miR-23b-3p靶向XIAP調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究*

蔡松濤， 孫京濤， 魏 瑄

(鄭州市骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)病二科， 河南 鄭州 450052)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種由于自身免疫調(diào)節(jié)功能紊亂而造成的慢性關(guān)節(jié)疾病，患者關(guān)節(jié)處滑膜細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，這種與腫瘤細(xì)胞類似的侵蝕性生長(zhǎng)會(huì)對(duì)軟骨組織造成極為的嚴(yán)重破壞，進(jìn)而導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)疼痛、畸形以及關(guān)節(jié)的活動(dòng)受到限制[1-2]。總體來說，RA受外界環(huán)境和個(gè)人體質(zhì)以及生活習(xí)慣的影響，然而RA的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22 nt,廣泛存在于真核生物中保守的非編碼RNA，可特異性作用于下游靶基因的3’-UTR區(qū)，降解下游靶基因的mRNA或者阻止靶基因的蛋白翻譯過程，從而發(fā)揮對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，miRNA可將信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白作為開關(guān)，通過調(diào)控靶基因的活性來影響信號(hào)通路的傳遞，從而影響細(xì)胞增殖代謝進(jìn)程[3-4]。miRNA表達(dá)水平的異常往往與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)，在RA患者中多種miRNA表達(dá)存在異常，miR-155、miR-499和miR-146a等顯著上調(diào)[5-6]，而miR-22、miR-124a、miR-23b和miR-34a等顯著下調(diào)[7-10]。由此可見，miRNA在RA的病變過程中發(fā)揮著重要作用。通過TargetScan分析可知，RA滑膜成纖維細(xì)胞中低表達(dá)的miR-23b-3p與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)具有靶向關(guān)系，本研究將設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-23b-3p對(duì)XIAP的靶向關(guān)系并探究其可能的具體調(diào)控機(jī)制，以期為RA新的靶點(diǎn)治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人正常關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞購(gòu)自上海賽百慷公司。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶Ⅰ購(gòu)自Gibco；抗GAPDH、Ki67和Bcl-2抗體以及Ⅱ抗購(gòu)自Cell Signaling Technology；雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自Biotium；miR-23b-3p模擬物和抑制物購(gòu)自上海吉瑪公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自Introvigen；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購(gòu)自Thermo；合成其余分子試劑購(gòu)于上海生工生物工程公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Bio-Rad；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche；引物由北京華大基因公司提供。

2 方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中，待其融化后轉(zhuǎn)入含有DMEM培養(yǎng)液的離心管中，1 500×g離心5 min后去除上清，少量培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2和95%相對(duì)濕度條件下靜置培養(yǎng)。

2.2雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 設(shè)計(jì)并合成含有miR-23b-3p結(jié)合位點(diǎn)的XIAP 3’-UTR正常片段及其突變體，將其插入pMIR-REPORT載體的報(bào)告基因下游區(qū)域，獲得含有XIAP的WT-3’-UTR和Mut-3’-UTR的重組質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000將miR-23b-3p模擬物與XIAP的WT-3’-UTR或Mut-3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，48 h后使用雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)螢光素酶相對(duì)活性，具體參照說明書。

2.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照5×104濃度接種于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞的融合度生長(zhǎng)至75%～85%，使用0.5%胰蛋白酶消化后，按照Lipofectamine 2000說明書分別將miR-23b-3p模擬物、miR-23b-3p抑制物和miRNA對(duì)照(negative control, NC)組轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

2.4RT-qPCR分析miR-23b-3p和XIAP mRNA的表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率80%時(shí)，收集細(xì)胞，使用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA，電泳檢測(cè)質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作參考說明書。實(shí)驗(yàn)以U6和GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算公式為2-ΔΔCt，每組3個(gè)重復(fù)。U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’； miR-23b-3p的上游引物序列為5’-CGCATCACATTGCCAGGG-3’,下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。GAPDH上游引物為5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’；XIAP上游引物5’-AATTGGGAACCTTGTGATCG-3’,下游引物為5’-AGAAAGTGTCGCCTGTGTT-3’。反應(yīng)體系為20 μL，具體參考說明書。

