豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)
--10年回眸

韓玉瑩，李永鋒，謝利豹，仇華吉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

1 豬瘟及C株疫苗概況

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是豬的一種以高熱稽留和廣泛性出血為主要特征的高度傳染性疾病，給許多國家的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入須申報(bào)(Notifiable)的動(dòng)物疫病名錄。在國務(wù)院印發(fā)的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》中，將豬瘟列為5種優(yōu)先防治的“一類動(dòng)物疫病”之一。

豬瘟病毒(CSFV)是CSF的病原，它是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員。CSFV為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約12.3 kb，包含5'非編碼區(qū)(Untranslated region，UTR)、一個(gè)長的開放閱讀框(ORF)和3'UTR。該ORF編碼由3 898個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，這一多聚蛋白在細(xì)胞和病毒蛋白酶的作用下裂解為12個(gè)成熟的病毒蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，其中Erns、E1和E2為病毒的囊膜蛋白[2-3]。

目前，我國主要采取免疫接種的措施來預(yù)防豬瘟，常用的疫苗為豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株或HCLV株)。C株是我國學(xué)者在20世紀(jì)50年代通過將CSFV強(qiáng)毒株在兔體內(nèi)連續(xù)傳480余代后培育而成的，該疫苗株集高度安全性和良好免疫原性于一身，可以同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對各種年齡的家豬和野豬均安全，并且能夠保護(hù)不同年齡的豬抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊[4]。由于C株性能穩(wěn)定、安全性和免疫效果良好，在國際上被公認(rèn)為安全有效的弱毒疫苗。早在20世紀(jì)60年代，C株從我國引入東歐和亞洲國家，被稱為“K株”或“LC株”，隨后又傳到西歐和拉美各國，其為世界豬瘟的防控做出了重大貢獻(xiàn)[5]。時(shí)至今日，C株仍被世界上許多國家使用，其地位和價(jià)值至今無可動(dòng)搖。

憑借嚴(yán)格的防控計(jì)劃和撲殺政策，北美及歐洲部分發(fā)達(dá)國家已經(jīng)消滅了豬瘟[1]，我國也將豬瘟凈化工作提上日程。早在2012年，農(nóng)業(yè)部制訂的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)則(2012～2020)》中，確定我國動(dòng)物疫病防治的總體目標(biāo)與任務(wù)，提出將豬瘟作為我國優(yōu)先防治的一類動(dòng)物疫病之一，對我國豬瘟的凈化和防控提出了指導(dǎo)性意見和具體的凈化策略。該規(guī)劃明確指出：在2015年我國部分區(qū)域需達(dá)到豬瘟凈化標(biāo)準(zhǔn)，原種豬場達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)；2020年進(jìn)一步擴(kuò)大凈化區(qū)域，全國所有種豬場達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。2017年，根據(jù)《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》要求，農(nóng)業(yè)部組織制定了《國家豬瘟防治指導(dǎo)意見(2017～2020年)》，要求“在不斷提高養(yǎng)殖場(戶)防疫能力的基礎(chǔ)上，到2020年底，全國所有種豬場和部分區(qū)域達(dá)到豬瘟凈化標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)一步擴(kuò)大豬瘟凈化區(qū)域范圍”的目標(biāo)。

就當(dāng)前形勢來看，我國豬瘟凈化的工作勢在必行，配合凈化豬瘟的技術(shù)支持也應(yīng)該到位。眾所周知，C株在豬瘟防控過程中發(fā)揮著重要作用，但是由于其不具備標(biāo)記功能，不能區(qū)分疫苗接種和野毒感染(DIVA)，這使得C株在豬瘟凈化工作中面臨巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)階段，如何賦予C株疫苗DIVA特性是眾多科學(xué)家努力的方向。我國科學(xué)家在此方面進(jìn)行了大膽的探索，開展了一系列的研究工作，旨在將C株改造為標(biāo)記疫苗株，以達(dá)到DIVA的目的。本研究團(tuán)隊(duì)曾全面回顧了C株問世后50余年的研究進(jìn)展[4]，本文將在其基礎(chǔ)上對C株最近10余年的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 對C株的再認(rèn)識

