羊肚菌多糖的提取分離純化及保健功效研究進(jìn)展

羅倩，鄒榮燦，劉明月，向準(zhǔn)

（1.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550018；2.貴州省環(huán)境工程評(píng)估中心六盤水辦事處，貴州 六盤水 553001；3.六盤水市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，貴州 六盤水 553001；4.貴州省生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009）

羊肚菌系子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）真菌的總稱[1]，又名美味羊肚菌、羊肚子、陽(yáng)雀菌、蜂窩蘑、羊肚菜、草笠竹等，是世界公認(rèn)的美味食藥用菌，被譽(yù)為“菌中王子”，據(jù)《本草綱目》記載，羊肚菌具有化痰理氣、補(bǔ)腦提神、潤(rùn)胃健脾、補(bǔ)腎強(qiáng)身之功效。現(xiàn)代研究表明，羊肚菌富含酶、多糖、氨基酸、甾醇、有機(jī)酸等活性物質(zhì)，尤其是羊肚菌多糖越來(lái)越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，具有抗腫瘤[2-4]、抗疲勞[5]、抗衰老[6]、抗氧化[7-8]、降血脂[9]、調(diào)節(jié)免疫[10-11]、抗菌[12]等功效。因此，無(wú)論在其藥用還是保健領(lǐng)域，對(duì)羊肚菌多糖都具有重要的研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文基于對(duì)羊肚菌多糖的提取分離純化及保健功效的最新研究成果，對(duì)羊肚菌多糖的提取、分離純化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成及保健功效等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并分析各方法的優(yōu)勢(shì)和弊端，以期為羊肚菌多糖的深入研究及開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 羊肚菌多糖提取技術(shù)

1.1 熱水浸提法

矯麗曼[13]以熱水浸提法提取羊肚菌胞內(nèi)多糖（Morchella Intracellular Polysaccharide，MIP），并探究其最佳工藝，研究結(jié)果表明最佳工藝條件為：料液比1 ∶25（g/mL），提取溫度 90 ℃，浸提時(shí)間 2 h，95%乙醇沉淀，在此條件下，多糖得率為7.69%。并進(jìn)一步對(duì)MIP 純品的單糖組分分析表明，MIP 由D-甘露糖和D-半乳糖組成，摩爾比為1 ∶1.06。而鄭燕丹[14]通過(guò)液體深層發(fā)酵獲得羊肚菌菌絲體胞內(nèi)多糖的最佳提取工藝條件為：料液比 1 ∶15（g/mL），浸提溫度 90 ℃，浸提時(shí)間3 h，50%乙醇沉析。此法雖操作簡(jiǎn)單、條件溫和、對(duì)儀器設(shè)備要求低，但也存在提取率低，提取不完全等缺點(diǎn)。

1.2 超聲波輔助提取法

李美華等[15]采用超聲波輔助提取法提取粗柄羊肚菌菌絲體多糖、菌絲體發(fā)酵液濃縮提取胞外多糖。探究二者的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：菌絲體多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1 ∶20（g/mL），超聲溫度70 ℃，時(shí)間20 min，提取2 次；胞外多糖的最佳提取工藝條件為：濃縮倍數(shù)1 ∶5，濃縮溫度50 ℃，醇沉濃度95%，pH 值為6。在此條件下，菌絲體粗多糖平均含量為56.76 mg/g，胞外多糖平均含量為1.28 mg/g。畢博等[16]用相同方法探究尖頂羊肚菌多糖提取工藝為：超聲功率600 W，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間80 min，70%乙醇沉析，料液比 1 ∶40（g/mL），在此條件下，多糖得率為（2.25±0.04）%。顧旭鋒[17]探究的羊肝菌多糖提取最佳工藝條件為：超聲功率244 W，超聲提取時(shí)間24 min，料液比 1 ∶33.90（g/mL），pH 值 8.78，還進(jìn)一步證實(shí)羊肝菌多糖具有顯著的抗疲勞活性。而孟超等[18]對(duì)羊肚菌富硒多糖研究發(fā)現(xiàn)：料液比1 ∶40（g/mL），提取時(shí)間30 min，乙醇濃度90%，是羊肚菌多糖提取的最適方案。超聲波輔助提取羊肚菌多糖具有用時(shí)短、得率高、節(jié)省能源等優(yōu)點(diǎn)。但超聲波功率不易過(guò)高，否則會(huì)對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)及特性產(chǎn)生負(fù)面影響。

1.3 酶提法

酶提法是利用酶對(duì)基體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使細(xì)胞內(nèi)多糖有效的溶出，具有得率高，專一性好，不破壞多糖結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，Sun 等[19]探究酶提法提取富硒羊肚菌菌絲體多糖的最佳工藝條件，研究結(jié)果表明：在加酶量為1.5 %，提取時(shí)間2 h，酶解溫度40 ℃，料液比為1 ∶15（g/mL）的條件下，多糖提取率可達(dá) 11.26%，該工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可行，適用于富硒羊肚菌菌絲體多糖的提取。

