絞股藍(lán)中6 種多酚化合物的HPLC檢測及其醇提液的抗氧化活性

鄧俊琳，朱永清，夏 陳,*，陳 建，趙旭珠，張盈嬌，李華佳，鄧海云，李 娟

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041）

絞股藍(lán)屬（Gynostemma）為葫蘆科草質(zhì)藤本植物，共包括16 個種2 個變種，主要分布于亞洲熱帶，中國地區(qū)主要分布于秦嶺以南廣大地區(qū)[1]。絞股藍(lán)（G. pentaphyllum (Thumb.) Makino）是該屬分布最廣、資源最豐富的藥用植物，為該屬的模式物種，有5 葉、7 葉和9 葉等生態(tài)類型，以5 葉和7 葉最為常見[2-3]。研究認(rèn)為絞股藍(lán)含有與人參皂苷相似結(jié)構(gòu)的絞股藍(lán)皂苷，是除五加科外少數(shù)被證實含有人參皂苷類成分的植物，因此在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健品領(lǐng)域都有很大的市場發(fā)展空間[1]。我國對絞股藍(lán)的應(yīng)用由來已久，民間將其作為野菜食用，同時其又被當(dāng)作草藥治療咳嗽、痰喘、慢性支氣管炎等疾病，是一種經(jīng)典的藥食同源類植物[4]。研究表明絞股藍(lán)含有皂苷、黃酮類、多糖和氨基酸等多種化學(xué)成分，具有降血糖血脂[5-7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抗衰老和保護(hù)心血管[9]等作用。在四川絞股藍(lán)屬植物有3 種：心籽絞股藍(lán)（G. cardiospermum）、長梗絞股藍(lán)（G. longies）和絞股藍(lán)（G. pentaphyllum），前2 種分布于四川盆地周緣山地，后者則廣泛分布于四川盆地和川西南山地[10]。

多酚類化合物是植物中一類物質(zhì)的統(tǒng)稱，因具有多個酚羥基而得名，是植物的次生代謝產(chǎn)物，大多數(shù)由苯丙氨酸衍生而來，少部分由酪氨酸衍生而來。按結(jié)構(gòu)大致可分為類黃酮、木聚素、酚酸和木酚素[11]。多酚類化合物在種子萌發(fā)、植物生長和發(fā)育、細(xì)胞分裂、光合作用色素的合成、植物抗霜凍和防御病蟲害等過程中均起到重要作用[12-13]。同時對人類健康也具有保護(hù)作用，多酚具有預(yù)防心血管病發(fā)生、抑菌、抗病毒、提高免疫等多種功效[14-16]，且這些活性與多酚的抗氧化活性直接相關(guān)[17-18]。目前對絞股藍(lán)中活性成分的研究多集中在絞股藍(lán)皂苷、多糖等，但對絞股藍(lán)中多酚類化合物的研究較少。本實驗對四川西南山地野生絞股藍(lán)（生態(tài)類型：5 葉、7 葉、9 葉）和人工種植絞股藍(lán)（生態(tài)類型：7 葉）葉及莖中多酚單體化合物進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析檢測，以及對其醇提液的總多酚含量和抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為絞股藍(lán)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)：2016年4月采收于四川省樂山市峨邊彝族自治縣，野生絞股藍(lán)：生態(tài)類型分別為5 葉、7 葉和9 葉；人工種植絞股藍(lán)：生態(tài)類型為7 葉。野生絞股藍(lán)和人工種植絞股藍(lán)經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所專家李晚誼鑒定并確認(rèn)。樣品存檔于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所功能食品研究室。干葉和莖粉碎過60 目篩，貯藏備用。

原兒茶素、對羥基苯甲酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，純度≥98%），2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）、0.22 μm微孔濾膜 美國Mreda公司；甲酸、福林-酚試劑、AlCl3、沒食子酸、水溶性VE（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，純度＞97%） 東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司；TD-4Z型臺式低速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ELX-800型號酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；1260型HPLC儀（配有二極管陣列檢測器）、poroshell 120 PFP色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）美國Agilent公司；UV-6100型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試樣品溶液的制備

