原因在于鮮樣、干樣中水分含量的不同、采樣地不同和提取方法的差異。Li L等[28]報(bào)道三葉木通鮮果肉中VC含量108 mg/100 g，白木通鮮果中VC含量930 mg/100 g，本研究發(fā)現(xiàn)八月瓜鮮果中VC含量2.47 mg/100 g，與文獻(xiàn)報(bào)道相差較大，主要原因在于果實(shí)的成熟度不同、品種不同和提取方法的差異；本試驗(yàn)中八月瓜果皮和葉中的VC含量未曾報(bào)道。近年來(lái)，前人對(duì)八月瓜酚類化合物的研究主要側(cè)重于總酚測(cè)定和一些新的酚醇類化合物的分離及藥用機(jī)制的研究[29-30]，但未研究八月瓜各部位中具體酚類成分含量及抗氧化活性，本研究發(fā)現(xiàn)八月瓜葉、果皮和果肉中酚類成分含量差異顯著（P＜0.05），主要酚類成分依次為沒食子酸、兒茶素、綠原酸、阿魏酸、鞣花酸、蘆丁和槲皮素，且各化合物在葉中含量最高，而綠原酸和表兒茶素在果皮中含量相對(duì)最高，果肉中各化合物含量相對(duì)低，p-香豆酸和蘆丁在八月瓜果肉和果皮中的含量差異不顯著（P＞0.05）；八月瓜葉、果皮均有較強(qiáng)的FRAP、TRPA 和ABTS+自由基清除能力，葉、果皮和果肉抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增加呈正相關(guān)增長(zhǎng)，葉和果皮的抗氧化活性顯著高于果肉，F(xiàn)RAP 和ABTS+自由基清除能力依次為葉＞果皮＞果肉，其中葉TRPA 含量是果皮、果肉的 1.5 倍和 15 倍，葉 FRAP 含量是果皮、果肉的1.4 倍和28.5 倍，葉ABTS+自由基清除能力是果皮、果肉的1.5 倍和2.8 倍，這與陸俊等[27]研究結(jié)果趨勢(shì)一致，但葉、果皮和果肉中FRAP 和ABTS+自由基清除能力與陸俊等測(cè)定結(jié)果相差較大；抗氧化活性（TRPA、FRAP、ABTS+自由基清除能力）與化學(xué)成分之間的相關(guān)性顯示，不同成分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)并不相同，TRPA 與兒茶素、阿魏酸、總酚和總黃酮呈極顯著正相關(guān)，與沒食子酸、綠原酸、p-香豆酸和抗壞血酸呈顯著正相關(guān)；FRAP 與阿魏酸、總酚和總黃酮呈極顯著正相關(guān)，與兒茶素、綠原酸呈顯著正相關(guān)；ABTS+自由基清除能力與兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗壞血酸和總酚呈極顯著正相關(guān)，與沒食子酸、鞣花酸、蘆丁、槲皮素和總黃酮呈顯著正相關(guān)。此外，抗氧化活性之間也顯示出顯著的相關(guān)性，表明抗氧化活性測(cè)定都是可靠和可互換的；黃酮和多酚含量之間也存在強(qiáng)相關(guān)，和金銀萍等[31]對(duì)五味子抗氧化能力與酚酸、總黃酮相關(guān)性研究中的結(jié)論一致。本研究發(fā)現(xiàn)VC、黃酮含量、總酚含量和個(gè)別酚類成分與抗氧化能力間有顯著相關(guān)性，因此八月瓜不同部位的抗氧化能力不一，且葉和果皮的抗氧化能力顯著高于果肉，可考慮作為天然抗氧化劑，用于美容護(hù)膚品、植物酚類保健品或者防止心腦血管疾病藥物的開發(fā)。

綜上分析，八月瓜葉、果皮、果肉中均含有活性物質(zhì)含量和抗氧化能力，且差異顯著，得出：酚類成分主要為沒食子酸、兒茶素、綠原酸、阿魏酸、鞣花酸、蘆丁和槲皮素，八月瓜葉和果皮有較強(qiáng)的FRAP、TRPA 和ABTS+自由基清除能力，葉和果皮抗氧化活性顯著高于果肉。相關(guān)性分析得到兒茶素、阿魏酸和總酚對(duì)TRPA 的測(cè)定值貢獻(xiàn)最強(qiáng)，阿魏酸、總酚和總黃酮對(duì)FRAP 的測(cè)定值貢獻(xiàn)最強(qiáng)，兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗壞血酸和總酚對(duì)ABTS+自由基清除能力的貢獻(xiàn)最強(qiáng)。各部位的抗氧化能力大小與VC、黃酮類、多酚和相應(yīng)酚類成分含量呈強(qiáng)相關(guān)關(guān)系。試驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明八月瓜由于不同部位化合物存在較大差異，對(duì)其開發(fā)利用時(shí)應(yīng)充分考慮各自優(yōu)勢(shì)，除可食用部分果肉外，合理利用八月瓜果皮和葉，解決果農(nóng)廢棄物處理難題，變廢為寶，對(duì)促進(jìn)八月瓜深加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展有深遠(yuǎn)的意義。