人參皂苷Rb1對高脂血癥大鼠肝臟細(xì)胞焦亡的影響及其可能機制*

于 寧， 宋 囡， 賈連群△， 陳 寧， 陳 絲， 吳 瑤， 楊關(guān)林△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 1研究生學(xué)院， 2重大科研平臺中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室， 3心腦合病中西醫(yī)結(jié)合防治技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室， 遼寧 沈陽 110847)

血脂異常是臨床上多發(fā)和常見的脂肪代謝及轉(zhuǎn)運異常性疾病[1-2]。血脂異常不僅僅是動脈粥樣硬化、糖尿病和肥胖的原因，同時也是引起慢性肝損傷的重要因素。長期的高脂飲食可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，并伴隨著炎癥的發(fā)生[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是繼細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死后發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞程序性、炎性死亡方式，廣泛存在于慢性肝臟疾病發(fā)生過程中，抑制肝臟細(xì)胞焦亡的發(fā)生可以降低肝損傷時肝細(xì)胞的損傷程度，減少炎癥因子的生成,抑制炎癥反應(yīng)[5-6]。

人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)是人參的主要有效成分之一，具有改善肝臟脂肪變性、降低血脂、抑制肝臟炎癥反應(yīng)及抗肝損傷等作用[7-10]，但其具體機制尚未完全闡明。既然人參皂苷具有抑制肝臟炎癥反應(yīng)的作用，而與炎癥相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡方式——細(xì)胞焦亡存在于肝臟疾病中，那么人參皂苷抑制肝臟炎癥反應(yīng)的作用機制有可能是通過抑制肝臟細(xì)胞焦亡實現(xiàn)的。因此，本研究構(gòu)建高脂血癥大鼠模型，以細(xì)胞焦亡為切入點，探討人參皂苷Rb1對高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響及作用機制，為中醫(yī)中藥在臨床中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要藥品、試劑及儀器

人參皂苷Rb1購自西安天豐生物科技有限公司；抗NLRP3抗體、抗白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體和抗白細(xì)胞介素18(interleukin-18，IL-18)抗體購自博奧森公司(批號分別為bs-23723R、bs-20448R和bs-0529R)；抗胱天蛋白酶1(caspase-1)抗體和抗gasdermin D(GSDMD)抗體購自AVIVA SYSTEMS BIOLOGY(批號分別為ARP58983-P050和OACA03071)；抗GAPDH抗體購自Abbkine(批號#A01020)；BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)(批號CW0014S)；蘇木精-伊紅(HE)染色液購自碧云天生物技術(shù)有限公司(批號C0105)；油紅O購自Sigma;所用PCR 引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。7500 Real-time PCR儀購自Applied Biosystems；TAB-120FR 型全自動生化分析儀購自日本東芝公司；全能型快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自BIO-RAD。

2 動物

SPF級SD大鼠32只，體重(190±20) g，由遼寧長生生物科技股份有限公司提供，動物合格證號SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗單位許可證號SYXK(遼)2013-0009，室內(nèi)溫度18～22 ℃，濕度40%～70%，單籠飼養(yǎng)，每天12/12 h晝夜明暗交替。動物實驗符合遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)，實驗動物倫理審查編號21006092017056。

3 實驗方法

3.1模型制備、分組及給藥方式 32只SPF級健康 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機分為正常(control)組、模型(model)組、人參皂苷Rb1(Rb1)組和辛伐他汀(simvastatin)組。正常組每日給予基礎(chǔ)飼料，模型組、人參皂苷Rb1組和辛伐他汀組每日給予高脂飼料(10%豬油，1%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%甲基硫氧嘧啶，5%蔗糖，加83.3%普通飼料)，自由攝食，飲水不限。4周后，模型組、人參皂苷Rb1組和辛伐他汀組繼續(xù)高脂飼料喂飼，同時灌胃給藥，給藥劑量按人和動物體表面積折算系數(shù)換算，人參皂苷Rb1組給予200 mg·kg-1·d-1，辛伐他汀組給予2.1 mg·kg-1·d-1，對照組與模型組則每日給予等體積的生理鹽水。給藥8周后，檢測血脂，并取整個肝組織。

3.2血脂檢測 取材前12 h禁食不禁水，實驗當(dāng)天稱體重，10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血裝于抗凝試管中，室溫靜置30 min后，3 500 r/min 離心25 min，取血清分裝，-20 ℃保存待用。全自動生物化學(xué)分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C) 含量。

