• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-23b-3p靶向XIAP調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究*

    2019-07-30 08:32:42蔡松濤孫京濤
    中國(guó)病理生理雜志 2019年7期
    關(guān)鍵詞:螢光滑膜類風(fēng)濕

    蔡松濤, 孫京濤, 魏 瑄

    (鄭州市骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)病二科, 河南 鄭州 450052)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種由于自身免疫調(diào)節(jié)功能紊亂而造成的慢性關(guān)節(jié)疾病,患者關(guān)節(jié)處滑膜細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖,這種與腫瘤細(xì)胞類似的侵蝕性生長(zhǎng)會(huì)對(duì)軟骨組織造成極為的嚴(yán)重破壞,進(jìn)而導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)疼痛、畸形以及關(guān)節(jié)的活動(dòng)受到限制[1-2]。總體來說,RA受外界環(huán)境和個(gè)人體質(zhì)以及生活習(xí)慣的影響,然而RA的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

    微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22 nt,廣泛存在于真核生物中保守的非編碼RNA,可特異性作用于下游靶基因的3’-UTR區(qū),降解下游靶基因的mRNA或者阻止靶基因的蛋白翻譯過程,從而發(fā)揮對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明,miRNA可將信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白作為開關(guān),通過調(diào)控靶基因的活性來影響信號(hào)通路的傳遞,從而影響細(xì)胞增殖代謝進(jìn)程[3-4]。miRNA表達(dá)水平的異常往往與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián),在RA患者中多種miRNA表達(dá)存在異常,miR-155、miR-499和miR-146a等顯著上調(diào)[5-6],而miR-22、miR-124a、miR-23b和miR-34a等顯著下調(diào)[7-10]。由此可見,miRNA在RA的病變過程中發(fā)揮著重要作用。通過TargetScan分析可知,RA滑膜成纖維細(xì)胞中低表達(dá)的miR-23b-3p與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)具有靶向關(guān)系,本研究將設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-23b-3p對(duì)XIAP的靶向關(guān)系并探究其可能的具體調(diào)控機(jī)制,以期為RA新的靶點(diǎn)治療提供參考資料。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    人正常關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞購(gòu)自上海賽百慷公司。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶Ⅰ購(gòu)自Gibco;抗GAPDH、Ki67和Bcl-2抗體以及Ⅱ抗購(gòu)自Cell Signaling Technology;雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自Biotium;miR-23b-3p模擬物和抑制物購(gòu)自上海吉瑪公司;TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自Introvigen;PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購(gòu)自Thermo;合成其余分子試劑購(gòu)于上海生工生物工程公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自Bio-Rad;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche;引物由北京華大基因公司提供。

    2 方法

    2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中,待其融化后轉(zhuǎn)入含有DMEM培養(yǎng)液的離心管中,1 500×g離心5 min后去除上清,少量培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,于37 ℃、5%CO2和95%相對(duì)濕度條件下靜置培養(yǎng)。

    2.2雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 設(shè)計(jì)并合成含有miR-23b-3p結(jié)合位點(diǎn)的XIAP 3’-UTR正常片段及其突變體,將其插入pMIR-REPORT載體的報(bào)告基因下游區(qū)域,獲得含有XIAP的WT-3’-UTR和Mut-3’-UTR的重組質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000將miR-23b-3p模擬物與XIAP的WT-3’-UTR或Mut-3’-UTR重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,48 h后使用雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)螢光素酶相對(duì)活性,具體參照說明書。

    2.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按照5×104濃度接種于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞的融合度生長(zhǎng)至75%~85%,使用0.5%胰蛋白酶消化后,按照Lipofectamine 2000說明書分別將miR-23b-3p模擬物、miR-23b-3p抑制物和miRNA對(duì)照(negative control, NC)組轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

    2.4RT-qPCR分析miR-23b-3p和XIAP mRNA的表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞覆蓋率80%時(shí),收集細(xì)胞,使用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA,電泳檢測(cè)質(zhì)量,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,具體操作參考說明書。實(shí)驗(yàn)以U6和GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算公式為2-ΔΔCt,每組3個(gè)重復(fù)。U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’; miR-23b-3p的上游引物序列為5’-CGCATCACATTGCCAGGG-3’,下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。GAPDH上游引物為5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’,下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’;XIAP上游引物5’-AATTGGGAACCTTGTGATCG-3’,下游引物為5’-AGAAAGTGTCGCCTGTGTT-3’。反應(yīng)體系為20 μL,具體參考說明書。