稱取絞股藍(lán)粉末0.2 g，加10 mL甲醇，于40 ℃超聲提取40 min，甲醇定容至10 mL容量瓶中。0.22 μm微孔濾膜過濾，作為樣品HPLC檢測的待測液，其余樣品用于總多酚含量和抗氧化活性（DPPH、ABTS）的測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

溶解原兒茶素、對羥基苯甲酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。采用梯度稀釋法用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

1.3.3 色譜條件

poroshell 120 PFP色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；檢測波長254 nm和350 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.8 mL/min；流動相：1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～10 min，5%～10% B；10～20 min，10%～20% B；20～35 min，20%～40% B；35～40 min，40%～70% B；40～45 min，70%～95% B。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢出限[19]

精密吸取含有6 種多酚單體的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512 倍，在1.3.3節(jié)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并將信噪比為10時相應(yīng)的質(zhì)量濃度定為定量線，以信噪比為3時的相應(yīng)質(zhì)量濃度確定為檢出限。

1.3.4.2 重復(fù)性實驗

按照1.3.1節(jié)的方法平行制備6 份7 葉絞股藍(lán)提取液，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣5 μL進(jìn)行測定，計算6 種多酚化合物提取量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.3 精密度實驗

按照1.3.2節(jié)方法制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算6 種多酚化合物峰面積的RSD。

1.3.4.4 穩(wěn)定性實驗

按照1.3.2節(jié)方法制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件對同一樣品分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣5 μL，計算6 種多酚化合物峰面積的RSD。

1.3.4.5 回收率實驗

稱取絞股藍(lán)樣品適量于具塞錐形瓶中，加入6 種標(biāo)準(zhǔn)品適量，按1.3.1節(jié)的方法制備7 葉絞股藍(lán)樣品，再按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣5 μL，并計算6 種化合物的加標(biāo)回收率。

1.3.5 總多酚含量測定[20]

以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.002 9X+0.026 3（R2=0.998 2，線性范圍17.55～351 μg/mL）。

取100 μL待測液，加3.0 mL蒸餾水搖勻，再加200 μL福林-酚試劑，混勻放置5 min，再加800 μL 10%碳酸鈉溶液，避光反應(yīng)60 min，于波長765 nm處測吸光度。總多酚含量以沒食子酸當(dāng)量計算，單位為mg/g。

1.3.6 DPPH自由基清除活性測定[21]

以水溶性VE質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y＝0.942 8X-0.420 2（R2＝0.997，線性范圍13～104 μg/mL）。

取200 μL待測液，加2 mL DPPH（0.1 mmol/L）溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測吸光度。DPPH自由基清除活性以VE當(dāng)量計算，單位為mg/g。

DPPH自由基清除率按下式計算：

式中：Ax為樣品的吸光度；A0為乙醇代替樣品時的吸光度。

1.3.7 ABTS陽離子自由基清除活性測定[22]

以水溶性VE的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=-0.024 6X+0.515 8（R2=0.998，線性范圍0～19.5 μg/mL）。

取400 μL待測液，加1.6 mL ABTS溶液，混勻，避光反應(yīng)6 min，于波長734 nm處測吸光度。ABTS陽離子自由基清除活性以VE當(dāng)量計算，單位為mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實驗的平均值，應(yīng)運Microsoft Excel 97-2003和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和絞股藍(lán)樣品的HPLC檢測

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)品和野生絞股藍(lán)（7 葉）樣品HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of phenolic standards and phenolics from leaves of wild seven-leaf G. pentaphyllum

從圖1A、B可以看出，在此色譜條件下，6 種多酚化合物的標(biāo)準(zhǔn)品得到較好分離，野生絞股藍(lán)（7 葉）的葉樣品溶液色譜圖（圖1C、D）中6 個目標(biāo)峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的6 個色譜峰保留時間一致。在此色譜條件下，絞股藍(lán)樣品中的6 種多酚化合物得到較好的分離。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢出限結(jié)果