2.1 C株的來源 C株是由我國老一輩科學(xué)家將CSFV強(qiáng)毒株在兔體內(nèi)連續(xù)傳數(shù)百余代獲得的[4]，其獨(dú)特的研制歷程堪稱為疫苗史上的一座豐碑。但由于其年代久遠(yuǎn)，其原始病毒株已無從考證。10多年前，有學(xué)者認(rèn)為，1945年在中國分離的石門(Shimen)強(qiáng)毒株是C株的親本病毒[6]，但后來Xia等通過對Shimen株和C株的全基因組測序顯示，C株與Shimen株的親緣關(guān)系并不近。因此沒有足夠的證據(jù)證實(shí)之前的說法[7]。隨后，科學(xué)家們?yōu)榱颂骄控i瘟兔化弱毒疫苗株之間的親緣關(guān)系，對包括Rovac及C株在內(nèi)的多個(gè)疫苗株進(jìn)行了測序分析，結(jié)果顯示，早期的豬瘟兔化疫苗株Rovac與C株之間并無親緣關(guān)系[8]。時(shí)至今日，C株的來源仍然是個(gè)謎。

2.2 C株適應(yīng)家兔的分子機(jī)制研究 病毒經(jīng)過多次傳代后可以獲得對細(xì)胞或異種宿主的適應(yīng)性。例如，經(jīng)過多次傳代后獲得了細(xì)胞適應(yīng)性的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus， HCV)，其滴度比親本病毒約高1 000倍[9]。病毒的囊膜蛋白在病毒對細(xì)胞或異種宿主的適應(yīng)性中起重要作用。例如，HCV囊膜蛋白中3個(gè)位點(diǎn)的突變使其獲得了對小鼠肝細(xì)胞的適應(yīng)性[10]。許多弱毒疫苗株是將病毒在細(xì)胞或異種宿主中經(jīng)多次傳代培育而成的，如C株、山羊化兔化牛瘟弱毒疫苗和馬傳染性貧血弱毒疫苗等。這些疫苗為我國豬瘟的防控及牛瘟和馬傳貧的凈化做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，迄今為止關(guān)于這些弱毒疫苗株適應(yīng)細(xì)胞或異種宿主的確切機(jī)制尚不明確。

C株特有的創(chuàng)制過程賦予了其在家兔中獨(dú)特的生物學(xué)特性。與CSFV Shimen強(qiáng)毒株相比，C株可以在家兔脾臟和淋巴結(jié)組織中復(fù)制引起家兔的定型熱反應(yīng)。研究CSFV適應(yīng)家兔的機(jī)制，有利于揭示CSFV跨越種間障礙在非易感動(dòng)物中增殖的機(jī)制，也能夠?yàn)榻?dòng)物模型提供新思路。本研究團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建了一系列C株和Shimen株UTR互換的嵌合病毒，并利用家兔評價(jià)了這些嵌合病毒的生物學(xué)特性。研究顯示，病毒基因組的UTR是C株引起家兔定型熱反應(yīng)所必需的，而病毒編碼區(qū)決定了C株對家兔的適應(yīng)性[11]。最近，本研究團(tuán)隊(duì)將CSFV Shimen株與C株的Erns、E1和E2蛋白基因互換構(gòu)建了一系列嵌合病毒以及包含E2蛋白不同氨基酸突變的突變體病毒并在家兔體內(nèi)對其進(jìn)行了評價(jià)。該研究顯示，以Shimen強(qiáng)毒株為骨架，包含C株Erns-E1-E2、Erns-E2和E1-E2的嵌合病毒可以在家兔脾臟中復(fù)制，表明C株E2蛋白與Erns或E1賦予C株對家兔的適應(yīng)性；E2蛋白結(jié)構(gòu)域I中第108P和第109T是C株適應(yīng)家兔所必需的[12]。盡管目前C株適應(yīng)家兔的分子基礎(chǔ)得到了較明確的解析，然而其適應(yīng)家兔的分子機(jī)制尚未取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，還需要本團(tuán)隊(duì)深入的探究。