1.4 滲透壓法

張嬌等[20]研究滲透壓法提取羊肚菌胞內(nèi)多糖工藝。以高濃度鹽溶液促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)壁分離，破壁劑破壁處理后，溶脹促進(jìn)多糖溶出。以硫酸-蒽酮顯色法測(cè)定多糖含量，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取確定滲透壓法最佳提取工藝條件為：浸提時(shí)間為120 min，NaCl濃度為20%，浸提溫度90 ℃，pH 值為7.00，在此條件下多糖得率為19.56%。該法具有成本低，得率高，獲得的目標(biāo)產(chǎn)物便于進(jìn)一步分離純化等特點(diǎn)。

1.5 高壓脈沖電場(chǎng)法

張玉等[21]利用高壓脈沖電場(chǎng)法對(duì)液體深層發(fā)酵產(chǎn)羊肚菌菌絲體胞內(nèi)多糖進(jìn)行提取和分離。并考察電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和料液比等因素對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果表明：多糖最佳提取工藝為：電場(chǎng)強(qiáng)度18 kV/cm，脈沖數(shù) 7，料液比 1 ∶27（g/mL），在此條件下多糖得率達(dá)56.03 μg/mL。并進(jìn)一步采用DEAE-52 纖維素離子交換柱和葡聚糖凝膠色譜純化，得到一種分子量高達(dá)2.48×106Da 的多糖F1。該法具有在多糖提取過(guò)程中，不產(chǎn)生熱量，不破壞多糖結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，用于羊肚菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、酶提法、滲透壓法、高壓脈沖電場(chǎng)法，不同的提取方法提取的多糖得率有一定差異，每個(gè)方法均具獨(dú)特的特點(diǎn)，因此，建議研究者應(yīng)根據(jù)自己研究的目的、要求、條件及環(huán)境選擇適合的方法進(jìn)行提取。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，一些新的提取技術(shù)，如超臨界CO2萃取法，雙水相萃取法等，這些方法尚未用于羊肚菌多糖的提取，能否提高羊肚菌多糖的得率有待進(jìn)一步研究。

2 羊肚菌多糖的分離純化

經(jīng)不同提取方法獲得的羊肚菌多糖常含有蛋白、色素、脂類等雜質(zhì)，需對(duì)其進(jìn)一步純化，脫蛋白的方法有Sevag 法、三氯乙酸法、柱層析法。Sevag 法的優(yōu)點(diǎn)是條件溫和、成本低、檢測(cè)速率快、不會(huì)使多糖降解，缺點(diǎn)是多糖易損失。三氯乙酸法脫蛋白較完全、效率高，但易使多糖降解，易殘留還會(huì)帶來(lái)安全問題；脫色的方法有活性炭脫色法、H2O2氧化法、離子交換樹脂法。H2O2氧化法較常用，該法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、不引入其他雜質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，但仍需對(duì)H2O2使用濃度嚴(yán)格控制，濃度過(guò)高不僅會(huì)帶來(lái)殘留問題，甚至?xí)茐亩嗵堑姆肿咏Y(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其生物活性?；钚蕴棵撋膬?yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，脫色成本低，但在吸附過(guò)程中也會(huì)損耗多糖。孫玉軍等[22]優(yōu)化羊肚菌胞外多糖的活性炭脫色工藝。以脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，考察活性炭用量、溫度、pH 值以及脫色時(shí)間。結(jié)果表明：活性炭脫色的最佳條件為活性炭用量2.00%、溫度50 ℃、pH 值5.00、脫色時(shí)間60 min，在此條件下，色素的脫除率為88.90%，多糖的保留率為84.30%，該脫色方法簡(jiǎn)便、易行，適合用于羊肚菌胞外多糖的脫色。

要進(jìn)一步探究羊肚菌多糖的組成、分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)特征，在脫色脫蛋白的基礎(chǔ)上還需深度分離純化，常用的分離純化方法有離子交換樹脂法、凝膠過(guò)濾柱色譜法、親和色譜法、膜分離法。Yang 等[23]從羊肚菌子實(shí)體中獲得一種新的多糖（MEP-1），經(jīng)脫蛋白、透析、DEAE-纖維素和Sephadex G-100 凝膠柱柱層析等手段純化后采用化學(xué)法、高效液相色譜法、紫外光譜法和紅外光譜法對(duì)多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，平均分子量為43 625 Da。

