杜鵑素通過增強Kv1.5和Kv2.1表達抑制尼古丁所致的肺動脈平滑肌細胞增殖*

侯曉敏， 張明升， 秦小江△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 2公共衛(wèi)生學(xué)院， 山西 太原 030001)

吸煙是心血管和肺部疾病發(fā)展的風(fēng)險因素之一[1]，其對人體健康的影響已逐漸受到公眾的普遍重視。尼古丁(nicotine)作為香煙煙霧的組成部分，約占煙草生物堿總量的95%[2]，能夠?qū)C體產(chǎn)生廣泛的影響，如影響心血管系統(tǒng)，通過影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)[1]升高肺動脈壓力，進而促進肺動脈高壓發(fā)生[3]等。杜鵑素(farrerol,Far)作為一種天然黃酮類化合物，可以對心血管產(chǎn)生保護作用。研究報道，杜鵑素能夠通過降低縫隙連接蛋白43的表達抑制血管緊張素Ⅱ所誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖[4]，體外實驗中杜鵑素可降低主動脈血管張力[5]，此外，杜鵑素還可以通過調(diào)整大鼠的基因表達譜改善自發(fā)性高血壓大鼠的血管損傷[6]。心血管疾病在很多情況下表現(xiàn)為血管平滑肌細胞增殖，本實驗通過使用尼古丁誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖,觀察不同濃度杜鵑素對尼古丁所致PASMCs增殖的作用，并進一步探討杜鵑素的作用與電壓依賴性鉀通道(voltage-de-pendent potassium channels，Kv)1.5和Kv2.1的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

杜鵑素(純度≥98%)：由山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實驗室合成提供。細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所。凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司?？筀v1.5、Kv2.1及Bax和Bcl-2多克隆抗體及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗：購自上海生工公司，優(yōu)級胎牛血清購自Scicell；DMEM/F12培養(yǎng)液購自武漢博士德公司；尼古丁購自北京伊普瑞斯公司。

2 方法

2.1大鼠PASMCs的培養(yǎng) 參照文獻分離得到大鼠PASMCs[7-9]。大鼠(腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg)麻醉后，取出其肺臟，顯微鏡下分離得到其肺動脈。鏡下將肺動脈縱向切開，用無菌棉簽刮去其內(nèi)膜，然后用鑷子剝?nèi)テ鋭用}外膜。用眼科剪將剩余肺動脈剪碎，使其呈現(xiàn)大約1 cm×1 cm×1 cm大小。然后加入含20%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，放入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2不同濃度尼古丁對PASMCs細胞計數(shù)的影響

將PASMCs接種于24孔板(每孔5×103個細胞)培養(yǎng)過夜。然后換液在無血清培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后將不同濃度(0.01，0.1，1和10 μmol/L)尼古丁加入細胞培養(yǎng)液中對PASMCs進行24 h培養(yǎng)，在培養(yǎng)結(jié)束時，收集PASMCs并進行細胞計數(shù)[10]。實驗重復(fù)6次。

2.3大鼠PASMCs的分組培養(yǎng) 將PASMCs隨機分成5組進行培養(yǎng)：正常對照(control)組，使用正常細胞培養(yǎng)液對PASMCs進行培養(yǎng)；尼古丁(nicotine)組，使用含有1 μmol/L尼古丁的培養(yǎng)液對PASMCs進行培養(yǎng)；尼古丁(1 μmol/L)+低濃度(10-6mol/L)中濃度(10-5mol/L)高濃度(10-4mol/L)Far組，分別使用同時含有1 μmol/L尼古丁和10-6、10-5或10-4mol/L杜鵑素的培養(yǎng)液對PASMCs進行培養(yǎng)。

2.4Caspase-3活性檢測 將PASMCs種植于6孔板，每孔5×104個細胞，按照方法2.3的描述分組干預(yù)48 h后, 1×PBS清洗PASMCs 2次，RIPA裂解收集細胞，按照caspase-3活性細胞凋亡檢測試劑盒說明書依次進行相關(guān)指標(biāo)的檢測[11]。實驗重復(fù)3次。

