血清4型雞腺病毒AHHN分離株全基因組測序及其致病性研究

李允章，梅 楠，汪 凱，楊志偉,，王桂軍，劉紅梅*，陳鴻軍*

(1.安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥230036；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科，但其病毒屬尚未確定。按照FAdV群特異性抗原不同，將FAdV屬分成3個群：I群、II群和Ⅲ群FAdV，從雞群中分離的I群FAdV(FAdV-I)被劃分為A～E 5個亞群，共有12個血清型(FAdV 1-12)[1]，其中FAdV-I C亞群中有兩個成員分別為FAdV-4和FAdV-10[2]。FAdV-I在全球各地頻繁零星暴發(fā)，主要引起非典型病變和亞臨床癥狀，表現(xiàn)為肝炎、再生障礙性貧血、出血、生產(chǎn)性能下降，嚴重的造成雞包涵體肝炎、心包積液綜合征、肌胃糜爛和潰瘍等[3-4]。

自2015年以來，國內暴發(fā)了一種引起包涵體肝炎和心包積液綜合征的高致病性FAdV感染，主要侵害3周齡～5周齡肉雛雞以及10周齡～20周齡蛋雞。該病多呈急性發(fā)病，死亡率為30%～80%，有的甚至達到100%，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[5]。本實驗室在2016年自安徽淮南某雞場患有心包積液綜合征的死亡雞中分離獲得一株初步鑒定為I群C亞群雞腺病毒血清4型(FAdV-4)的病毒株，命名為AHHN株，本研究對其全基因組序列進行了測定和致病力分析，為闡明FAdV-I毒力增強分子機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.2 分離株全基因組擴增及序列分析 根據(jù)Gen-Bank中FAdV-4經(jīng)典無毒力ON1株(GU88428)全基因組序列設計引物(表1)。利用基因組DNA提取試劑盒提取I群C亞群FAdV-4 AHHN株DNA為模板，采用每對引物分別進行擴增，PCR擴增片段經(jīng)電泳分離后回收目的條帶，由蘇州金唯智公司測序，將測序獲得的DNA序列采用DNAStar軟件拼接獲得分離株的全基因組序列，參照GenBank中相關序列對其全基因進行比對分析。

1.3 病毒致病性試驗 將16只7日齡的SPF雞分成兩組，分別為病毒感染組和對照組，每組8只。感染組SPF雞采用FAdV-4 AHHN分離株以1×105TCID50/100 μL經(jīng)肌肉注射，對照組雞經(jīng)肌肉注射100 μL PBS溶液。每天觀察雞的臨床癥狀，記錄發(fā)病死亡情況，將死亡雞剖檢，采集其心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管等組織臟器。感染21 d后，迫殺剩余實驗雞，無菌操作采集上述臟器。將上述所有臟器分別研磨后，倍比稀釋接種LMH，測定各臟器的平均病毒載量(TCID50/mg)。另外，取感染組死雞和對照組雞肝臟組織，經(jīng)10%福馬爾林溶液固定后用于制備病理組織切片，H&E染色后觀察組織病變。

表1 FAdV-4全基因組擴增引物

2 結果與討論

2.1 FAdV-4 AHHN分離株的全基因組測序 根據(jù)FAdV-4無毒力ON1株設計引物，分別擴增AHHN分離株的38個PCR片段，結果顯示：各個PCR產(chǎn)物大小均與預期相符(圖略)。測序后利用SeqMan軟件拼接成全基因組序列，結果顯示：AHHN分離株全長43 723 bp，G+C含量為54.87%(GenBank登錄號為KY379035)。序列分析進一步確認分離株屬于禽腺病毒C亞群血清4型(圖1)，將AHHN分離株與經(jīng)典無毒力株ON1的基因序列比對，AHHN分離株主要存在于以下基因和片段的缺失和變異：在結構蛋白pVI基因非編碼區(qū)第19 530 nt～19 551 nt，GAGA基序長度不同，AHHN株存在10個GA序列重復，病毒株ON1為5個重復；AHHN分離株ORF19全基因缺失，ORF29基因部分區(qū)域缺失，缺失區(qū)域與JS07病毒株相同[6]。該病毒基因組其它部分與ON1株僅少數(shù)堿基存在差異。以上實驗結果表明，該分離株屬于FAdV-4型變異株。但部分基因的缺失是否會造成毒力增強或者減弱，這有待進一步研究論證。

2.2 FAdV-4分離株的致病性試驗 AHHN分離株注射8只3周齡SPF雞后觀察發(fā)現(xiàn)，感染2 d后，雞群開始發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神萎靡，羽毛蓬亂，白色水樣下??；5 d內感染組的雞全部死亡。對病死雞剖檢發(fā)現(xiàn)：肝臟土黃色腫大、質脆，表面有斑點狀出血；心包腔積有淡黃色清亮透明滲出液；脾臟暗紅色腫脹；腺胃黏膜脫落、糜爛；十二指腸黏膜脫落、出血；盲腸出血嚴重，腎臟腫大。選取感染組病死雞和對照組雞的肝組織，進行病理切片檢測，結果顯示：AHHN分離株感染組雞的肝細胞排列紊亂，有灶狀壞死，病變細胞核濃染，核內能見到嗜堿性包涵體，形狀呈圓形或不規(guī)則形。而對照組雞各項檢查組織結構正常。病毒載量檢測結果顯示，感染組雞各臟器病毒滴度均高于104TCID50/mg，其中肝臟的病毒載量最高，平均滴度達7.75×107TCID50/mg(圖2)。表明FAdV-4 AHHN分離株對雞具有高致病性及廣泛的組織嗜性。

國內FAdV-I目前呈現(xiàn)大范圍流行趨勢，除了血清4型變異株，還有8型、10型等多個血清型[7]。對于高致病性FAdV-4的分子致病機制研究至今尚不深入，通過比較差異病毒株基因序列，初步分析hexon、fiber-1、fiber-2、52K、 GAGA 基 序 區(qū) 、ORF29等部分基因極可能與毒力有關。利用CRISPR-Cas9技術和同源重組等技術靶向敲除基因組片段，對于FAdV的分子致病性研究具有重要意義。本研究初步對I群C亞群FAdV-4 AHHN分離株全基因組序列進行了測定，確認其為血清4型變異株，并初步對其致病力進行分析，為闡明FAdV-I毒力增強分子機制研究奠定了基礎。