    2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的活力 調(diào)整轉(zhuǎn)染成功的3組細(xì)胞濃度為2×108/L,每孔100 μL接種至96孔板中,在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96 h后,避光添加100 μL CCK-8溶液,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值,繪制細(xì)胞活力隨時(shí)間變化的曲線,每組3個(gè)重復(fù)。

    2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 離心收集成功轉(zhuǎn)染miR-23b-3p模擬物、抑制物和對(duì)照miRNA的3組細(xì)胞,PBS緩沖液重懸細(xì)胞后,避光條件下加入含有propidium iodide (PI)和Annexin V-FITC的溶液,孵育20 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,每組3個(gè)重復(fù)。

    2.7Western blot分析 收集成功轉(zhuǎn)染3組細(xì)胞,RIPA裂解提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,離心收集上清液,BCA法進(jìn)行蛋白定量。每組細(xì)胞取60 μg蛋白做SDS-PAGE,結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。之后,使用BCA低溫封閉過夜,TBST洗膜5次,加入Ⅰ抗搖晃孵育2 h,TBST再次洗膜5次,加入Ⅱ抗搖晃孵育1 h,TBST最后洗膜5次。將膜取出在暗室中進(jìn)行曝光成像,并對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件,計(jì)量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組和多組間比較分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 miR-23b-3p和XIAP mRNA的表達(dá)水平

    RT-qPCR結(jié)果顯示,正?;こ衫w維細(xì)胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的miR-23b-3p相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.03和0.42±0.05,XIAP mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.05和1.56±0.11。與正常關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞相比,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的miR-23b-3p表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),XIAP的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),見圖1。

    Figure 1.The expression level of miR-23b-3p and XIAP mRNA in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

    圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中miR-23b-3p和XIAP mRNA表達(dá)水平

    2 XIAP是miR-23b-3p的潛在靶標(biāo)

    TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,XIAP的3’-UTR中含有與miR-23b-3p種子區(qū)互補(bǔ)序列,見圖2A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,與XIAP-3’-UTR-WT NC組相比,miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染使螢光素酶活性顯著降低(P<0.05),而miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-Mut共轉(zhuǎn)染后螢光素酶的活性無(wú)顯著變化(P>0.05),見圖2B。

    Figure 2.Verification of targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP. A: the targeting relationship between miR-23b-3p and XIAP was predicted by TargetScan; B: dual-luciferase reporter assay was used to confirm the targeting relationship. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs3′-UTR-WT NC group.

    圖2 miR-23b-3p與XIAP靶向關(guān)系驗(yàn)證

    3 miR-23b-3p抑制XIAP的表達(dá)

    與對(duì)照組相比,miR-23b-3p模擬物顯著提高miR-23b-3p表達(dá)水平,減少XIAP表達(dá)水平;miR-23b-3p抑制物則使miR-23b-3p表達(dá)下調(diào),XIAP表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    4 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞活力具有抑制作用

    CCK-8法結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-23b-3p模擬物對(duì)細(xì)胞的活力出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象,miR-23b-3p抑制劑促進(jìn)了細(xì)胞活力,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    5 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-23b-3p抑制物組凋亡率顯著減少,而miR-23b-3p模擬物則促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡(P<0.05),見圖5。

    Figure 3.The expression of XIAP mRNA and miR-23b-3p detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

    圖3 miR-23b-3p模擬物和抑制物對(duì)miR-23b-3p和XIAP mRNA表達(dá)水平的影響

    Figure 4.The effect of miR-23b-3p on the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

    圖4 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞活力的影響

    6 miR-23b-3p對(duì)增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

    Western blot檢測(cè)miR-23b-3p抑制物組、模擬物和對(duì)照組胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量,結(jié)果顯示,3組細(xì)胞內(nèi)的Ki67蛋白表達(dá)量分別為:miR-23b-3p抑制物組1.14±0.20,對(duì)照組0.81±0.03,miR-23b-3p模擬物組0.35±0.02;Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為:miR-23b-3p抑制物組2.27±0.20,對(duì)照組1.02±0.04,miR-23b-3p模擬物組0.76±0.04,整體比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FKi67=34.308,PKi67<0.05;FBcl-2=135.771,PBcl-2<0.05),見圖6。

    Figure 5.The effect of miR-23b-3p on apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

    圖5 miR-23b-3p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

    Figure 6.The protein expression levels of Ki67 and Bcl-2 were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group.