2.5CCK-8法檢測細胞活力 將PASMCs種植于96孔板，每孔5×103個細胞，按照方法2.3的描述分組干預(yù)48 h后，換成正常培養(yǎng)液，給每個孔中都加入CCK-8(10 μL)和新鮮培養(yǎng)液，然后放置于孵箱中(5% CO2、37℃)進行培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值[11]。

2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 取各組對數(shù)生長期的細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整待測細胞濃度為1×109/L。按照2.3的描述分組干預(yù)24 h后，按照試劑盒說明，取1 mL細胞300 ×g、4℃離心10 min，棄上清。然后將細胞懸于200 μL Binding Buffer，加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫下避光標(biāo)記10 min，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡[12-13]。

2.7RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2及Kv1.5和Kv2.1的mRNA表達 提取各組PASMCs總的RNA之后，參照文獻[9]嚴格依照RT-qPCR操作流程，檢測各組Kv1.5、Kv2.1、Bax和Bcl-2 mRNA相對表達量，每組實驗重復(fù)3次。引物委托上海生工合成，內(nèi)參照為GAPDH。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.8Western blot檢測凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2及Kv1.5和Kv2.1的蛋白表達

提取各組細胞總蛋白后，依據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書對蛋白濃度進行測定。然后依照Western blot操作步驟，檢測各組Kv1.5、Kv2.1、Bax和Bcl-2蛋白的表達，每組實驗重復(fù)3次。Ⅰ抗 Kv1.5、Kv2.1、Bax和Bcl-2多克隆抗體的稀釋度均為 1 ∶500 ，HRP標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋度均為 1 ∶1 000。內(nèi)參照為β-actin。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，采用方差分析進行多組間比較，LSD檢驗進行兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細胞計數(shù)法檢測尼古丁對大鼠PASMCs增殖的影響

與空白對照組比較，0.1～10 μmol/L的尼古丁可顯著增加PASMCs的細胞計數(shù)，其中1 μmol/L尼古丁效應(yīng)最強(P<0.01)，見圖1。因此，我們后續(xù)實驗中，尼古丁的濃度均為1 μmol/L。

Figure 1.Effects of nicotine on the proliferation of rat PASMCs were evaluated by cell counting. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 利用細胞計數(shù)法檢測大鼠肺動脈平滑肌細胞數(shù)量

2 尼古丁對大鼠PASMCs中caspase-3活性的影響及杜鵑素的作用

與對照組相比，尼古丁處理大鼠PASMCs 48 h后，細胞caspase-3活性顯著降低(P<0.01)，表明細胞凋亡被明顯抑制。10-6mol/L～10-4mol/L杜鵑素可以逐漸逆轉(zhuǎn)尼古丁所造成的caspase-3活性降低，10-4mol/L杜鵑素可以達到最為顯著的效果(P<0.01)，見圖 2。

Figure 2.The caspase-3 activity of rat PASMCs was detected. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsnicotine group.

圖2 大鼠肺動脈平滑肌細胞caspase-3活性檢測

3 尼古丁對大鼠PASMCs細胞活性的影響及杜鵑素的作用

與對照組相比，使用尼古丁孵育大鼠肺動脈血管平滑肌細胞48 h后，細胞活力顯著增加(P<0.01)，10-6mol/L～10-4mol/L杜鵑素可以逐漸地逆轉(zhuǎn)尼古丁所造成的細胞活力增加，10-4mol/L杜鵑素可以達到最大干預(yù)效果(P<0.01)，見圖 3。

4 尼古丁對大鼠PASMCs凋亡的影響及杜鵑素的作用

與對照組相比較，尼古丁降低了PASMCs凋亡率(P<0.01)。與尼古丁組相比，10-5mol/L杜鵑素干預(yù)顯著增加了PASMCs的凋亡率(P<0.01)，見圖4。

5 尼古丁對PASMCs凋亡相關(guān)基因(bax和bcl-2)mRNA和蛋白表達的影響及杜鵑素的作用

與對照組相比，尼古丁刺激PASMCs 24 h后，其細胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表達顯著增多,Bax的mRNA和蛋白表達顯著減弱。聯(lián)合使用10-5mol/L杜鵑素可以部分逆轉(zhuǎn)尼古丁的效果，差異具有顯著性(P<0.01)，見圖 5。

Figure 3.The activity of rat PASMCs was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsnicotine group.

