白屈菜堿對活化后大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B的增殖、膠原合成及TGF-β1受體的影響Δ

李曉明，林鵬飛，董妙先，徐天嬌，于春磊，榮華，王曉麗#（.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江齊齊哈爾 6006；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 6006）

肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells）是一種位于肝臟的非實質(zhì)細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞的活化、增殖是肝纖維化發(fā)生過程中結(jié)締組織異常增生、肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）過度沉積的主要原因[1-2]。研究顯示，肝纖維化發(fā)生后，若能經(jīng)過積極的方法干預(yù)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化、增殖，肝纖維化的病理改變能發(fā)生可逆性恢復(fù)，從而避免肝纖維化進(jìn)一步惡化為肝硬化，甚至肝癌[3-4]。因此，尋找一種能有效控制肝星狀細(xì)胞活化、增殖的藥物，對降低肝硬化和肝癌發(fā)病率具有重要意義。中藥白屈菜為罌粟科白屈菜屬多年生草本植物白屈菜（Chelidonium majusL.）的全草，花盛期割取地上部分，曬干或鮮用。其味苦，性涼，有毒，主要活性成分為白屈菜堿（Chelidonine）、原阿片堿、白屈菜紅堿等生物堿，具有抗菌、鎮(zhèn)痛、興奮平滑肌作用，白屈菜治療各種腫瘤在民間也廣為流傳，對多種腫瘤具有一定的抑制效果[5]。但關(guān)于白屈菜堿抑制肝纖維化的研究未見報道。筆者前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白屈菜中活性成分白屈菜紅堿可抑制肝纖維化小鼠的病理學(xué)改變[6]，而白屈菜堿也是白屈菜中活性成分之一，因此，本文以轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）活化大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B為肝纖維化模型，觀察白屈菜堿對TGF-β1活化后CFSC-8B的增殖和膠原合成的影響。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計、CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Countess C10227型細(xì)胞計數(shù)器（美國Invitrogen公司）；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；ELX800型全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；5417R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Stratagene Mx3005P型實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Agilent公司）；HL-2000型分子雜交箱（美國UVP公司）；JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽和JY-CZ1型單垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；SmartChemiⅡ型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；XPE504型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

白屈菜堿對照品（上海鼓臣生物技術(shù)有限公司，批號：18041303，純度：≥98%）；秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：H53021369，規(guī)格：0.5 mg）；TRIzol試劑（美國Ambion公司）；實時熒光定量PCR試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；TGF-β1（批號：SF7926，純度：98%）、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；兔抗鼠TGF-β1受體（TβR）-Ⅰ多克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號：3）；兔抗鼠TβR-Ⅱ多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：F1915）；兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國Sigma公司，批號：106M4851V）；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：00051405）；ECL超敏發(fā)光檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ引物（上海生工生物工程有限公司合成）；羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）試劑盒、CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）和Ⅲ型膠原蛋白（Col-Ⅲ）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 CFSC-8B細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B，于37℃含5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗，以5×105mL－1接種于96孔板中，每孔加入100 μL。試驗分為正常對照組、模型組、溶劑組（乙醇）、陽性對照組（1 μg/mL秋水仙堿乙醇溶液）和白屈菜堿低、中、高濃度組（2.1、4.2、8.4 μg/mL白屈菜堿乙醇溶液），每組3個復(fù)孔，各組加入藥物濃度依據(jù)前期試驗研究結(jié)果設(shè)定。模型組細(xì)胞中加入20 μg/L的TGF-β1作用 24 h 進(jìn)行活化，促使肝纖維化[7]，白屈菜堿低、中、高濃度組分別加入20 μg/L的TGF-β1和相應(yīng)質(zhì)量濃度的白屈菜堿乙醇溶液共同作用24 h，溶劑組加入20 μg/L的TGF-β1和乙醇溶液共同作用24 h，陽性對照組加入20 μg/L的TGF-β1和1 μg/mL秋水仙堿乙醇溶液共同作用24 h，正常對照組不加藥物及TGF-β1。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

藥物處理24 h后，按照CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒說明書中方法，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h，置于酶標(biāo)儀中，設(shè)定檢測波長為450 nm，測定吸光度，計算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）＝（正常對照孔的吸光度－加藥孔的吸光度）/（正常對照孔的吸光度－空白孔的吸光度）×100%，式中空白孔只含有培養(yǎng)基和CCK-8，不含細(xì)胞和藥物。

