缺氧復氧致心肌AC16細胞損傷途徑的研究*

戴文芝， 葉文峰， 何 原， 陳 燦， 黃石安， 雷 桅△， 郭 軍

(廣東醫(yī)科大學 1心血管疾病研究室， 2附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科中心， 廣東 湛江 524000； 3暨南大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 廣東 廣州 510632)

缺血性心臟病是心血管系統(tǒng)中致死率和致殘率最高的疾病之一，臨床使用經(jīng)皮冠狀動脈介入術疏通狹窄甚至閉塞的冠狀動脈管腔，從而改善心肌血流灌注和阻止梗死面積擴大，是治療缺血性心臟病的基本原則和有效方法[1]。然而心肌恢復血流過程會造成缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷，使治療效果減弱甚至加重心肌梗死[2]，因此I/R損傷的發(fā)生機制一直是心臟保護研究領域的重點和難點。目前導致心肌I/R損傷的途徑尚不清楚，一般認為可能與以下機制有關：(1)細胞自噬(autophagy)，自噬在缺血缺氧等應激狀態(tài)下能維持細胞的存活，但是過分激活會損傷細胞，目前研究充分表明I/R特別是再灌注期間自噬上調(diào)會損傷心肌細胞[3-4]；(2)細胞焦亡(pyroptosis)，當心肌細胞發(fā)生I/R時，激活活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)系統(tǒng)和炎癥反應，從而引起細胞的焦亡損傷[5]；(3)細胞凋亡(apoptosis)，在嚙齒動物心肌I/R模型中，觀察到細胞凋亡在再灌注后顯著增加[6]。但是細胞自噬、細胞焦亡和細胞凋亡等不同途徑在I/R心肌損傷過程中是否同時發(fā)生未見報道，本研究建立人心肌AC16細胞的缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)細胞模型，探討不同復氧時間細胞自噬、細胞焦亡和細胞凋亡的作用，以期深入揭示I/R心肌損傷的發(fā)病過程和分子機制，從而為缺血性心臟病防治提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞及實驗試劑

人心肌AC16細胞株購自ATCC。低糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone)；無糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA和PBS(Gibco)；CCK-8試劑盒、細胞裂解液、ECL發(fā)光試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京碧云天生物技術研究所)；兔抗人LC-3、caspase-1、cleaved gasdermin D、cleaved caspase-3、Bax、Bcl2和α-tubulin多克隆抗體(CST)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組 采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每3 d更換1 次培養(yǎng)基，取3～5代生長良好的AC16細胞用于實驗。將細胞隨機分為5組：空白對照(normal control, N)組，未做任何處理；缺氧組(0 h組)，無糖、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞并置于37 ℃、含1% O2的培養(yǎng)箱中缺氧處理24 h；3個缺氧復氧組，缺氧處理后將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的低糖DMEM，置于37 ℃、21% O2條件下分別復氧處理2 h(2 h組)、6 h(6 h組)和12 h(12 h組)。

2.2CCK-8法檢測心肌細胞活力 每組AC16細胞設置6個復孔，每孔加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基 100 μL，并設置調(diào)零孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。450 nm 波長處檢測細胞液的吸光度(A)值，實驗重復3次。

2.3Western blot法檢測相關蛋白的水平 細胞分組處理后，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。90 ℃使蛋白變性，取相同質(zhì)量蛋白上樣，進行SDS-PAGE， 60 V、60 min和90 V、60 min條件下電泳，結束后用濕轉(zhuǎn)法90 V、120 min將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，加I 抗4 ℃搖床孵育過夜(LC-3 1∶1 000、caspase-1 1∶500、cleaved gasdermin D 1∶500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl2 1∶1 000和α-tubulin 1∶1 000)。相應的HRP標記 II抗(1∶2 000)常溫孵育1 h，用TBST 洗膜5次，每次5 min,ECL 發(fā)光，顯影，Tanon 5200成像系統(tǒng)檢測目的蛋白并拍照，ImageJ軟件分析目的蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 缺氧復氧后心肌AC16細胞活力下降

與空白對照組比，缺氧組細胞活力下降(P<0.01)，復氧2 h組、復氧6 h組和復氧12 h組的細胞活力均比缺氧組進一步降低(P<0.05)，且復氧6 h組比復氧2 h組的細胞活力低，但隨著復氧時間延長至12 h，其細胞活力與復氧6 h組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1。

Figure 1.The cell vitality from each group determined by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05，##P<0.01vs0 h group.