    圖6 Western blot檢測(cè)Ki67和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

    討 論

    RA是一種表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞異常增殖的自身免疫性疾病,其滑膜細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)可增生至8層以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常滑膜組織的1~2層的細(xì)胞層,這種過度異常增殖的滑膜最終將向關(guān)節(jié)處的軟骨組織侵襲性生長(zhǎng),導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,造成關(guān)節(jié)活動(dòng)受限[11-12]。其中,在RA中起著重要作用的滑膜細(xì)胞即為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞,在RA患者滑液中含有多種細(xì)胞促炎因子及抗凋亡因子,使滑膜組織細(xì)胞的增殖與凋亡速度失衡,從而出現(xiàn)異常增殖的現(xiàn)象[13-15]。在RA出現(xiàn)多種miRNA上調(diào)或下調(diào),包括顯著上調(diào)的miR-155,其被證實(shí)參與了細(xì)胞的多種炎癥反應(yīng),能夠抑制MMP-3來減緩組織炎癥損傷和增強(qiáng)組織中CD14+細(xì)胞的抗凋亡能力[6,16-17];低表達(dá)的miR-124a與增殖相關(guān)蛋白CDK2以及MCP-1具有靶向關(guān)系,其下調(diào)表達(dá)促進(jìn)了RA的發(fā)生進(jìn)程[9]。除此之外,miR-23b是一種具有抗炎作用的保護(hù)性miRNA,在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)同樣顯著下調(diào),并且其介導(dǎo)的TGF-β、IκB激酶、TAB2和細(xì)胞因子的表達(dá)受IL-7炎癥因子的負(fù)調(diào)控[10, 18-19]。為探討miR-23b-3p在RA的作用機(jī)制,本研究通過RT-qPCR檢測(cè)miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,miR-23b-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平是正常細(xì)胞的一半左右,顯著下調(diào)表達(dá),與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。

    XIAP是IAP家族中的重要一員,可直接通過與caspase類蛋白作用而抑制其功能,是細(xì)胞中一種不可或缺的凋亡抑制因子[20]。多種疾病均伴隨著XIAP的失調(diào)表達(dá),其中XIAP的丟失會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的敏感性,XIAP上調(diào)表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞的抗輻射能力并且可能與腫瘤有著重要聯(lián)系[21-24]。除此之外,有研究表明XIAP能夠依賴自身的抗凋亡能力對(duì)細(xì)胞的自噬途徑產(chǎn)生重要影響[25]。同時(shí),XIAP在腫瘤中受到多種miRNA的調(diào)控,與細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)有著重要聯(lián)系[21, 26-28]。在本研究,TargeScan軟件分析顯示,XIAP的3’UTR含有miR-23b-3p種子互補(bǔ)區(qū)的保守序列,是miR-23b-3p的一個(gè)潛在靶基因。本研究將miR-23b-3p模擬物與XIAP-3’-UTR-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,螢光素酶活性顯著降低,證實(shí)了兩者之間的靶向關(guān)系。為進(jìn)一步探討兩者之間的具體調(diào)控機(jī)制,將miR-23b-3p的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-23b-3p模擬物和抑制物后,XIAP mRNA分別顯著下調(diào)5倍和上調(diào)表達(dá)2倍左右,表明XIAP受miR-23b-3p的負(fù)向調(diào)控。此外,本研究表明轉(zhuǎn)染miR-23b-3p能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其發(fā)生凋亡,轉(zhuǎn)染抑制物的效果與之相反。此時(shí),細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67和抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與miR-23b-3p表達(dá)量負(fù)相關(guān),上調(diào)miR-23b-3p促使Ki67和Bcl-2下調(diào)表達(dá),敲低miR-23b-3p則促進(jìn)促使Ki67和Bcl-2表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明,miR-23b-3p可通過靶向XIAP抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究雖探討了miR-23b-3p對(duì)XIAP的調(diào)控機(jī)制,但是文獻(xiàn)中提到的miR-23b-3p的抗炎作用和本研究證實(shí)的促凋亡保護(hù)機(jī)制之間的協(xié)同性仍需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,miR-23b與RA有著緊密聯(lián)系,可通過靶向XIAP抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。