相對(duì)于傳統(tǒng)的分離技術(shù)，超濾膜分離技術(shù)具有諸優(yōu)點(diǎn)，如成本低、節(jié)能、效率高、環(huán)保，在室溫下可連續(xù)運(yùn)行等特點(diǎn)。李蔚等[24]探究超濾技術(shù)濃縮純化羊肚菌胞外多糖的最佳條件。以截留率和膜通量為參數(shù)，從超濾膜大小、超濾壓力、超濾溫度3 個(gè)因素優(yōu)選最佳超濾條件。結(jié)果表明：用截留Mr 10×103的超濾膜，超濾壓力0.10 MPa，超濾溫度20 ℃，在此條件下，胞外多糖截留率達(dá)到95.72%。

3 羊肚菌多糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)組成

分析羊肚菌多糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)組成是研究其保健功效的重要前提，多糖的理化性質(zhì)與其相對(duì)分子質(zhì)量具有重要的關(guān)系見表1。

表1 羊肚菌多糖的純化手段、相對(duì)分子質(zhì)量及單糖組成Table 1 Purification methods，molecular weights and monosaccharide composition of Morchella polysaccharides

由表1可知，羊肚菌多糖為一種復(fù)合雜多糖，不同研究者研究的羊肚菌多糖的單糖組成，比例、種類等有一定差異，可能是原料的來(lái)源，提取方法及純化手段不同導(dǎo)致。

4 羊肚菌多糖的保健功效

4.1 抗腫瘤

癌癥已嚴(yán)重威脅人類的生命，現(xiàn)代研究表明羊肚菌多糖的具有顯著的抗腫瘤活性，Liu 等[2]采用高壓脈沖電場(chǎng)法獲得羊肚菌多糖，并探究其對(duì)人結(jié)腸癌TH-29 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性，研究結(jié)果表明，羊肚菌多糖具有顯著抑制人結(jié)腸癌TH-29 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且多糖的量越大抑制效果越明顯。LI 等[3]用羊肚菌與豆渣發(fā)酵獲得羊肚菌粗多糖，經(jīng)DEAE-Sephadex A-50 柱層析和Sephadex G-100 純化后獲得多糖組分MP-1，MP-3 和 MP-4，并對(duì)巨噬細(xì)胞（RAW267.4）、人肝癌細(xì)胞（HepG-2）、人宮頸癌細(xì)胞（HeLa 細(xì)胞）的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，MP-3 能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞的免疫活性，MP-1 能有效抑制人肝癌細(xì)胞（HepG-2）的增長(zhǎng)，當(dāng)濃度為 50 μg/mL 時(shí)，抑制率為 68.01%。MP-1，MP-3 和 MP-4 能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞（HepG-2）和宮頸癌細(xì)胞（HeLa 細(xì)胞）的凋亡。李謠等[4]以黑脈羊肚菌多糖為原料，研究羊肚菌多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明：在無(wú)細(xì)胞毒性范圍內(nèi)，羊肚菌多糖能顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA 的增殖，半數(shù)有效濃度0.10 mg/mL，同時(shí)人乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出多種細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。

4.2 抗疲勞

段巍鶴等[5]以水提法獲得羊肚菌胞外、胞內(nèi)多糖并對(duì)小鼠應(yīng)急性一次灌胃處理后進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，胞外多糖組和胞內(nèi)多糖組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組比較均具有顯著性差異（P＜0.05），胞外多糖組為（16.05±0.44）min，胞內(nèi)多糖組為（14.56±2.86）min，對(duì)照組為（6.39±1.43）min，說(shuō)明胞外多糖、胞內(nèi)多糖對(duì)小鼠應(yīng)急攝入后具有明顯的抗疲勞作用。

4.3 抗衰老

馬利等[6]以不同濃度尖頂羊肚菌Morchella conica Pers.胞外多糖提取物作用人皮膚成纖維細(xì)胞（human skin fibroblasts，HSF），檢測(cè)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性、羥脯氨酸含量的影響，研究結(jié)果表明，125 μg/mL 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物使HSF 細(xì)胞活力增加了25.20%，羥脯氨酸含量增加了12.10%，β-半乳糖苷酶活性降低了48.10%。說(shuō)明適宜濃度尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有促進(jìn)HSF細(xì)胞增殖、膠原蛋白合成，延緩細(xì)胞衰老的作用。

4.4 抗氧化

鮑敏等[7]利用粗柄羊肚菌菌絲體進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，提取胞外多糖，并對(duì)胞外多糖體外抗氧化作用進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明：粗柄羊肚菌在1 mg/mL 時(shí)對(duì)DPPH 自由基和羥自由基以及超氧陰離子的清除率分別達(dá)到61.10%，32.80%和71.60%。表明，粗柄羊肚菌胞外多糖具有明顯的抗氧化能力，具有開發(fā)為抗氧化類食品或藥品的潛力。Fu 等[8]同樣驗(yàn)證羊肚菌胞外多糖具有很強(qiáng)的清除自由基能力，能有效抑制血清丙二醛的形成，提高抗氧化酶的活性，且總抗氧化能力與多糖呈量效關(guān)系。