圖3 CCK-8法檢測大鼠肺動脈平滑肌細胞活力

Figure 4.Flow cytometric analysis for Annexin V-FITC and PI staining in PASMCs treated with nicotine (1 μmol/L) or nicotine combines with farrerol (10-5mol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnicotine group.

圖4 流式細胞術(shù)檢測大鼠肺動脈血管平滑肌細胞凋亡

Figure 5.Effects of nicotine (1 μmol/L) and farrerol (10-5mol/L) on the expression of Bcl-2 and Bax mRNA (A and B) and protein (C and D) in rat PASMCs. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnicotine group.

圖5 檢測大鼠肺動脈血管平滑肌細胞Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表達

6 尼古丁對PASMCs的Kv1.5和Kv2.1 mRNA和蛋白表達的影響及杜鵑素的作用

使用1 μmol/L尼古丁干預(yù)24 h可顯著抑制PASMCs Kv1.5和Kv2.1的mRNA和蛋白表達(P<0.01)。而聯(lián)合使用10-5mol/L杜鵑素則可以部分逆轉(zhuǎn)尼古丁的效果(P<0.01)，見圖 6。

討 論

杜鵑素是從中藥滿山紅中提取得到的一種典型黃酮類化合物，已經(jīng)被廣泛用于支氣管哮喘的治療[14]。研究表明，杜鵑素擁有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗菌，抗炎和抑制細胞增殖[15]等。

Caspase-3屬于caspase家族的成員之一，是哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵酶[16]。Bcl-2家族包括一系列與凋亡相關(guān)的細胞因子，如Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-xl等，其中Bax和Bak可以促進細胞凋亡，而Bcl-2和Bcl-xl則可抑制細胞凋亡。本實驗通過檢測caspase-3活性及Bcl-2和Bax的變化，可以部分反映PASMCs的增殖與凋亡情況。我們觀察到, 1 μmol/L尼古丁能顯著降低PASMCs的caspase-3活性，增強細胞活性；尼古丁可以抑制大鼠PASMCs 的Bax并增強Bcl-2表達。這些結(jié)果提示，尼古丁能夠引起大鼠PASMCs發(fā)生異常增殖反應(yīng)。而后續(xù)的實驗證明杜鵑素可濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)尼古丁的作用。

Kv通道是動脈上表達比較豐富的鉀離子通道[17]，抑制PASMCs中的Kv通道可導(dǎo)致膜去極化，開放細胞膜上的電壓依賴性鈣通道，進而通過促進Ca2+內(nèi)流而誘導(dǎo)肺血管收縮。因此，Kv通道的抑制劑有助于通過增加[Ca2+]i刺激PASMCs增殖，還可以通過降低胞質(zhì)內(nèi)的caspase活性來抑制PASMCs凋亡。而如果Kv通道被激活，則能夠起到抑制PASMCs增殖，促進其凋亡的作用[18]。體外研究顯示，肺動脈高壓大鼠PASMCs上的Kv1.5表達顯著降低[3]，過表達Kv1.5可促進細胞凋亡，尼古丁可以抑制人類PASMCs的Kv1.5電流[19]。研究報道[3]，尼古丁刺激能夠抑制大鼠PASMCs中Kv1.5和Kv2.1的mRNA 表達。本實驗得出了與之相一致的結(jié)論，1 μmol/L尼古丁可顯著抑制大鼠PASMCs的Kv1.5和Kv2.1表達，而10-5mol/L杜鵑度可顯著逆轉(zhuǎn)尼古丁的抑制效果。這些結(jié)果可以說明，杜鵑素能夠通過增強PASMCs中Kv1.5和Kv2.1表達對尼古丁所致上述作用起到一定改善效果。

Figure 6.Effects of nicotine (1 μmol/L) and farrerol (10-5mol/L) on the expression of Kv1.5 and Kv2.1 mRNA (A and B) and protein (C and D) in rat PASMCs. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnicotine group.

圖6 檢測大鼠肺動脈血管平滑肌細胞Kv1.5和Kv2.1的mRNA和蛋白表達

綜上所述，杜鵑素能夠通過促進Kv1.5和Kv2.1表達對抗尼古丁所引起的大鼠PASMCs增殖反應(yīng)，這為臨床使用杜鵑素作為預(yù)防和治療肺動脈平滑肌細胞增殖性疾病提供了參考資料。