3.3肝臟組織病理學(xué)觀察 取大鼠肝臟組織，4%多聚甲醛固定72 h，按蘇木素-伊紅(HE) 染色常規(guī)方法進行，70%～100%梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(切片厚度 5 μm)、貼片、烤片后，用二甲苯脫蠟,70%～100%梯度乙醇復(fù)水,蘇木精染色,70%鹽酸乙醇分色,伊紅復(fù)染，再用 70%～100%梯度乙醇脫水,二甲苯透明，中性樹膠封片，石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.4Western blot法檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達 取0.1 g肝臟組織，加入1 mL裂解液，在冰上充分研磨，吸入到1.5 mL的無菌EP管中,冰上靜置30 min，12 000 r/min、 4 ℃離心10 min，取上清。利用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白進行定量。取樣品蛋白和2×蛋白緩沖液各100 μL于1.5 mL EP管中，100 ℃加熱5 min變性。以60 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離后，2.5 A、25 V半干轉(zhuǎn)7 min，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，麗春紅染色后脫色，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，對照marker，把膜上的目的蛋白剪開，加入I抗4 ℃過夜。TBST洗滌3次，每次10 min，加入II抗。孵化1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,配制ECL發(fā)光液,曝光，保存條帶，灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參照，對蛋白條帶進行相對定量分析。

3.5RT-qPCR法檢測細(xì)胞焦亡因子mRNA的表達 TRIzol 裂解肝臟組織，提取總RNA，吸光度測定方法檢測RNA濃度和純度。RNA純度A260/A280應(yīng)在1.8～2.2 范圍內(nèi)?；蚪MDNA去除體系: 5 μL 200 μg/L total RNA，1 μL 10×gDNA Eraser Buffer，0.5 μL gDNA Eraser，3.5 μL RNase-Free Water。PCR儀反應(yīng)條件: 42 ℃ 2 min。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系: 10 μL去除基因組 DNA 的總RNA，1 μL HiFi Script (2×108U/L)，1 μL Primer Mix，4 μL 5×Script RT Buffer，4 μL RNase-Free Water。PCR儀反應(yīng)條件為: 42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。PCR擴增反應(yīng)體系:2 μL DNA模板，25 μL 2×(Low Rox),1 μL上游引物，1 μL下游引物，21 μL ddH2O。PCR條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。用SYBR Green Mater Mix試劑檢測 mRNA水平，重復(fù)3次。用2-ΔΔCt法對RT-qPCR 結(jié)果進行定量分析。ΔCt值為目的mRNA Ct值與內(nèi)參照mRNA Ct值的差值,ΔΔCt為各實驗組ΔCt與空白對照組ΔCt的差值。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的相關(guān)引物序列

F: forward; R: reverse.

4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組之間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人參皂苷Rb1對各組大鼠血脂水平的影響

與control組比較，model組大鼠血清TC、TG和LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量顯著下降(P<0.05)；與model組比較，Rb1組和simvastatin組大鼠血清TG含量顯著下降(P<0.01)，TC和LDL-C 含量均下降(P<0.05)，HDL-C顯著升高(P<0.01)，Rb1組與simvastatin組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組大鼠血清血脂水平比較

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group.

2 人參皂苷Rb1對高脂血癥大鼠肝組織形態(tài)學(xué)影響

Control組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈條索狀排列，肝竇正常不狹窄，肝細(xì)胞圓形，核圓居中，胞漿內(nèi)未見脂滴; model組肝細(xì)胞體積增大，肝細(xì)胞漿內(nèi)可見大量脂肪滴，脂滴大小不等，脂肪變性的細(xì)胞布滿視野，肝竇狹窄或消失；simvastatin組的病變程度較model組明顯減輕，可見少量脂肪滴，肝細(xì)胞腫脹較模型組輕，可見到正常的肝細(xì)胞，肝竇狹窄有所恢復(fù)；Rb1組病變恢復(fù)程度與simvastatin相似，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，脂肪變性程度較model組減輕，可見少量脂肪空泡，肝竇狹窄有所恢復(fù),見圖1。

Figure 1.Morphological characteristics of liver in all groups (HE staining，×400).

圖1 HE染色法觀察各組肝臟的形態(tài)學(xué)特點

3 人參皂苷Rb1對肝組織細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的影響

與control組比較，model組大鼠肝臟組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD表達顯著提高(P<0.01)；與model組比較，Rb1組與simvastatin組大鼠肝臟NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)。Rb1組與simvastatin組比較無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

Figure 2.The protein levels of NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18 and GSDMD in the rat liver of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsmodel group.

圖2 各組大鼠肝臟組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD蛋白水平的比較

4 人參皂苷Rb1對肝組織細(xì)胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表達的影響

與control組比較，model組大鼠肝臟組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表達顯著提高(P<0.01)；與model組比較，Rb1組與simvastatin組大鼠肝臟NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表達顯著降低(P<0.05或P<0.01),見表3。

表3 人參皂苷Rb1對大鼠肝臟NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和GSDMD mRNA表達量的影響

Table 3. Effect of ginsenoside Rb1 on the expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18 and GSDMD mRNA in liver of rats (Mean±SD.n=8)

GroupNLRP3Caspase-1IL-1βIL-18GSDMDControl1.001.001.001.001.00Model2.07±0.46??3.88±0.15??4.66±0.58??5.43±0.53??3.53±0.45??Rb11.21±0.31#2.85±0.62#3.19±0.47#3.18±0.41##2.39±0.13#Simvastatin1.27±0.17#2.51±0.36##3.10±0.77#2.91±0.21##2.13±0.45##

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05;##P<0.01vsmodel group.