2.3 酶消化法檢測細(xì)胞上清液中Hyp含量

藥物處理24 h后，吸取細(xì)胞上清液，按照Hyp試劑盒說明書中方法進(jìn)行消化操作后，置于酶標(biāo)儀中，設(shè)定檢測波長為550 nm，測定吸光度，計算上清液中Hyp含量。

2.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平

藥物處理24 h，按照Col-Ⅰ和Col-ⅢELISA試劑盒說明書中方法處理上清液，置于酶標(biāo)儀中，設(shè)定檢測波長為450 nm，測定吸光度，計算上清液中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平。

2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白的表達(dá)

藥物處理24 h后，參照文獻(xiàn)處理方法[8]，收集細(xì)胞，加入裂解液，按照試劑盒說明書操作提取CFSC-8B細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），進(jìn)行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。加入兔抗鼠TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和GAPGH多克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日TBST緩沖液洗膜3次，再加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）37℃孵育2 h。利用ECL超敏發(fā)光檢測試劑盒檢測，一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀掃描，分析各蛋白質(zhì)印跡條帶的光密度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（GAPDH）光密度的比值計算目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，再與正常對照組的比值計算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 實時熒光定量-PCR法檢測細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ和TβR-ⅡmRNA的表達(dá)

藥物處理24 h后，收集細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書中方法提取細(xì)胞總RNA，各取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。再以cDNA為模板，依照實時熒光定量-PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔct法計算細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ mRNA相對表達(dá)量。引物序列及片斷長度見表1。

表1 引物序列及片斷長度Tab 1 Primer sequence and fragment length

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異顯著性比較，采用SNK檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白屈菜堿對CFSC-8B細(xì)胞增殖的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），并且白屈菜堿高濃度組細(xì)胞增殖率降低程度較中濃度組更顯著（P＜0.05）；白屈菜堿低濃度組細(xì)胞增殖率無明顯變化（P＞0.05）。因白屈菜堿低濃度組細(xì)胞增殖率無明顯變化，故僅選用白屈菜堿中、高濃度組進(jìn)行后續(xù)試驗。各組細(xì)胞增殖率測定結(jié)果見圖1。

圖1 各組細(xì)胞增殖率測定結(jié)果（±s，n＝10）Fig 1 Results of cell proliferation rate in each group（±s，n＝10）

3.2 白屈菜堿對CFSC-8B細(xì)胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細(xì)胞上清液中Col-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.05），白屈菜堿高濃度組和陽性對照組細(xì)胞上清液中Hyp、Col-Ⅲ水平顯著降低（P＜0.05）。與白屈菜堿中濃度組比較，白屈菜堿高濃度組細(xì)胞上清液中Col-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.05），Hyp、Col-Ⅲ水平有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平測定結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平測定結(jié)果（x±s，n＝6）Tab 2 Results of levels determination of Hyp，Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell supernatant of each group（±s，n＝6）

表2 各組細(xì)胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平測定結(jié)果（x±s，n＝6）Tab 2 Results of levels determination of Hyp，Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell supernatant of each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與白屈菜堿中濃度組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.chelidonine medium concentration group，ΔP＜0.05

Col-Ⅲ，μg/L 23.51±1.62 40.43±2.66＊40.27±2.17 37.57±2.57 34.14±1.97#28.71±1.81#組別正常對照組模型組溶劑組白屈菜堿中濃度組白屈菜堿高濃度組陽性對照組Hyp，mg/L 1.85±0.10 2.94±0.20＊2.94±0.18 2.67±0.18 2.42±0.14#2.23±0.19#Col-Ⅰ，μg/L 13.83±0.85 24.91±1.45＊25.08±1.86 21.43±1.35#18.62±1.39#Δ 16.29±1.20#

3.3 白屈菜堿對CFSC-8B細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與白屈菜堿中濃度組比較，白屈菜堿高濃度組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。各組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見圖3。

圖2 各組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electropherogram of protein expression of TβR-Ⅰand TβR-Ⅱ in cells of each group

圖3 各組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達(dá)測定結(jié)果（n＝3）Fig 3 Results of protein expression of TβR-Ⅰ andTβR-Ⅱ in cells of each group（n＝3）

3.4 白屈菜堿對CFSC-8B細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與白屈菜堿中濃度組比較，白屈菜堿高濃度組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；α-SMA mRNA表達(dá)有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA相對表達(dá)量測定結(jié)果見表3。