2.3 C株致弱機(jī)制的研究 CSFV從無毒力株到能夠引起100%死亡率的高毒力株均有[13]，其中C株是將CSFV強(qiáng)毒株在家兔體內(nèi)連續(xù)傳代最終獲得的弱毒疫苗株。但對于C株的致弱機(jī)制，即CSFV強(qiáng)毒株是如何在家兔體內(nèi)致弱的并不清楚。不過，最近取得的一些研究成果對C株致弱機(jī)制提供了新的視野。

已有研究顯示，C株3'UTR中存在12 nt的插入序列，而在其它CSFV強(qiáng)毒株中不存在該序列。為了研究12 nt的插入對病毒的復(fù)制以及毒力的影響，研究者以強(qiáng)毒Shimen株為骨架，在3'UTR中引入12 nt的插入或者用C株3'UTR替換Shimen株3'UTR構(gòu)建了兩株嵌合病毒。研究顯示，在PK-15細(xì)胞中兩株嵌合病毒的最大滴度比親本病毒Shimen株下降約100倍。體內(nèi)感染試驗(yàn)顯示，這兩種嵌合病毒表現(xiàn)出與C株類似的特性，可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體并完全保護(hù)豬免受強(qiáng)毒的攻擊。這些數(shù)據(jù)表明，C株3'UTR中12 nt的插入足以減弱CSFV的毒力，這在一定程度上揭示了C株致弱的分子基礎(chǔ)[14]。最新的研究數(shù)據(jù)顯示，CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E2氨基酸序列中T745I和M979K的突變與病毒的致病性密切相關(guān)。利用反向遺傳操作平臺，研究者拯救了突變病毒vSM/CE2/T745I、vSMCE2/M979K和vSM/CE2/T745I-M979K。動(dòng)物試驗(yàn)表明，T745I和M979K這兩個(gè)點(diǎn)突變提高了病毒的復(fù)制水平，而且這2個(gè)殘基在vSM/CE2的體外復(fù)制和體內(nèi)致病性發(fā)揮了關(guān)鍵作用[15]。

綜上所述，科學(xué)家們在病毒的層面部分解析了C株的致弱機(jī)制。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，相比CSFV強(qiáng)毒株，C株E2蛋白第37D的突變使其失去了拮抗宿主蛋白Trx2介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的能力，這可能是C株致弱的一個(gè)重要機(jī)制[16]；最近還發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒Shimen株和C株接種豬后，其干擾素、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IL-10等的應(yīng)答存在明顯差異[17]。這些數(shù)據(jù)從全新的角度闡明了C株可能的致弱機(jī)制。

2.4 C株對部分豬瘟病毒株不能提供完全保護(hù) 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所對我國豬瘟分子流行病學(xué)研究的數(shù)據(jù)顯示，我國流行的CSFV分屬為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3個(gè)基因型，1.1、2.1、2.2、2.3和3.4 5個(gè)基因亞型。我國大陸的E2基因序列大部分屬于Ⅱ型，其中2.1亞型占到了一半以上[18]。2.1基因亞型病毒株具有遺傳多樣性，涂長春研究員團(tuán)隊(duì)的研究分析顯示，2.1亞型又進(jìn)一步分為10個(gè)亞亞型(2.1a-2.1j)。除了2.1d僅流行于印度外，其它9個(gè)亞亞型在中國及其周邊國家流行，甚至流行于歐洲的部分國家[5]。