    猜你喜歡
    螢光滑膜類風(fēng)濕
    火蟲發(fā)光為什么一閃一閃的
    基于滑膜控制的船舶永磁同步推進(jìn)電機(jī)直接轉(zhuǎn)矩控制研究
    高層建筑施工中的滑膜施工技術(shù)要點(diǎn)探討
    益腎蠲痹丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的Meta分析
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:26
    求醫(yī)更要求己的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
    流螢之光
    活色螢光“耀”個(gè)性
    鳳凰生活(2018年8期)2018-09-03 10:38:12
    流螢之光
    滑膜肉瘤的研究進(jìn)展
    原發(fā)性肺滑膜肉瘤診斷與治療——附一例報(bào)告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    久久久久久久精品精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产国拍精品亚洲av在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 男女下面进入的视频免费午夜| av天堂中文字幕网| 午夜免费男女啪啪视频观看| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚州av有码| 一区在线观看完整版| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产免费福利视频在线观看| www.色视频.com| 搡老乐熟女国产| 99久久综合免费| 秋霞在线观看毛片| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品熟女少妇av免费看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲国产精品国产精品| 少妇高潮的动态图| 亚洲熟女精品中文字幕| 中国国产av一级| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| a级毛色黄片| 日本欧美视频一区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成人特级av手机在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 成人国产麻豆网| 亚洲精品国产成人久久av| 午夜老司机福利剧场| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 丝袜脚勾引网站| 久久久久久久久久久丰满| 91狼人影院| 中文天堂在线官网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av免费观看日本| 亚洲成人av在线免费| 九草在线视频观看| 麻豆乱淫一区二区| av女优亚洲男人天堂| 久久午夜福利片| 最后的刺客免费高清国语| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久网色| 久久青草综合色| 国产成人精品福利久久| 久久久欧美国产精品| 如何舔出高潮| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久国产精品人妻一区二区| 在线 av 中文字幕| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产在视频线精品| 欧美zozozo另类| 一区二区三区免费毛片| 国产亚洲精品久久久com| 性色avwww在线观看| 大香蕉97超碰在线| 在线免费十八禁| 欧美xxxx性猛交bbbb| 天堂俺去俺来也www色官网| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 高清日韩中文字幕在线| 国产精品一及| 久久人人爽人人爽人人片va| 一级毛片电影观看| 国产精品免费大片| 搡老乐熟女国产| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产免费视频播放在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 免费观看av网站的网址| 交换朋友夫妻互换小说| 国产黄频视频在线观看| 美女主播在线视频| 亚洲av.av天堂| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美清纯卡通| 国产色婷婷99| 婷婷色麻豆天堂久久| 多毛熟女@视频| 国产片特级美女逼逼视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久久久久久人人人人人人| 看非洲黑人一级黄片| 免费av中文字幕在线| 日韩av免费高清视频| 午夜激情福利司机影院| 久久久久网色| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日本爱情动作片www.在线观看| 嫩草影院入口| 在线免费十八禁| 国产精品伦人一区二区| 久久久久久人妻| 精品久久久噜噜| 中文资源天堂在线| h日本视频在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲真实伦在线观看| 黑人高潮一二区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产在视频线精品| 国产精品国产av在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品免费大片| 亚洲精品第二区| 熟女av电影| 一区二区三区精品91| 久久影院123| 三级国产精品片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美zozozo另类| 高清毛片免费看| 国产黄片美女视频| 国产亚洲91精品色在线| 麻豆乱淫一区二区| 黄色日韩在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美高清性xxxxhd video| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品av视频在线免费观看| 能在线免费看毛片的网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 在线观看一区二区三区激情| av在线观看视频网站免费| 噜噜噜噜噜久久久久久91| a级毛色黄片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一区在线观看完整版| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99热这里只有精品一区| 边亲边吃奶的免费视频| 偷拍熟女少妇极品色| 久热久热在线精品观看| 国产成人精品福利久久| kizo精华| 哪个播放器可以免费观看大片| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产av精品麻豆| 各种免费的搞黄视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99re6热这里在线精品视频| 观看av在线不卡| 精品久久久久久久末码| 亚洲av成人精品一区久久| 永久网站在线| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲成色77777| 日韩大片免费观看网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲精品色激情综合| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 国产免费视频播放在线视频| 99久久精品一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲精品一区蜜桃| 在线观看av片永久免费下载| 91久久精品国产一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 女人久久www免费人成看片| 七月丁香在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区| 