圖1 CCK-8法測定各組細胞的活力

2 AC16細胞自噬隨復氧時間延長而減弱

與空白對照組比，缺氧組、復氧2 h組、復氧6 h組和復氧12 h組的AC16細胞LC3-Ⅱ/-I比值增加，表明細胞自噬水平顯著上調(diào)(P<0.01)。然而，與缺氧組AC16細胞相比，復氧6 h組和復氧12 h組細胞自噬水平則顯著下降(P<0.05)，見圖2。

3 缺氧復氧后心肌 AC16細胞發(fā)生焦亡

與空白對照組相比，缺氧組AC16細胞的pro-caspase-1蛋白表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，但cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D未見明顯變化。當復氧6 h和12 h時，AC16細胞的焦亡相關蛋白cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白水平均顯著增加(P<0.05)，從而提示缺氧復氧6 h后AC16心肌細胞焦亡被激活，見圖3。

4 缺氧復氧致心肌 AC16細胞凋亡

缺氧及復氧處理2 h和6 h后，AC16細胞的凋亡相關蛋白cleaved caspase-3表達量和Bax/Bcl2比值與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，當復氧處理12 h后，cleaved caspase-3表達量和Bax/Bcl2 比值明顯上調(diào)(P<0.05)，說明此時心肌 AC16細胞啟動凋亡程序，見圖4。

Figure 2.The LC3-Ⅱ/-Ⅰ ratio in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖2 缺氧復氧處理后AC16細胞LC3-Ⅱ/-I變化

Figure 3.The protien levels of pro caspase-1, cleaved caspase-1 and cleaved gasdermin D in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different tmes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖3 缺氧復氧處理后AC16細胞pro-caspase-1、cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D的蛋白水平比較

討 論

缺血再灌注對心肌細胞造成嚴重損傷，再灌注過程中發(fā)生的細胞自噬、細胞焦亡、細胞凋亡與心肌梗死面積大小和心梗后左心重塑密切相關[7-9]，揭示細胞損傷途徑在不同再灌注時間的啟動時間和狀態(tài)，有利于探討更有效的心肌保護方法。

AC16細胞是來源于人胚胎的心肌細胞，不能發(fā)生搏動，但與人心肌細胞有相似的功能和特性。本研究采用心肌 AC16細胞建立缺氧復氧模型，模擬人體心肌缺血再灌注過程，并設置不同的復氧時間，來探討不同復氧時間細胞自噬、焦亡和凋亡的激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)隨著復氧時間延長細胞活力下降，證實復氧會對心肌細胞造成劇烈損傷。而觀察不同復氧時間心肌細胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)缺氧組心肌細胞自噬水平升高，復氧時間增加時自噬水平下降，但與空白對照組相比，細胞自噬水平仍處于較高程度。因此缺氧誘導心肌細胞自噬，復氧則抑制自噬。Sandanger等[10]提出細胞焦亡在小鼠缺血再灌注后的心肌組織中被上調(diào)，然而本研究發(fā)現(xiàn)缺氧并不會引起細胞焦亡的發(fā)生，僅在復氧6 h后啟動細胞焦亡，但細胞凋亡出現(xiàn)在復氧12 h，從而表明在缺氧復氧過程中心肌 AC16細胞焦亡早于凋亡，且復氧12 h后細胞開始遭受多途徑的復合損傷。

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase-3, Bax and Bcl2 in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h group.

圖4 缺氧復氧處理后AC16細胞cleaved caspase-3、Bax和Bcl2蛋白水平的比較

本課題為研究缺血性心臟病發(fā)生的病理過程和細胞分子機制提供一種思路，同時也存在一定局限性。首先，人心肌 AC16細胞缺氧復氧模型無法完全還原體內(nèi)心肌缺血再灌注狀態(tài)，人體復雜的心血管系統(tǒng)會受到其他多重因素的影響；其次，當細胞發(fā)生焦亡時會釋放促炎細胞因子如IL-1和IL-18等，造成細胞炎性損傷[11-12]。Taabazuing等[13]發(fā)現(xiàn)在單核細胞和巨噬細胞中細胞凋亡和細胞焦亡存在雙向串擾，但在缺氧復氧模型中細胞凋亡與焦亡之間是否存在關聯(lián)，以及細胞自噬、細胞焦亡和細胞凋亡的激活是否存在網(wǎng)絡化協(xié)同作用還有待進一步探討。

綜上所述，心肌 AC16細胞缺氧復氧導致的細胞自噬、焦亡和凋亡并非同時激活，缺氧啟動心肌細胞自噬，但是在復氧過程中細胞自噬水平逐漸下降，而焦亡和凋亡水平升高，且焦亡早于凋亡發(fā)生。因此心肌缺血性損傷的干預和保護策略也應該針對不同時期和不同損傷機制進行相應處理才能取得最佳效果。