2011年，在我國廣西地區(qū)出現(xiàn)了CSFV 2.1a亞型[19]。3年后，我國學(xué)者首次在國內(nèi)分離到CSFV 2.1d亞型[20]，同時(shí)，Luo等也對中國豬瘟的流行趨勢進(jìn)行了一定分析[21]。最近，我國許多接種C株的豬場出現(xiàn)了豬瘟疫情，經(jīng)檢測病原為CSFV 2.1d基因亞型。有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，接種C株并用CSFV 2.1d HLJZZ2014株攻毒的豬沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀并且全部存活。但這些豬表現(xiàn)出輕微的病理學(xué)和組織學(xué)損傷，并且在各種組織和血液樣品中檢測到CSFV RNA[22]?？傊袊髌髽I(yè)生產(chǎn)的不同來源的C株疫苗之間存在分子變異和抗原差異，并且可以對機(jī)體提供針對中國出現(xiàn)的2.1d基因亞型CSFV攻擊的臨床保護(hù)但不能對其提供病理學(xué)和病毒學(xué)保護(hù)[22]。然而，研究人員對CSFV 2.1d亞型是否在我國流行以及C株能否對CSFV 2.1d亞型提供完全保護(hù)存在不同的結(jié)論，這需要進(jìn)一步調(diào)查分析。

3 對C株的深度開發(fā)與利用

3.1 C株生產(chǎn)工藝的更新 C株疫苗的生產(chǎn)工藝在我國得到了不斷的更新，具體可以分為3個(gè)階段。第一階段：動(dòng)物組織苗，包括家兔脾淋組織苗、乳兔組織苗和牛體反應(yīng)苗；第二階段：動(dòng)物原代細(xì)胞苗，包括原代乳豬腎細(xì)胞苗、綿羊腎細(xì)胞苗、奶山羊腎細(xì)胞苗和犢牛睪丸細(xì)胞苗；第三階段：傳代細(xì)胞苗，包括傳代豬睪丸細(xì)胞(Swine testis cells，ST細(xì)胞)苗及傳代牛睪丸細(xì)胞(Bovine testis cells，BT細(xì)胞)苗[23]。現(xiàn)階段預(yù)防豬瘟的活疫苗主要有兔脾淋源、原代細(xì)胞源和豬瘟傳代細(xì)胞源3種。這3種疫苗的制備工藝、優(yōu)缺點(diǎn)及疫苗運(yùn)輸存儲方法等詳見表1[24]。

表1 市售3種豬瘟兔化弱毒疫苗產(chǎn)品的比較

近10年來，C株的生產(chǎn)工藝最為顯著的進(jìn)展是利用豬睪丸傳代細(xì)胞系(ST細(xì)胞系)生產(chǎn)豬瘟疫苗，并且利用生物反應(yīng)器代替?zhèn)鹘y(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞。該疫苗生產(chǎn)工藝相比之前的工藝，其生產(chǎn)疫苗的穩(wěn)定性高、批間差異小、質(zhì)量可控、疫苗抗原含量顯著增加。用ST細(xì)胞系生產(chǎn)的豬瘟疫苗免疫豬，抗體水平較傳統(tǒng)的組織苗與原代細(xì)胞苗相比明顯提高[23]。此外，科研人員還對生物反應(yīng)器生產(chǎn)的豬瘟活疫苗進(jìn)行了相關(guān)研究：郁宏偉等發(fā)現(xiàn)，將已感染CSFV的細(xì)胞直接接種至反應(yīng)器培養(yǎng)，收獲病毒液制備豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)的生產(chǎn)工藝明顯縮短了疫苗的生產(chǎn)周期。同時(shí)，ST細(xì)胞在生物反應(yīng)器中可以實(shí)現(xiàn)高密度生長，并且可以帶毒傳代，病毒收獲量大且穩(wěn)定。更重要的是，生物反應(yīng)器的自動(dòng)化水平較高，生產(chǎn)過程穩(wěn)定可控，保證了生產(chǎn)的豬瘟活疫苗質(zhì)量穩(wěn)定且產(chǎn)品批間差異小。值得注意的是，該生產(chǎn)工藝的病毒收獲量與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒收獲量相比有明顯提高，一個(gè)周期病毒的收獲量相當(dāng)于600個(gè)轉(zhuǎn)瓶的單次收獲量，而且培養(yǎng)時(shí)間較轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)間縮短一半，生產(chǎn)效率顯著提高，在降低生產(chǎn)成本方面有明顯優(yōu)勢[25]。