伦精品一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 久久久久精品性色| 色综合色国产| 麻豆国产97在线/欧美| 久久久久性生活片| 国产精品久久久久久久电影| 深爱激情五月婷婷| 免费黄频网站在线观看国产| 91精品国产九色| 内射极品少妇av片p| 精华霜和精华液先用哪个| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人综合一区亚洲| 日本午夜av视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久这里有精品视频免费| 深夜a级毛片| 男男h啪啪无遮挡| 国产成人精品一,二区| freevideosex欧美| 日韩免费高清中文字幕av| 成人一区二区视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 亚洲综合精品二区| 午夜视频国产福利| av国产免费在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲自偷自拍三级| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品aⅴ在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久久久久久久久丰满| 91久久精品电影网| 男男h啪啪无遮挡| 美女中出高潮动态图| 国产精品无大码| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 丰满少妇做爰视频| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久亚洲国产成人精品v| 日本黄大片高清| 99久久中文字幕三级久久日本| 校园人妻丝袜中文字幕| 99热全是精品| videos熟女内射| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产极品天堂在线| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品.久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄色一级大片看看| 国国产精品蜜臀av免费| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 亚洲四区av| 国产成人一区二区在线| 777米奇影视久久| 欧美丝袜亚洲另类| 精品熟女少妇av免费看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产日韩欧美在线精品| 少妇人妻 视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲成色77777| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲图色成人| 亚洲天堂av无毛| 国产精品嫩草影院av在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 色哟哟·www| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线看a的网站| 一区二区三区四区激情视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲av.av天堂| 性色av一级| 免费观看在线日韩| 久久国产亚洲av麻豆专区| a级一级毛片免费在线观看| 欧美bdsm另类| 人妻系列 视频| 欧美三级亚洲精品| 男男h啪啪无遮挡| 国产又色又爽无遮挡免| 一级片'在线观看视频| 国产精品一二三区在线看| 免费观看av网站的网址| 六月丁香七月| 国产毛片在线视频| 九色成人免费人妻av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 免费大片黄手机在线观看| 国产精品免费大片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本色播在线视频| 免费黄色在线免费观看| 永久网站在线| 精品久久久精品久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 最黄视频免费看| 国产成人aa在线观看| 91精品国产九色| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲在久久综合| 一级a做视频免费观看| 九九爱精品视频在线观看| freevideosex欧美| 水蜜桃什么品种好| 我的老师免费观看完整版| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一级a做视频免费观看| 日日啪夜夜爽| 国产一区二区在线观看日韩| 成人二区视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | av在线播放精品| 久久久精品免费免费高清| 久久久成人免费电影| 色视频www国产| 两个人的视频大全免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久这里有精品视频免费| 最近最新中文字幕免费大全7| 超碰97精品在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 高清不卡的av网站| 亚洲,欧美,日韩| 国国产精品蜜臀av免费| 国产成人a区在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 春色校园在线视频观看| 欧美最新免费一区二区三区| 久久97久久精品| 另类亚洲欧美激情| 国产精品免费大片| 精品一品国产午夜福利视频| 大码成人一级视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇人妻 视频| 美女视频免费永久观看网站| 日本与韩国留学比较| 下体分泌物呈黄色| 中文天堂在线官网| 人妻少妇偷人精品九色| 成人毛片a级毛片在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲最大成人中文| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费少妇av软件| 久久久久久伊人网av| 欧美成人精品欧美一级黄| 日日啪夜夜撸| 久久人人爽人人片av| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲图色成人| 日韩制服骚丝袜av| 免费黄网站久久成人精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 三级国产精品片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品久久久精品久久久| 99视频精品全部免费 在线| 免费观看无遮挡的男女| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 色综合色国产| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 舔av片在线| 久久久精品免费免费高清| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 日本wwww免费看| 如何舔出高潮| 欧美bdsm另类| 国产久久久一区二区三区| 黄片wwwwww| 极品教师在线视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久99热6这里只有精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美少妇被猛烈插入视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人妻一区二区av| 精品国产乱码久久久久久小说| 好男人视频免费观看在线| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲精品视频女| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲精品国产av蜜桃| 日本黄大片高清| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲久久久国产精品| 黑人高潮一二区| 