討 論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對血脂異常的認(rèn)識源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的“膏脂學(xué)說”[11-12]，與“痰濁”密切相關(guān)，痰濁與脾關(guān)系密切?！夺t(yī)宗必讀》曰：“脾土虛弱，清者難升，濁者難降，留中滯膈，瘀而成痰”。若脾運化水液功能失常，導(dǎo)致水液內(nèi)停，可聚濕成痰，痰阻氣滯，日久則血行不暢，瘀血內(nèi)生，痰瘀交阻，可見補脾氣在治療血脂異常中的重要性。

人參最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補脾益肺等功效。研究證明其有效成分人參皂苷具有降血脂、抗肝損傷等作用。人參皂苷Rb1、Rg3和Rg5均可以改善肝臟脂肪變性[13-15]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中 TG、TC和LDL-C 含量明顯升高，HDL-C 明顯下降，HE染色結(jié)果顯示存在大量的脂質(zhì)沉積和脂肪變性。與模型組比較，人參皂苷Rb1組大鼠血清中 TG、TC和LDL-C 含量顯著降低，HDL-C 明顯升高，肝細(xì)胞脂肪變性也有不同程度的恢復(fù)，提示人參皂苷Rb1在一定程度上可以起到降低血脂、減輕肝臟脂質(zhì)沉積的作用。

細(xì)胞焦亡是程序性促炎形式的細(xì)胞死亡，最顯著的特征是質(zhì)膜完整性喪失和胞質(zhì)物質(zhì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境。細(xì)胞焦亡發(fā)生時，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)可形成1～2 nm非選擇性的孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外的離子梯度消失，滲透壓增加導(dǎo)致細(xì)胞外液進入胞內(nèi)，細(xì)胞腫脹，最后導(dǎo)致細(xì)胞溶解[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD蛋白是細(xì)胞焦亡中形成細(xì)胞孔道的特征性效應(yīng)分子，其N末端片段的孔隙形成是發(fā)生細(xì)胞焦亡的驅(qū)動因素[18]。Shi等[19]發(fā)現(xiàn)，GSDMD-/-鼠細(xì)胞焦亡的數(shù)量明顯減少，可見GSDMD蛋白在細(xì)胞焦亡中的重要作用。本實驗通過Western blot法和RT-qPCR法檢測GSDMD蛋白及其mRNA的表達情況以評價高脂血癥大鼠肝臟細(xì)胞的細(xì)胞焦亡情況，并探討人參皂苷Rb1對其的影響。實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟的GSDMD蛋白及其mRNA顯著升高;經(jīng)過人參皂苷Rb1治療后，大鼠肝臟的GSDMD蛋白及其mRNA表達顯著降低，說明人參皂苷Rb1具有抑制高脂血癥大鼠肝臟細(xì)胞焦亡的作用。

炎癥小體調(diào)控細(xì)胞焦亡的發(fā)生，活化的NLRP3 炎癥小體是一種基于NLRP3受體寡聚而形成的大分子復(fù)合物[20-21]。NLRP3蛋白通過NACHT結(jié)構(gòu)域發(fā)生自我寡聚，借助PYD結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白ASC發(fā)生相互作用，進而通過CARD 結(jié)構(gòu)域招募胞內(nèi)的caspase-1前體，并使之發(fā)生自我剪切，釋放出具有水解酶活性的成熟caspase-1[22]?；罨腸aspase-1 將剪切底物 IL-1β 及 IL-18 前體轉(zhuǎn)變成具有促炎功能的成熟 IL-1β 及 IL-18，并釋放至胞外。研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL促進巨噬細(xì)胞caspase-1活化，并且NLRP3/caspase-1通路參與ox-LDL誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞裂解、DNA斷裂以及IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[23]，缺乏IL-1β可降低ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的的嚴(yán)重程度[24]。本研究Western blot與RT-qPCR結(jié)果表明，模型組大鼠肝臟NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表達顯著升高，提示細(xì)胞焦亡參與了高脂血癥大鼠肝細(xì)胞的損傷過程，而肝細(xì)胞焦亡相關(guān)因子NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18可能是引起炎癥反應(yīng)的重要因素。經(jīng)過人參皂苷Rb1治療后，大鼠肝臟的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表達顯著降低，說明人參皂苷Rb1具有一定程度的抑制高脂血癥大鼠肝臟細(xì)胞焦亡的作用。

綜上所述，人參皂苷Rb1通過降低肝細(xì)胞焦亡相關(guān)因子的表達實現(xiàn)對高脂血癥大鼠肝臟的保護作用，可能是其減輕肝臟脂質(zhì)沉積的機制之一。本研究可能為臨床防治肝臟相關(guān)疾病提供新靶點。