美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP4蛋白中和活性單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定

劉夢瑩，李敏華，王 倩，田志軍*，周倫江,3*

(1.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350002；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點豬病實驗室，黑龍江哈爾濱150069；3.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于套式病毒目(Nidovirales)，是引起母豬發(fā)熱、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙與呼吸道疾病的傳染病病原。目前國內(nèi)流行的類NADC30株屬于PRRSV 5亞群，主要以基因缺失和基因重組多樣性為特征[1]。PRRSV的糖蛋白GP4有4個糖基化位點，這些位點突變影響PRRSV的毒力，同時GP4在病毒復制中也起重要作用[2]。有研究表明GP4是PRRSV感染及產(chǎn)生中和抗體的重要糖蛋白，其胞外域可能是產(chǎn)生中和抗體的相關位點[3]。而目前對于PRRSV具有中和活性的單克隆抗體(MAb)的制備與研究鮮有報道。本研究制備了具有中和活性的抗PRRSV GP4的MAb，為了解PRRSVGP4蛋白的結(jié)構(gòu)功能具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 PRRSV SD53株(類NADC30 PRRSV株)、疫苗株 HuN4-F112、CH-1R、MLV、TJM-F92、JXA1-R、歐洲株DV由本實驗室提供；PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒(p3XFLAG-CMV-GP2、p3XFLAG-CMV-GP3、p3XFLAG-CMV-GP4、p3XFLAGCMV-GP5、p3XFLAG-CMV-M 和 p3XFLAG-CMV-N)、pGEX-6P-1、Marc-145細胞、SP2/0骨髓瘤細胞、293T細胞、受體菌 TG1、Rosetta(DE3)、HPPRRSV M蛋白MAb 3F7均由本實驗室構(gòu)建并保存；IPTG購自北京索萊寶科技有限公司；融合劑PEG、FITC標記山羊抗小鼠IgG(IgG-FITC)購自Sigma公司；GST MAb購自TIANGEN公司；DyLightTM800標記的羊抗鼠IgG購自KPL公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；IgG抗體亞類鑒定試劑盒購自Thermo Fisher公司；BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase購自TaKaRa公司；SPF級BALB/c雌鼠購自北京維通利華公司。

1.2 PRRSV GP4蛋白MAb的制備與鑒定 將美洲型PRRSV SD53株接種于Marc-145細胞中，待細胞病變(CPE)至80%～90%后，反復凍融，將超速離心的病毒作為免疫原，按照文獻[4]對小鼠免疫和細胞融合。以感染PRRSV SD53株的Marc-145細胞為抗原制備細胞涂片，同時設HP-PRRSV M蛋白MAb 3F7為陽性對照，SP2/0細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，以山羊抗小鼠IgG-FITC(1:120)作為二抗，通過間接免疫熒光試驗(IFA)篩選陽性雜交瘤細胞。將PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，將收獲的表達PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白的細胞作為檢測抗原，參照上述IFA方法鑒定陽性雜交瘤細胞與其反應的結(jié)構(gòu)蛋白。將分泌MAb的雜交瘤細胞體外連續(xù)傳10代并凍存于液氮中，每代雜交瘤細胞以及凍存6個月的陽性雜交瘤細胞均采用上述IFA檢測雜交瘤細胞分泌MAb的穩(wěn)定性。根據(jù)文獻[5]制備小鼠腹水凍存于-70℃。制備的MAb按照試劑盒說明鑒定其亞類。

1.3 MAb識別的抗原表位的鑒定及序列分析 已報道的PRRSV GP4蛋白最長的表位含有11個氨基酸[6]，將包含最長表位的GP4分成部分重疊的GP4-1、GP4-2和GP4-3 3個片段(表1)，各片段均經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切后克隆于pGEX-6p-1載體中。含有pGEX-GP4-1/2/3的重組菌Rosetta(DE3)經(jīng)IPTG誘導后裂解，以MAb腹水(1∶10 000)為一抗，DyLight 800TM標記羊抗鼠 IgG(1∶10 000)為二抗，western blot鑒定MAb識別的片段，將識別的陽性片段再逐步截短表達，直到篩選到最小的抗原表位。

參照GenBank中28株國內(nèi)外PRRSV分離株GP4的氨基酸序列，利用DNAStar比對分析本研究制備的MAb識別的抗原表位在不同參考株間的差異。將與PRRSV SD53株GP4氨基酸序列中的該抗原表位存在差異的部分PRRSV株接種Marc-145細胞，按照上述IFA檢測與該MAb反應的PRRSV，并分析MAb識別的表位的保守性。