麻豆成人午夜福利视频| 大陆偷拍与自拍| 久久久精品94久久精品| tube8黄色片| 免费高清在线观看视频在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 美女中出高潮动态图| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲成人手机| 国产毛片在线视频| 在线观看三级黄色| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 简卡轻食公司| 夫妻性生交免费视频一级片| 一区二区三区四区激情视频| 午夜免费观看性视频| 成人国产av品久久久| 日韩中文字幕视频在线看片 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日本黄色片子视频| 日韩av不卡免费在线播放| 美女福利国产在线 | 亚洲怡红院男人天堂| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| av不卡在线播放| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 99久久中文字幕三级久久日本| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 精品久久久噜噜| 亚洲av成人精品一二三区| 成人二区视频| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品久久久久成人av| 久久国产精品大桥未久av | 久久97久久精品| 熟女av电影| 国产成人91sexporn| 国产中年淑女户外野战色| 色网站视频免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品国产av在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 久久国产精品大桥未久av | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 黄色欧美视频在线观看| 97超视频在线观看视频| 精品亚洲成a人片在线观看 | 中文字幕亚洲精品专区| 婷婷色麻豆天堂久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久6这里有精品| 国产成人一区二区在线| 高清av免费在线| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久av不卡| 色5月婷婷丁香| 97在线视频观看| 国产v大片淫在线免费观看| 久久国产乱子免费精品| 舔av片在线| 日韩电影二区| 精品久久久久久电影网| 国产视频内射| 久久久久久九九精品二区国产| 一本一本综合久久| 看十八女毛片水多多多| 久久精品久久精品一区二区三区| 尾随美女入室| 国产精品三级大全| 国产高清三级在线| 国产成人91sexporn| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 久久久久精品性色| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国模一区二区三区四区视频| www.av在线官网国产| 超碰av人人做人人爽久久| 少妇的逼水好多| 国产亚洲91精品色在线| av在线老鸭窝| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文欧美无线码| 久久久久性生活片| 男女边摸边吃奶| 人妻少妇偷人精品九色| 1000部很黄的大片| 久久国内精品自在自线图片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久婷婷青草| 2018国产大陆天天弄谢| av在线app专区| 美女国产视频在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美bdsm另类| 美女视频免费永久观看网站| 在线观看免费日韩欧美大片 | 26uuu在线亚洲综合色| 久热久热在线精品观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 人妻系列 视频| 国产极品天堂在线| 一级黄片播放器| av网站免费在线观看视频| 国产淫片久久久久久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 大香蕉97超碰在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| .国产精品久久| 六月丁香七月| 免费av不卡在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 一边亲一边摸免费视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| av在线老鸭窝| 大码成人一级视频| 精品久久久噜噜| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产成人精品婷婷| 美女中出高潮动态图| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日本欧美视频一区| 国产成人精品婷婷| 精品视频人人做人人爽| 午夜激情久久久久久久| 夜夜爽夜夜爽视频| 一级片'在线观看视频| 免费少妇av软件| 国产男女内射视频| 联通29元200g的流量卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 日本av免费视频播放| 超碰97精品在线观看| av免费观看日本| 亚洲av不卡在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲图色成人| 国产精品一及| 亚洲第一av免费看| 国产男女内射视频| 久久婷婷青草| 一级毛片电影观看| 久久亚洲国产成人精品v| 一级毛片久久久久久久久女| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人免费无遮挡视频| 久久国产精品大桥未久av | 国产亚洲精品久久久com| 永久网站在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜福利在线在线| 久久99热6这里只有精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 我的女老师完整版在线观看| 日韩视频在线欧美| 久久久精品94久久精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久久久人妻精品一区果冻| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久青草综合色| h日本视频在线播放| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品一区二区性色av| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品无大码| 国产爽快片一区二区三区| 成人国产av品久久久| 国产成人aa在线观看| 久久99精品国语久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 97在线人人人人妻| 亚洲国产欧美在线一区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人影院久久| 久久亚洲国产成人精品v| 高清不卡的av网站| 国产av码专区亚洲av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| 成人二区视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久精品免费免费高清| 欧美一区二区亚洲| 久久女婷五月综合色啪小说| 热99国产精品久久久久久7| 男女啪啪激烈高潮av片| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲综合色惰| 精品一品国产午夜福利视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 久久久成人免费电影| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一级毛片电影观看| 日本黄色日本黄色录像| 婷婷色综合www| 亚洲精品亚洲一区二区|