表3 各組細(xì)胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ mRNA相對表達(dá)量測定結(jié)果（x±s，n＝3）Tab 3 Results of mRNA expressions of α-SMA，TβR-Ⅰand TβR-Ⅱ in cells of each group（x±s，n＝3）

4 討論

活化的肝星狀細(xì)胞是引發(fā)肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在肝纖維化病變過程中扮演重要角色[9]。當(dāng)肝臟受到損傷、炎癥等各種致病因素的作用時，處于靜止期的肝星狀細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)化成為肌成纖維樣細(xì)胞。肌成纖維樣細(xì)胞分泌多種促炎因子和促纖維化因子，細(xì)胞中α-SMA合成增加并產(chǎn)生大量以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ為主的ECM成分，并在肝臟內(nèi)過度沉積，形成肝纖維化[10]?？梢?，觀察Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量變化，是評價肝星狀細(xì)胞活化、增殖以及膠原蛋白合成的重要依據(jù)。Hyp是膠原組織代謝的重要產(chǎn)物，且為膠原中特有的氨基酸，觀察Hyp含量變化，對于判斷肝星狀細(xì)胞的增殖、ECM的沉積、肝纖維化的程度具有重要意義[11]。因此本研究檢測了外源性TGF-β1活化的肝星狀細(xì)胞的增殖、Hyp含量和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平，結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞，通過白屈菜堿干預(yù)后，當(dāng)白屈菜堿質(zhì)量濃度為4.2、8.4 μg/mL時，與模型組比較，細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），而白屈菜堿質(zhì)量濃度為2.1 μg/mL時細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），因此在后續(xù)試驗中只保留白屈菜堿的4.2、8.4 μg/mL（中、高）濃度組。模型組細(xì)胞中Hyp含量、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平較正常對照組顯著升高，說明本研究中肝星狀細(xì)胞活化成功。而與模型組比較，白屈菜堿中濃度組細(xì)胞中Col-Ⅰ含量顯著降低（P＜0.05），Col-Ⅲ及Hyp含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；白屈菜堿高濃度組細(xì)胞中Hyp含量、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平均顯著降低，說明白屈菜堿能夠抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原合成。

TGF-β1是公認(rèn)的重要的致纖維化因子，在肝纖維化的形成、發(fā)展中起著重要的作用[12]。其通過促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化、增殖，產(chǎn)生前膠原mRNA，使肝星狀細(xì)胞失去脂質(zhì)液滴，逐漸向肌成纖維樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)膠原蛋白的合成與沉積，并最終導(dǎo)致肝纖維化[13]。De Bleser PJ等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在激活的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)量是靜止時的12倍，而外源性TGF-β1又可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，刺激肝星狀細(xì)胞持續(xù)合成ECM。TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ是具有絲蘇氨酸激酶活性的轉(zhuǎn)膜蛋白，由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)組成，在細(xì)胞膜表面具有高親和力，同屬TβR的亞型，在組織中分布最為廣泛[15]。TβR-Ⅰ的胞內(nèi)側(cè)富含高度保守的絲氨酸-甘氨酸序列（GS）區(qū)域，是 TβR-Ⅰ特有的，而TβR-Ⅱ的胞內(nèi)側(cè)含有絲氨酸-蘇氨酸激酶功能區(qū)，具有磷酸化功能[16]?；罨腡GF-β1首先結(jié)合TβR-Ⅱ，形成異聚體復(fù)合物，然后寡集并磷酸化TβR-Ⅰ，使絲氨酸-蘇氨酸殘基立體構(gòu)像改變，從而具有激酶活性，激活胞內(nèi)信號分子Smads蛋白，繼續(xù)TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。因此本研究用TGF-β1活化肝星狀細(xì)胞，觀察白屈菜堿對大鼠肝星狀細(xì)胞TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ表達(dá)的干預(yù)作用。本研究顯示，與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達(dá)和TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ的蛋白表達(dá)顯著升高；與模型組比較，白屈菜堿中、高濃度組細(xì)胞中TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達(dá)和TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ的蛋白表達(dá)顯著降低。

以上結(jié)果表明，白屈菜堿對TGF-β1活化的肝星狀細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用，進(jìn)而說明其具有逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用。白屈菜堿為白屈菜的主要活性成分之一，因此，白屈菜可能成為臨床治療肝纖維化的潛在中藥。通過本研究，旨在為白屈菜在臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時為中藥的現(xiàn)代化奠定基礎(chǔ)。對于白屈菜堿抗纖維化作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。