2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的活力 調(diào)整轉(zhuǎn)染成功的3組細(xì)胞濃度為2×108/L，每孔100 μL接種至96孔板中，在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96 h后，避光添加100 μL CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值，繪制細(xì)胞活力隨時(shí)間變化的曲線，每組3個(gè)重復(fù)。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 離心收集成功轉(zhuǎn)染miR-23b-3p模擬物、抑制物和對(duì)照miRNA的3組細(xì)胞，PBS緩沖液重懸細(xì)胞后，避光條件下加入含有propidium iodide (PI)和Annexin V-FITC的溶液，孵育20 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，每組3個(gè)重復(fù)。

2.7Western blot分析 收集成功轉(zhuǎn)染3組細(xì)胞，RIPA裂解提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，離心收集上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每組細(xì)胞取60 μg蛋白做SDS-PAGE，結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。之后，使用BCA低溫封閉過夜，TBST洗膜5次，加入Ⅰ抗搖晃孵育2 h，TBST再次洗膜5次，加入Ⅱ抗搖晃孵育1 h，TBST最后洗膜5次。將膜取出在暗室中進(jìn)行曝光成像，并對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件，計(jì)量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組和多組間比較分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-23b-3p和XIAP mRNA的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，正?；こ衫w維細(xì)胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的miR-23b-3p相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.03和0.42±0.05，XIAP mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.05和1.56±0.11。與正常關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的miR-23b-3p表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),XIAP的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-23b-3p and XIAP mRNA in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中miR-23b-3p和XIAP mRNA表達(dá)水平

2 XIAP是miR-23b-3p的潛在靶標(biāo)

TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,XIAP的3’-UTR中含有與miR-23b-3p種子區(qū)互補(bǔ)序列,見圖2A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與XIAP-3’-UTR-WT NC組相比，miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染使螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-Mut共轉(zhuǎn)染后螢光素酶的活性無(wú)顯著變化(P>0.05)，見圖2B。

Figure 2.Verification of targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP. A: the targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP was predicted by TargetScan; B: dual-luciferase reporter assay was used to confirm the targeting relationship. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs3′-UTR-WT NC group.

圖2 miR-23b-3p與XIAP靶向關(guān)系驗(yàn)證

3 miR-23b-3p抑制XIAP的表達(dá)

與對(duì)照組相比，miR-23b-3p模擬物顯著提高miR-23b-3p表達(dá)水平，減少XIAP表達(dá)水平；miR-23b-3p抑制物則使miR-23b-3p表達(dá)下調(diào)，XIAP表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

4 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞活力具有抑制作用

CCK-8法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-23b-3p模擬物對(duì)細(xì)胞的活力出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象，miR-23b-3p抑制劑促進(jìn)了細(xì)胞活力，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

5 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-23b-3p抑制物組凋亡率顯著減少，而miR-23b-3p模擬物則促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡(P<0.05),見圖5。

Figure 3.The expression of XIAP mRNA and miR-23b-3p detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖3 miR-23b-3p模擬物和抑制物對(duì)miR-23b-3p和XIAP mRNA表達(dá)水平的影響

Figure 4.The effect of miR-23b-3p on the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞活力的影響

6 miR-23b-3p對(duì)增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測(cè)miR-23b-3p抑制物組、模擬物和對(duì)照組胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量，結(jié)果顯示，3組細(xì)胞內(nèi)的Ki67蛋白表達(dá)量分別為：miR-23b-3p抑制物組1.14±0.20，對(duì)照組0.81±0.03，miR-23b-3p模擬物組0.35±0.02；Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為：miR-23b-3p抑制物組2.27±0.20，對(duì)照組1.02±0.04，miR-23b-3p模擬物組0.76±0.04，整體比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FKi67=34.308，PKi67<0.05；FBcl-2=135.771，PBcl-2<0.05),見圖6。

Figure 5.The effect of miR-23b-3p on apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖5 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.The protein expression levels of Ki67 and Bcl-2 were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖6 Western blot檢測(cè)Ki67和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