疫苗耐熱凍干保護(hù)劑在C株的應(yīng)用很大程度上解決了疫苗在運(yùn)輸過程中由于保存不當(dāng)導(dǎo)致的病毒失活問題。近年來，我國加大對耐熱凍干保護(hù)劑的研究投入，技術(shù)水平迅速提高，部分已達(dá)到發(fā)達(dá)國家的水平。耐熱凍干保護(hù)劑的使用可以將普通凍干疫苗的保存溫度由-15℃提高到2℃～8℃，在有效保護(hù)疫苗的基礎(chǔ)上，使其保存時(shí)間更久，保存期延長至18個(gè)月以上。劉業(yè)兵等研制了適用于豬瘟脾淋毒活疫苗的耐熱保護(hù)劑，利用該保護(hù)劑生產(chǎn)的豬瘟疫苗，在經(jīng)過耐老化試驗(yàn)(37℃保存10 d)和保存期測定(2℃～8℃保存12個(gè)月)后仍然符合疫苗產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求[26]。與此同時(shí)，大量的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，耐熱保護(hù)劑并不影響豬瘟疫苗的免疫效果，加入耐熱保護(hù)劑的豬瘟活疫苗與不加耐熱保護(hù)劑的疫苗一樣安全有效，而且疫苗在加入耐熱保護(hù)劑之后顯示出良好的熱穩(wěn)定性能，便于運(yùn)輸和使用[26]。研究者對疫苗保存期的測定以及保存后的免疫保護(hù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在2℃～8℃條件下，將豬瘟脾淋毒耐熱保護(hù)劑活疫苗保存24個(gè)月后免疫豬，仍然能夠?qū)SFV Shimen強(qiáng)毒株的攻擊提供完全保護(hù)[27]。目前，我國豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)為豬瘟疫苗的主要產(chǎn)品，耐熱保護(hù)劑在豬瘟疫苗中的應(yīng)用明顯降低C株疫苗在運(yùn)輸和保存過程中的降效或失效問題。

總之，隨著我國C株疫苗生產(chǎn)工藝的進(jìn)步和耐熱凍干保護(hù)劑的應(yīng)用，該疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量顯著提高、生產(chǎn)成本明顯降低、運(yùn)輸和保存更方便，保證了C株疫苗的質(zhì)量，且避免了因疫苗質(zhì)量問題導(dǎo)致的免疫失敗，在一定程度上提高了我國防控豬瘟的能力。

3.2 基于C株的標(biāo)記疫苗的研制 隨著全球范圍內(nèi)豬瘟凈化工作的不斷開展，部分歐洲和美洲國家已經(jīng)徹底消滅了豬瘟[1]，這對我國凈化豬瘟具有重要的借鑒和指導(dǎo)意義。但是現(xiàn)階段我國凈化豬瘟還面臨著諸多挑戰(zhàn)，現(xiàn)有的包括C株在內(nèi)的所有豬瘟弱毒疫苗均無法區(qū)分自然感染豬和疫苗接種豬，這種技術(shù)上的不足在很大程度上限制了我國豬瘟凈化工作的開展。

標(biāo)記疫苗是一種新型疫苗，該疫苗通過配套的血清學(xué)鑒別診斷方法，即可區(qū)分免疫抗體與野毒感染抗體。利用反向遺傳學(xué)操作平臺對野毒株或弱毒疫苗進(jìn)行基因操作是創(chuàng)制標(biāo)記疫苗的有效手段之一，通過基因水平的插入、缺失或突變原始病毒株的某一位點(diǎn)，可以對病毒進(jìn)行標(biāo)記或區(qū)分[28]。