1.4 MAb中和活性的檢測 采用固定病毒稀釋抗體法，將雜交瘤細胞注射5只小鼠后分別制備的腹水經(jīng)2倍倍比稀釋。分別取200 TCID50的PRRSV SD53株、HuN4-F112株、CH-1R株、MLV株、TJM-F92株、JXA1-R株病毒液與等體積不同稀釋度的小鼠腹水混合，37℃水浴感作1 h。將各病毒與腹水的混合物接種96孔板培養(yǎng)48 h后的Marc-145細胞，每孔100 μL(含100 TCID50各病毒)。同時以接種SP2/0骨髓瘤細胞制備的腹水與病毒液混合物為陰性對照，以分別接種PRRSV SD53株、HuN4-F112株、CH-1R株、MLV株、TJM-F92株、JXA1-R株病毒液為病毒對照，以未接種的細胞為細胞對照。37℃培養(yǎng)5 d，觀察擴增CPE，采用Reed-Muench法計算腹水的中和效價。

表1 擴增PRRSV SD53不同長度GP4基因的引物

2 結(jié)果與討論

2.1 GP4 MAb的制備與鑒定 經(jīng)IFA篩選獲得一株與PRRSV SD53呈陽性反應的雜交瘤細胞株，將其命名為LM26(圖1)。將陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與轉(zhuǎn)染PRRSV各結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)粒的293T細胞進行IFA檢測，結(jié)果顯示，獲得的MAb LM26僅與GP4蛋白反應出現(xiàn)綠色熒光(圖1)，表明，LM26是針對PRRSV GP4蛋白的MAb。將每代陽性雜交瘤細胞及將凍存6個月的陽性雜交瘤細胞經(jīng)IFA檢測均為陽性。表明獲得了穩(wěn)定分泌PRRSV GP4蛋白的MAb LM26。經(jīng)抗體亞類鑒定，LM26為IgG2a亞類，輕鏈為κ鏈。

2.2 MAb識別的抗原表位鑒定與序列分析 將一系列截短的GP4重組蛋白作為抗原，進行western blot鑒定，結(jié)果顯示 GP4-1(aa1～aa70)和 GP4-2(aa48～aa123)能夠被 LM26識別，重疊部分為aa48～aa70；進一步將重疊部分截為3段F1、F2、F3，結(jié)果顯示，LM26識別F3(aa54～aa65)片段，進而將F3從N-端、C-端逐個缺失氨基酸(P1～P7、S1～S7)，顯示LM26與P1、P2、S1、S2發(fā)生特異性結(jié)合，與其余片段均不反應(圖2A)，表明LM26 MAb識別的氨基酸序列為57VVLQDI62。將該序列與在GenBank中下載的28株國內(nèi)外PRRSV株GP4氨基酸序列比對，結(jié)果顯示GP4的aa57～aa62在HP-PRRSV株以及類NADC30 PRRSV株中高度保守；在經(jīng)典PRRSV株(CH-1R、MLV)中存在2個突變位點，分別是V57A和Q60H；在歐洲PRRSV株(DV)中存在1個突變位點V57M。IFA檢測結(jié)果顯示，LM26與經(jīng)典株CH-1R、MLV反應，推測該表位在發(fā)生V57A和Q60H突變后仍能夠被LM26識別；而LM26與歐洲株DV不反應，推測V57M突變影響了LM26與表位的識別(圖 2B)。由此推測V57A、Q60H突變不影響LM26對抗原表位的識別，因此該表位在美洲型PRRSV中相對保守。

2.3 MAb中和活性的檢測結(jié)果 在Marc-145細胞中接種MAb LM26制備的腹水與各PRRSV病毒液混合物，觀察接種后的細胞出現(xiàn)CPE情況，按Reed-Muench法計算其中和效價。結(jié)果顯示，經(jīng)5只小鼠制備的MAb LM26的腹水僅對SD53株具有中和活性，中和效價最低為1∶6，最高為1∶50；表明，不同小鼠制備的MAb，其中和效價也不相同，MAb的中和效價與小鼠個體差異有關。該腹水對HuN4-F112株、CH-1R株、MLV株、TJM-F92株、JXA1-R株不具有中和活性。表明，LM26僅針對PRRSV SD53株具有中和活性。

為了保持病毒蛋白良好的免疫原性，保持其天然構(gòu)象[7]，本研究采用PRRSV SD53株超離病毒為免疫原免疫小鼠，免去了體外表達蛋白的繁瑣過程。本研究豐富了PRRSV的MAb庫，并且為探究PRRSV GP4的抗原結(jié)構(gòu)奠定了基礎。