偽狂犬病病毒UL56蛋白與宿主蛋白Nedd4相互作用的研究

王書文，呂 闖，蔡雪輝*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱奧耶茲基氏病毒或豬皰疹病毒，屬于α皰疹病毒亞科水痘皰疹病毒屬成員，可以感染多種家畜、野生動(dòng)物及嚙齒類動(dòng)物。豬是其唯一的自然宿主及主要傳染源。PRV侵染宿主過程中，可潛伏于外周感覺神經(jīng)節(jié)或裂解性感染并引起明顯的神經(jīng)癥狀，臨床上引起新生仔豬神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、生長豬呼吸道癥狀，并且能導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎及木乃伊胎[1]。研究表明皰疹病毒UL56蛋白(pUL56)與PRV的神經(jīng)致病能力相關(guān)，可能在病毒粒子囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮作用[2]。

PRV pUL56含有多種功能性結(jié)構(gòu)域，成為其與宿主細(xì)胞蛋白互作的分子基礎(chǔ)。近期研究顯示PRV pUL56可增加豬白血球抗原I類(Swine leukocyte antigen class I，SLA-I)分子的泛素化，并經(jīng)溶酶體途徑降解細(xì)胞表面的SLA-I分子，這可能是PRV逃逸機(jī)體細(xì)胞免疫的機(jī)制之一[3]。PRV pUL56屬于II型膜蛋白，對(duì)病毒粒子的神經(jīng)傳播有促進(jìn)作用且與病毒的神經(jīng)毒力相關(guān)，但UL56基因缺失并不影響病毒粒子在神經(jīng)元軸突中的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[2]。因此，pUL56對(duì)PRV神經(jīng)致病性的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

WW結(jié)構(gòu)域(Domain)由35～40個(gè)氨基酸殘基組成，其中存在2個(gè)由20～23個(gè)氨基酸殘基間隔高度保守的色氨酸殘基(Tryptophan，W)[4]。WW結(jié)構(gòu)域特異性的識(shí)別脯氨酸富含序列，是一個(gè)高度保守的介導(dǎo)蛋白互作的結(jié)構(gòu)域[5]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白4(Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4，Nedd4)含有 2～4個(gè) WW結(jié)構(gòu)域，作為一類具有E3泛素連接酶活性的蛋白質(zhì)，在生理狀態(tài)下主要通過泛素化依賴的方式介導(dǎo)蛋白質(zhì)通過溶酶體及蛋白酶體降解而發(fā)揮其生物學(xué)功能[6]，在蛋白質(zhì)生成及輸送、免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程中發(fā)揮重要的作用。多種病毒可利用細(xì)胞內(nèi)泛素連接酶體系促進(jìn)其自身組裝、釋放、轉(zhuǎn)錄以及抗天然免疫等過程[7]。Nedd4是宿主細(xì)胞泛素連接酶家族代表性成員，在病毒感染宿主過程中，可與病毒蛋白相互作用調(diào)控病毒在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)及出芽等過程[8]。Nedd4通過與底物蛋白的PPxY(PY)基序相互作用，隨后進(jìn)入泛素蛋白酶體途徑降解[9]。通過對(duì)PRV pUL56氨基酸序列的分析，本研究發(fā)現(xiàn)其編碼4個(gè)PY基序，以pUL56為研究對(duì)象，利用免疫共沉淀(Co-IP)及激光共聚焦試驗(yàn)驗(yàn)證PRV pUL56與Nedd4是否存在相互作用及其對(duì)Nedd4表達(dá)的調(diào)控，為探究pUL56在PRV感染過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、載體及細(xì)胞 PRV HeN1株(KP098534.1)由哈爾濱獸醫(yī)研究所流行病學(xué)與病原監(jiān)測團(tuán)隊(duì)分離并保存[10]；真核表達(dá)載體p3×Flag-CMV、pCMV-HA和 pAcGFP-C1、真核表達(dá)質(zhì)粒 pAcGFP-UL56-S1、pAcGFP-UL56-S2、pAcGFP-UL56-S3、非洲綠猴腎臟細(xì)胞(Vero)、人胚胎腎293T細(xì)胞(HEK293T)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)均由哈爾濱獸醫(yī)研究所流行病學(xué)與病原監(jiān)測團(tuán)隊(duì)保存。