迄今為止發(fā)現(xiàn)的與CSFV抗原相關(guān)的蛋白有3種，分別為結(jié)構(gòu)蛋白Erns、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3。CSFV的抗原表位主要分布于結(jié)構(gòu)蛋白Erns和E2中，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[29]。由于NS3含有的抗原表位在瘟病毒屬中具有很高的保守性，很難鑒別區(qū)分，這使得結(jié)構(gòu)蛋白Erns和E2成為構(gòu)建候選標(biāo)記疫苗株的基礎(chǔ)。CSFV E2蛋白存在較多的抗原表位，其中WH303是E2蛋白中高度保守的抗原表位，識別的最小表位基序是TAVSPTTLR[30]，這為后續(xù)基于WH303位點(diǎn)的突變標(biāo)記病毒株的構(gòu)建提供了理論依據(jù)。最近有研究報(bào)道，以C株為骨架，突變WH303抗原表位(TAVSPTTLR)的1個(gè)氨基酸以及缺失該表位2個(gè)氨基酸構(gòu)建的候選標(biāo)記疫苗(C-DIVA)，能夠區(qū)別疫苗免疫與野毒感染，該疫苗也是第一個(gè)基于C株的候選標(biāo)記疫苗[31]。該候選疫苗的研制為后續(xù)構(gòu)建以C株為骨架的標(biāo)記疫苗提供了新的方法。廖迅等嘗試了多種策略研制C株標(biāo)記疫苗，包括構(gòu)建了攜帶流行株E2的嵌合重組C株和攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)Erns基因的重組C株，并利用相應(yīng)的單克隆抗體(MAb)來區(qū)分疫苗接種豬與自然感染豬[32]。同時(shí)，理想的豬瘟標(biāo)記疫苗應(yīng)該具有以下特征：1、疫苗安全有效，質(zhì)量可控；2、能夠區(qū)分疫苗接種動(dòng)物與自然感染動(dòng)物；3、不散毒不排毒；4、對靶動(dòng)物和非靶動(dòng)物遺傳穩(wěn)定；5、常規(guī)條件下生產(chǎn)工藝簡單；6、能夠通過簡便的方法進(jìn)行鑒別診斷；7、產(chǎn)生免疫保護(hù)迅速且終生免疫；8、可以抵御不同豬瘟病毒株的攻擊[33]。值得注意的是，利用血清學(xué)方法區(qū)分C株以及野毒株的研究并不多，目前僅Qiagen公司推出了可以鑒別C株免疫和野毒感染的商品化血清學(xué)診斷試劑盒。在未來，研制基于C株的標(biāo)記疫苗及其配套的血清學(xué)鑒別診斷方法將會(huì)成為區(qū)分疫苗株以及野毒株的一種有益嘗試，這對于豬瘟的凈化和徹底根除也是十分必要的。

3.3 C株在創(chuàng)制多聯(lián)疫苗中的潛在應(yīng)用價(jià)值 從安全性和免疫原性角度來看，C株具有作為活病毒載體的巨大潛力和優(yōu)勢。最近本研究團(tuán)隊(duì)利用CSFV反向遺傳操作技術(shù)，首次以C株為骨架構(gòu)建了表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組C株。該研究證實(shí)，Cap基因在重組病毒中遺傳穩(wěn)定，且重組C株能夠在家兔體內(nèi)復(fù)制引起家兔的定型熱反應(yīng)，并且其免疫原性與C株保持一致，部分重組C株還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗Cap蛋白抗體[34-35]。這對利用C株作為病毒活載體構(gòu)建安全有效的豬病多價(jià)疫苗的研制提供了新的思路和平臺。目前我國已經(jīng)在多地暴發(fā)非洲豬瘟疫情，而目前尚沒有針對該病的有效疫苗，C株具有作為活載體構(gòu)建非洲豬瘟疫苗的優(yōu)勢。另外，C株可以與其它疫苗制備多聯(lián)疫苗，如豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌三聯(lián)活疫苗、豬瘟-豬丹毒二聯(lián)活疫苗、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟二聯(lián)活疫苗等?；诋?dāng)前我國豬病疫情復(fù)雜，混合感染嚴(yán)重，新發(fā)傳染病不斷涌現(xiàn)，今后多聯(lián)疫苗將是防控豬病的重要武器，相信基于C株為載體的多價(jià)疫苗以及與C株聯(lián)合制備的多聯(lián)疫苗在我國豬病的防控需求下會(huì)及時(shí)問世。