討 論

RA是一種表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞異常增殖的自身免疫性疾病，其滑膜細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)可增生至8層以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常滑膜組織的1～2層的細(xì)胞層，這種過度異常增殖的滑膜最終將向關(guān)節(jié)處的軟骨組織侵襲性生長(zhǎng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，造成關(guān)節(jié)活動(dòng)受限[11-12]。其中，在RA中起著重要作用的滑膜細(xì)胞即為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞，在RA患者滑液中含有多種細(xì)胞促炎因子及抗凋亡因子，使滑膜組織細(xì)胞的增殖與凋亡速度失衡，從而出現(xiàn)異常增殖的現(xiàn)象[13-15]。在RA出現(xiàn)多種miRNA上調(diào)或下調(diào)，包括顯著上調(diào)的miR-155，其被證實(shí)參與了細(xì)胞的多種炎癥反應(yīng)，能夠抑制MMP-3來減緩組織炎癥損傷和增強(qiáng)組織中CD14+細(xì)胞的抗凋亡能力[6,16-17]；低表達(dá)的miR-124a與增殖相關(guān)蛋白CDK2以及MCP-1具有靶向關(guān)系，其下調(diào)表達(dá)促進(jìn)了RA的發(fā)生進(jìn)程[9]。除此之外，miR-23b是一種具有抗炎作用的保護(hù)性miRNA，在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)同樣顯著下調(diào)，并且其介導(dǎo)的TGF-β、IκB激酶、TAB2和細(xì)胞因子的表達(dá)受IL-7炎癥因子的負(fù)調(diào)控[10, 18-19]。為探討miR-23b-3p在RA的作用機(jī)制，本研究通過RT-qPCR檢測(cè)miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平是正常細(xì)胞的一半左右，顯著下調(diào)表達(dá)，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。

XIAP是IAP家族中的重要一員，可直接通過與caspase類蛋白作用而抑制其功能，是細(xì)胞中一種不可或缺的凋亡抑制因子[20]。多種疾病均伴隨著XIAP的失調(diào)表達(dá)，其中XIAP的丟失會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的敏感性，XIAP上調(diào)表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞的抗輻射能力并且可能與腫瘤有著重要聯(lián)系[21-24]。除此之外，有研究表明XIAP能夠依賴自身的抗凋亡能力對(duì)細(xì)胞的自噬途徑產(chǎn)生重要影響[25]。同時(shí)，XIAP在腫瘤中受到多種miRNA的調(diào)控，與細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)有著重要聯(lián)系[21, 26-28]。在本研究，TargeScan軟件分析顯示，XIAP的3’UTR含有miR-23b-3p種子互補(bǔ)區(qū)的保守序列，是miR-23b-3p的一個(gè)潛在靶基因。本研究將miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，螢光素酶活性顯著降低，證實(shí)了兩者之間的靶向關(guān)系。為進(jìn)一步探討兩者之間的具體調(diào)控機(jī)制，將miR-23b-3p的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-23b-3p模擬物和抑制物后，XIAP mRNA分別顯著下調(diào)5倍和上調(diào)表達(dá)2倍左右，表明XIAP受miR-23b-3p的負(fù)向調(diào)控。此外，本研究表明轉(zhuǎn)染miR-23b-3p能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其發(fā)生凋亡，轉(zhuǎn)染抑制物的效果與之相反。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67和抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與miR-23b-3p表達(dá)量負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-23b-3p促使Ki67和Bcl-2下調(diào)表達(dá)，敲低miR-23b-3p則促進(jìn)促使Ki67和Bcl-2表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明，miR-23b-3p可通過靶向XIAP抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究雖探討了miR-23b-3p對(duì)XIAP的調(diào)控機(jī)制，但是文獻(xiàn)中提到的miR-23b-3p的抗炎作用和本研究證實(shí)的促凋亡保護(hù)機(jī)制之間的協(xié)同性仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-23b與RA有著緊密聯(lián)系，可通過靶向XIAP抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。