1.2 主要試劑 小鼠抗Flag單克隆抗體(MAb)、小鼠抗HA MAb、小鼠抗β-actin MAb和Flag抗體親和糖珠均購自Sigma-Aldrich公司；小鼠抗GFP MAb及兔抗GM130 MAb購自Proteintech公司；山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 568購自Invitrogen公司；完全蛋白酶抑制劑cocktail及X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；山羊抗小鼠DyLight 800 IgG(H+L)購自KPL公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；KOD FX Neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司；膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司；山羊抗兔IgG Alexa Fluor 647、限制性核酸內(nèi)切酶及蛋白Marker均購自Thermo scientific公司；RIPA(弱)細(xì)胞裂解液及SDS-PAGE蛋白膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；病毒DNA/RNA基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DAPI染料由哈爾濱獸醫(yī)研究所流行病學(xué)與病原監(jiān)測團(tuán)隊(duì)提供。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中PRV HeN1株UL56基因序列(KP098534.1)及小鼠Nedd4 CDS基因序列(NM_010890.4)，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增相應(yīng)基因的特異性引物(表1)，并由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 本研究中使用的PCR引物

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PRV HeN1株感染Vero細(xì)胞，待細(xì)胞病變約為70%時(shí)按照病毒基因組提取試劑盒說明書提取PRV基因組。以PRV HeN1株基因組為模板，分別采用特異性引物UL56-Flag-F/R及UL56-GFP-F/R擴(kuò)增UL56基因。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。利用HindⅢ和EcoRⅠ分別對(duì)引物UL56-Flag-F/R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與載體p3×Flag-CMV雙酶切；此外，用XhoⅠ和KpnⅠ對(duì)引物UL56-GFP-F/R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與載體pAcGFP-C1雙酶切；隨后，利用T4 DNA連接酶分別對(duì)雙酶切后的PCR產(chǎn)物和相應(yīng)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取適量菌液涂布于氨芐或卡那抗性LB細(xì)菌培養(yǎng)板，分別挑取3個(gè)克隆進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為p3×Flag-UL56和 pAcGFP-UL56。

利用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取MEF細(xì)胞總mRNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以該cDNA為模板，分別采用特異性引物mNedd4-HA-F/R及mNedd4-Flag-F/R擴(kuò)增Nedd4基因。PCR反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃30 s、66℃30 s、72℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。利用BglⅡ和KpnⅠ分別對(duì)PCR產(chǎn)物與載體pCMV-HA及p3×Flag-CMV雙酶切；利用T4 DNA連接酶對(duì)雙酶切后的PCR產(chǎn)物和相應(yīng)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取適量菌液涂布于氨芐抗性LB細(xì)菌培養(yǎng)板，分別挑取3個(gè)克隆進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為pCMV-HA-mNedd4及p3×Flag-mNedd4。所有用于實(shí)驗(yàn)的重組質(zhì)粒均經(jīng)過測序鑒定以確定插入外源片段的核苷酸序列正確。

1.5 Co-IP試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒 p3×Flag-UL56和pCMV-HA-mNedd4各3 μg分別轉(zhuǎn)染鋪于 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的HEK293T細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h后，用200 μL/孔含有完全蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA(弱)裂解液于4℃振蕩作用1 h；12 000 r/min，4℃離心10 min后取上清。每個(gè)樣品留取40 μL作對(duì)照，其余樣品與40 μL Flag抗體親和糖珠于4℃旋轉(zhuǎn)孵育8 h。隨后，用預(yù)冷的PBS(pH7.4)洗滌珠子3次，2 000 r/min，4℃離心3 min后棄上清，加入 60 μL PBS 及 15 μL 5×loading buffer重懸糖珠，100℃煮樣10 min后進(jìn)行SDS-PAGE。以小鼠抗Flag MAb(1∶5 000)、小鼠抗 HA MAb(1∶10 000)及小鼠抗β-actin MAb(1∶10 000)為一抗，山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶10 000)為二抗 western blot檢測 pUL56與Nedd4之間是否存在相互作用。