4 問題與展望

4.1 致弱機(jī)制和適應(yīng)機(jī)制研究滯后 與研制的其它豬瘟弱毒疫苗相比，C株的優(yōu)勢尤為明顯：能夠提供完全的臨床保護(hù)；不排毒、不散毒；在豬體內(nèi)反復(fù)傳代，均未發(fā)現(xiàn)C株毒力返強(qiáng)[4]。然而，該優(yōu)秀疫苗株自身潛在的諸多科學(xué)問題尚未回答，例如它是如何致弱的、如何適應(yīng)家兔并在其中復(fù)制的、其適應(yīng)家兔與病毒的致弱是否相關(guān)等。目前，能夠支持C株復(fù)制的兔源細(xì)胞的缺失是限制C株基礎(chǔ)研究的主要瓶頸。通過免疫組化、報(bào)告基因活性檢測以及熒光定量PCR等方法確定C株感染家兔脾臟的靶細(xì)胞，之后實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的永生化將是構(gòu)建支持C株復(fù)制的兔源細(xì)胞系的有效途徑。

4.2 實(shí)驗(yàn)室拯救的C株病毒培養(yǎng)滴度較低 2007年，我國將豬瘟列入強(qiáng)制免疫計(jì)劃，對所有豬均要免疫。在實(shí)施了近10年的強(qiáng)制免疫、重點(diǎn)監(jiān)測后，我國豬瘟流行情況趨于穩(wěn)定，2017年豬瘟退出了國家強(qiáng)制免疫計(jì)劃[36]。C株廣泛應(yīng)用于CSFV的臨床防控，但目前的C株疫苗并不具備標(biāo)記的特性，無法滿足市場的需求，也不能為國家提出的“凈化豬瘟”號召提供技術(shù)上的支持。豬瘟標(biāo)記疫苗株的研制和應(yīng)用對于實(shí)現(xiàn)國家豬瘟凈化這一長遠(yuǎn)目標(biāo)提供了可行的路線，但是標(biāo)記活疫苗的研發(fā)依賴于反向遺傳操作平臺，但利用反向遺傳平臺拯救的C株病毒滴度為104TCID50[37]，遠(yuǎn)低于商品化的C株疫苗。如果能夠?qū)ζ脚_加以改造，使拯救的病毒滴度提高，將有利于豬瘟標(biāo)記疫苗的制備，顯著降低生產(chǎn)成本。換言之，尋求安全有效的高產(chǎn)豬瘟弱毒疫苗株，對其進(jìn)行標(biāo)記，也可以作為構(gòu)建豬瘟標(biāo)記疫苗株的一種手段。

最近有研究者構(gòu)建了來源于C株的重組病毒，并且在PK-15細(xì)胞中連續(xù)傳代以獲得高的子代病毒產(chǎn)量。結(jié)果顯示，細(xì)胞適應(yīng)型病毒變種RecCpp80的效價(jià)比其親本C株提高近1 000倍，但喪失了誘導(dǎo)家兔發(fā)熱的能力[38]。該研究為提高經(jīng)反向遺傳操作拯救的C株病毒滴度提供了一個(gè)很好的思路和方法。同時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)對近幾年提高疫苗抗原產(chǎn)量的方法進(jìn)行了總結(jié)，包括改造病毒基因、改善病毒對細(xì)胞的適應(yīng)性、優(yōu)化抗原表達(dá)體系和改進(jìn)疫苗生產(chǎn)工藝等多個(gè)方面[39]，這對未來提高C株病毒的滴度具有一定的參考意義。