4.5 降血脂

明建等[9]對(duì)羊肚菌子實(shí)體多糖PMEP-1 降血脂作用進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMEP-1 顯著降低了高脂大鼠的血清甘油三酯水平、血清低密度脂蛋白膽固醇和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，說(shuō)明PMEP-1 具有降血脂作用，同時(shí)對(duì)冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化也有一定的預(yù)防作用。

4.6 免疫調(diào)節(jié)

Su 等[10]采用 DEAE 纖維素和 Sephacryl S-300 HR色譜分離從羊肚菌中獲得羊肚菌水溶性多糖（Morchella Water-soluble polysaccharides，MCP），并評(píng)價(jià)其免疫活性，結(jié)果表明，提取的MCP 可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)NO的生成，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，經(jīng)高效液相色譜、紅外光譜和核磁共振譜分析表明，MCP 是均一的甘露聚糖，分子量為81.20 kDa，可作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。Huang 等[11]從尖頂羊肚菌中提取胞內(nèi)多糖和胞外多糖，也具有很好的免疫活性，50 μg/mL～200 μg/mL 的胞外多糖和 25 μg/mL～200 μg/mL 的胞內(nèi)多糖顯著抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NO 的產(chǎn)生。

4.7 抗菌

龍正海[12]等對(duì)羊肚菌子囊果多糖（Ascocarp polysaccharides）、菌絲體胞內(nèi)多糖（Mycelium intracellular polysaccharides）、胞外多糖（Extracellular polysaccharides）進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，羊肚菌多糖對(duì)大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 以及放線菌Actinomycesbovis 的抗菌活性都比較強(qiáng)，而對(duì)霉菌Moulds 和酵母菌saccharomyce 的抗菌作用不明顯。結(jié)論：3 種羊肚菌多糖均具有比較明顯的抗細(xì)菌、抗放線菌活性。

5 展望

羊肚菌為世界性寶貴的食藥用真菌，具有非常高的食用、藥用價(jià)值。在食品、藥品和保健品領(lǐng)域具有極大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)代研究表明，用于羊肚菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、酶提法、滲透壓法、高壓脈沖電場(chǎng)法；分離純化方法有離子交換樹脂法、凝膠過(guò)濾柱色譜法、親和色譜法，膜分離法。以上方法各具獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和弊端，建議研究者根據(jù)研究的目的、要求、條件及環(huán)境對(duì)其合理選擇。試驗(yàn)表明羊肚菌多糖具有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、抗氧化、降血脂、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功效。盡管羊肚菌多糖的保健功效已被大量試驗(yàn)證實(shí)，但仍存在一些問題亟須解決：1）羊肚菌多糖藥理活性的作用機(jī)制尚未明確，多數(shù)保健功效僅以粗提物試驗(yàn)，對(duì)于如何開發(fā)符合臨床需求的藥物，還有待進(jìn)一步深入研究；2）羊肚菌多糖的結(jié)構(gòu)研究還處于一級(jí)結(jié)構(gòu)中單糖的組成階段，對(duì)于高級(jí)結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系、代謝機(jī)理等研究鮮有報(bào)道，有待進(jìn)一步深入研究；3）目前羊肚菌栽培主要以六妹羊肚菌Morchella sextelata 和梯棱羊肚菌Morchellaimportuna 為主，七妹羊肚菌Morchella septimelata 也有少量種植[32]，對(duì)于其它品種羊肚菌的規(guī)?；N植鮮有報(bào)道。到目前為止，羊肚菌的規(guī)模種植還存在產(chǎn)量不穩(wěn)定、可重復(fù)性不高等問題。原因是羊肚菌易受氣候條件、生長(zhǎng)環(huán)境、自然災(zāi)害等影響，基于羊肚菌多糖的開發(fā)利用，攻克羊肚菌的人工規(guī)模化栽培迫在眉睫；4）以羊肚菌為原料開發(fā)的食品、保健品及藥物制劑有具有保健功能的羊肚菌罐頭[33]、羊肚菌茶[34]、保健酒[35]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞的羊肚菌多糖顆粒劑[36]，預(yù)防或治療更年期障礙的藥劑[37]、但在市場(chǎng)上可見的羊肚菌產(chǎn)品仍然甚少，羊肚菌及羊肚菌多糖的開發(fā)利用及產(chǎn)品的工業(yè)化還需進(jìn)一步加快步伐，具有巨大的市場(chǎng)前景。