1.6 激光共聚焦試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒pAcGFP-UL56和pCMV-HA-mNedd4(各1 μg)分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24 h后，利用4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞30 min；3%BSA室溫封閉1 h；以小鼠抗HA MAb(1∶1 000)為一抗標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 HA-mNedd4，兔抗 GM130 MAb(1∶500)特異性地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的高爾基體，4℃孵育過夜；次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 568(1∶500)及山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 647(1∶500)為二抗，室溫作用1 h；用DAPI(1∶2 000)復(fù)染細(xì)胞核10 min，PBS清洗后利用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM880)觀察并拍照，以確定pUL56與Nedd4在細(xì)胞內(nèi)的單獨(dú)定位及共定位情況。

1.7 pUL56的分段Co-IP試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pAcGFP-UL56-S1(pUL56 N末端)、pAcGFP-UL56-S2(包含pUL56全部PY基序)、pAcGFP-UL-56-S3(pUL56 C 末端)與 p3×Flag-mNedd4共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)，具體操作步驟參考1.5。以小鼠抗Flag MAb(1∶5 000)、小鼠抗 GFP MAb(1∶10 000)及小鼠抗 β-actin MAb(1∶10 000)為一抗，山羊抗小鼠Dylight 800 IgG(H+L)(1∶10 000)為二抗分別進(jìn)行western blot檢測，以確定pUL56與Nedd4相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。

1.8 表達(dá)pUL56 PY基序突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用融合PCR方法將PRV pUL56的4個(gè)PPXY基序全部突變?yōu)锳AxY，命名為pUL56-PYM。以重組質(zhì)粒p3×Flag-UL56-PYM1的構(gòu)建為例，以 p3×Flag-UL56為模板，利用UL56-Flag-F/UL56-PYM1-R、UL56-Flag-R/UL56-PYM1-F兩對(duì)引物分別擴(kuò)增UL56突變片段1及片段2，再以片段1及片段2膠回收產(chǎn)物為模板，利用特異性引物UL56-Flag-F/R擴(kuò)增UL56突變片段，并連接到p3×Flag-CMV載體中，構(gòu)建 p3×Flag-UL56-PYM1。在 p3×Flag-UL56-PYM1重組質(zhì)?；A(chǔ)上分別構(gòu)建UL56 PYM2～4丙氨酸突變體。最終，獲得重組質(zhì)粒p3×Flag-UL56-PYM1(74AAxY)、 p3 ×Flag-UL56-PYM2(74AAxY-101AAxY)、p3×Flag-UL56-PYM3(74AAxY-101AAxY-112AAxY)和 p3×Flag-UL56-PYM4(74AAxY-101AAxY-112AAxY-122AAxY)。此外，進(jìn)一步以p3×Flag-UL56-PYM4為模板，利用引物UL56-GFP-F/R將UL56-PYM4克隆于pAcGFPC1載體，獲得重組質(zhì)粒pAcGFP-UL56-PYM4。所有用于實(shí)驗(yàn)的重組質(zhì)粒均經(jīng)過測序鑒定以確定插入外源片段的核苷酸序列正確。

1.9 pUL56 PY基序突變體的Co-IP及激光共聚焦試驗(yàn) 為確定pUL56與Nedd4的相互作用能力是否隨著PY基序突變的增加而降低，將重組質(zhì)粒p3×Flag-UL56-PYM1、 p3×Flag-UL56-PYM2、 p3×Flag-UL56-PYM3和 p3×Flag-UL56-PYM4與 pCMV-HA-mNedd4共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)，具體操作步驟參考“1.5 Co-IP試驗(yàn)”。以小鼠抗Flag MAb(1∶5 000)、小鼠抗 HA MAb(1∶10 000)及小鼠抗β-actin MAb(1∶10 000)為一抗，山羊抗小鼠Dylight 800 IgG(H+L)(1∶10 000)為二抗進(jìn)行 western blot檢測。將重組質(zhì)粒pAcGFP-UL56-PYM4與pCMV-HA-mNedd4共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，以小鼠抗HA MAb(1∶1 000)為一抗，以山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 568(1∶500)為二抗，進(jìn)行激光共聚焦試驗(yàn)，檢測pUL56 PY基序全部突變后，pUL56與Nedd4在細(xì)胞內(nèi)是否還存在共定位。

1.10 pUL56調(diào)控Nedd4表達(dá)的western blot檢測根據(jù)本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將pAcGFP、pAcGFPUL56和pAcGFP-UL56-PYM4分別與pCMV-HA-mNedd4重組質(zhì)粒(各 1 μg)共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h和48 h后，利用含有完全蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA(弱)裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解后釋放的蛋白樣品，離心取上清后分別以小鼠抗GFP MAb(1∶20 000)、小鼠抗 HA MAb(1∶10 000)及小鼠抗β-actin MAb(1∶10 000)為一抗，山羊抗小鼠Dylight 800 IgG(H+L)(1∶10 000)為二抗進(jìn)行 western blot檢測。采用Image J軟件對(duì)western blot目的條帶灰度值分析pUL56 PY基序在pUL56調(diào)控Nedd4的表達(dá)中是否發(fā)揮作用。

2 結(jié)果

2.1 PR V pUL56與Nedd4存在相互作用 采用Co-IP試驗(yàn)驗(yàn)證PRV pUL56是否與宿主蛋白Nedd4存在相互作用。結(jié)果顯示，過表達(dá)的Flag-pUL56能夠通過糖珠親和的Flag抗體吸附于珠子，相反，過表達(dá)的HA-mNedd4不能吸附于糖珠，當(dāng)過表達(dá)Flag-pUL56與HA-mNedd4共同與Flag抗體親和糖珠孵育時(shí)，兩者均可以吸附于珠子，并被western blot試驗(yàn)檢測到(圖1A)，結(jié)果表明pUL56與Nedd4存在相互作用。

利用激光共聚焦試驗(yàn)對(duì)pUL56及Nedd4在細(xì)胞內(nèi)的單獨(dú)定位情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示兩者均分布在細(xì)胞質(zhì)中，但pUL56主要在細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域，兩者沒有明顯的細(xì)胞器定位(圖1B)。

進(jìn)一步通過激光共聚焦試驗(yàn)對(duì)pUL56與Nedd4在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，GFP-pUL56與HA-mNedd4均定位于細(xì)胞的高爾基體(圖1C)。因此，pUL56可將細(xì)胞質(zhì)分布的Nedd4重新定位于細(xì)胞的高爾基體，改變了Nedd4在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

2.2 PRV pUL56與Nedd4相互作用的分子機(jī)制研究結(jié)果 為確定pUL56和Nedd4相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，利用pUL56分段Co-IP試驗(yàn)驗(yàn)證GFP-pUL56-S1(pUL56 N末端)、GFP-pUL56-S2(包含 pUL56全部PY基序)、GFP-pUL56-S3(pUL56 C末端)與 FlagmNedd4之間的相互作用。結(jié)果顯示過表達(dá)的FlagmNedd4能夠通過親和糖珠的Flag抗體吸附于珠子，當(dāng)過表達(dá)的 Flag-mNedd4與 GFP-pUL56-S1、GFP-pUL56-S2及GFP-pUL56-S3共同作用于Flag抗體的親和糖珠時(shí)，western blot試驗(yàn)僅檢測到GFP-pUL56-S2和 GFP-pUL56-S3。表明 GFP-pUL56-S2和 GFP-pUL56-S3與Flag-mNedd4產(chǎn)生了互作，而GFP-pUL56-S1與Flag-mNedd4不存在互作(圖2)。因此，PRV pUL56通過其PY基序及C末端區(qū)域與Nedd4發(fā)生互作。

為確定pUL56 PY基序在pUL56與Nedd4互作中發(fā)揮的作用，本研究將pUL56 PY基序突變體分別與Nedd4進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著pUL56 PY基序突變的增加，可被western blot試驗(yàn)檢測到的HA-mNedd4條帶越來越弱。但當(dāng)pUL56 PY基序全部突變后，HA-mNedd4仍可檢測到微弱條帶(圖3A)；激光共聚焦試驗(yàn)結(jié)果顯示GFP-pUL56 PYM4與HA-mNedd4在細(xì)胞質(zhì)中也存在微弱共定位熒光(圖3B)。表明隨著pUL56 PY基序突變的增加，pUL56與Nedd4的互作能力降低，pUL56的C末端可能在其突變體PYM4中發(fā)揮了與Nedd4互作的功能。

2.3 PRV pUL56下調(diào)Nedd4的表達(dá) 為研究pUL56是否通過PY基序調(diào)控Nedd4的表達(dá)，本研究利用western blot分析HA-mNedd4蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，HA-mNedd4蛋白表達(dá)水平在其與GFP-pUL56共表達(dá)組明顯低于其與GFP共表達(dá)的對(duì)照組。然而，HA-mNedd4蛋白表達(dá)水平在其與GFP-pUL56 PYM4共表達(dá)組明顯高于其與GFP-UL56共表達(dá)組(圖4)。轉(zhuǎn)染48 h后，HA-mNedd4蛋白水平在其與GFP-pUL56 PYM4和GFP-pUL56共表達(dá)組無明顯差異，且均顯著低于其與GFP共表達(dá)的對(duì)照組(圖4)。表明PY基序在pUL56介導(dǎo)的下調(diào)Nedd4表達(dá)過程中發(fā)揮作用。此外，除PY基序以外還有其它蛋白基序發(fā)揮功能。

3 討論

病毒在感染、復(fù)制及組裝過程中，需要多種宿主蛋白的參與和協(xié)作。研究病毒蛋白與宿主蛋白之間的互作可為闡明病毒在宿主體內(nèi)的感染、復(fù)制周期及致病機(jī)制等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

PRV是一種具有神經(jīng)嗜性的α皰疹病毒，其感染宿主后在其外周神經(jīng)系統(tǒng)迅速建立潛伏感染引起明顯的神經(jīng)癥狀，且使宿主終生帶毒，這種感染、建立潛伏感染和再激活的過程是病毒得以生存的關(guān)鍵[11]。

近期研究結(jié)果表明PRV pUL56與PRV對(duì)嚙齒動(dòng)物的神經(jīng)致病性相關(guān)，pUL56促進(jìn)病毒粒子在神經(jīng)元之間的傳播，且對(duì)病毒毒力有一定的影響，但其分子機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道[2]。為研究PRV感染宿主的致病機(jī)制及與宿主蛋白相互作用的分子基礎(chǔ)，本研究對(duì)pUL56的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其編碼4個(gè)PY基序。大量研究證實(shí)含有PY基序的病毒蛋白可與具有WW結(jié)構(gòu)域的宿主蛋白發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響病毒的出芽、復(fù)制、釋放等過程[12-13]。本研究選擇宿主WW結(jié)構(gòu)域蛋白Nedd4為研究對(duì)象，通過Co-IP和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)確定了PRV pUL56與Nedd4存在相互作用，pUL56主要定位于細(xì)胞的高爾基體，Nedd4廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)兩者共同表達(dá)于HEK293T細(xì)胞時(shí)，pUL56可將細(xì)胞質(zhì)分布的Nedd4重新定位于高爾基體，改變了Nedd4在細(xì)胞中的分布[8,14]。進(jìn)一步，利用pUL56分段Co-IP試驗(yàn)確定了pUL56通過其PY基序及C末端區(qū)域與Nedd4發(fā)生互作。本研究首次發(fā)現(xiàn)不同于單純皰疹病毒(HSV)UL56，PRV pUL56通過其C末端區(qū)域與Nedd4發(fā)生互作，但其詳細(xì)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究[8]。研究顯示PY基序在介導(dǎo)PRV pUL56與SLA-I分子的相互作用中發(fā)揮重要作用，pUL56通過PY基序與目的蛋白發(fā)生互作，增加其泛素化并將其帶到溶酶體途徑而降解[2]。還有研究報(bào)道HSV2 pUL56與Nedd4存在相互作用，HSV2 pUL56的PY基序突變后其完全失去了與Nedd4相互作用能力[8]。然而，本研究通過Co-IP和激光共聚焦試驗(yàn)顯示隨著pUL56 PY基序突變的增加，pUL56與Nedd4的相互作用能力逐漸減弱，但并沒有完全失去與Nedd4的互作能力；當(dāng)PY基序全部突變后，pUL56突變體不再將Nedd4大量定位于高爾基體，pUL56與Nedd4在細(xì)胞質(zhì)中存在微弱的共定位熒光；進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果表明pUL56通過其PY基序顯著下調(diào)Nedd4的表達(dá)，并且本研究顯示除PY基序以外pUL56還存在其它下調(diào)Nedd4表達(dá)的機(jī)制，對(duì)pUL56介導(dǎo)Nedd4下調(diào)表達(dá)的其它分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

本研究首次報(bào)道宿主蛋白Nedd4與PRV pUL56存在相互作用，并初步闡明了兩者相互作用的分子機(jī)制及表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，為揭示PRV pUL56神經(jīng)致病機(jī)制提供了參考依據(jù)。