表1 6 種多酚化合物的回歸方程、線性范圍、定量限和檢出限Table 1 Regression equations and linear ranges for the 6 phenolic compounds

如表1所示，各種化合物的峰面積和質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 重復(fù)性實驗結(jié)果

6 種多酚化合物提取量的RSD分別為2.23%、4.11%、1.95%、2.51%、4.60%、2.21%，表明實驗方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度實驗結(jié)果

6 種多酚化合物峰面積的RSD分別為2.68%、2.63%、0.89%、1.01%、1.57%、0.69%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

6 種多酚化合物峰面積的RSD分別為2.45%、1.80%、0.97%、0.60%、1.47%、0.56%，表明6 種多酚的日內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率實驗結(jié)果

表2 6 種多酚化合物在絞股藍(lán)樣品中的加標(biāo)回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of phenolic compounds from spiked sample (n= 5)

如表2所示，6 種化合物的加標(biāo)回收率在84%～99%之間，RSD均小于5%，表明實驗方法有較好的回收率，回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 多酚、總多酚含量和抗氧化活性測定

如表3所示，6 種多酚化合物中，蘆丁含量均顯著高于其他5 種多酚化合物，其次槲皮素含量較高，原兒茶酸和對羥基苯甲酸含量則相對較低。在不同絞股藍(lán)樣品中，野生絞股藍(lán)（5 葉）葉中的原兒茶酸、蘆丁、槲皮素、山柰酚含量顯著高于其他樣品。野生絞股藍(lán)（7 葉）葉中對羥基苯甲酸含量、總多酚含量、抗氧化活性高于其他品種，其中，總多酚含量高達(dá)75 mg/g，而野生絞股藍(lán)（7 葉）的莖中總多酚含量、抗氧化活性較其他樣品低。此外，總多酚含量在絞股藍(lán)中均呈現(xiàn)出葉中含量遠(yuǎn)高于莖中，且遠(yuǎn)高于Cai Yizhong等[23]報道的絞股藍(lán)中總多酚含量（4.4 mg/g）。

表3 絞股藍(lán)中6 種多酚、總多酚含量和抗氧化活性Table 3 Contents of 6 phenolic compounds and total phenols and antioxidant activity in G. pentaphyllummg/g

2.4 相關(guān)性分析

表4 相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis

如表4所示，絞股藍(lán)醇提液對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力均與總多酚含量呈極顯著正相關(guān)，且二者之間也呈極顯著正相關(guān)。對DPPH自由基的清除能力與6 種多酚化合物含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。對ABTS陽離子自由基的清除能力與蘆丁和異槲皮苷之間無顯著相關(guān)性，與槲皮素顯著正相關(guān)，與原兒茶酸和對羥基苯甲酸、山柰酚等均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。異槲皮苷含量與總多酚含量之間無顯著相關(guān)性，總多酚與其他5 種多酚均有顯著正相關(guān)性。6 種多酚化合物之間，槲皮素與異槲皮苷無顯著相關(guān)性，對羥基苯甲酸與蘆丁、異槲皮苷之間無顯著相關(guān)性，其余多酚化合物之間均呈現(xiàn)極顯著或顯著正相關(guān)性。

3 討 論

本研究建立了HPLC法檢測絞股藍(lán)中6 種多酚化合物的方法，經(jīng)驗證該方法重復(fù)性好（RSD≤4.6%）、精密度高（RSD≤2.68%）、穩(wěn)定性好（RSD≤2.45%）、加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠（RSD≤4.02%），可在35 min內(nèi)對6 種多酚化合物進(jìn)行有效分離，峰形對稱、分離度高。

植物多酚在植物的生長和發(fā)育過程中起到重要的作用，其不僅與種子萌發(fā)、細(xì)胞分裂、色素合成等密切相關(guān)，還能保護(hù)植物受傷部位、提高植物對微生物侵襲的抵抗能力[24]。本研究中人工種植絞股藍(lán)（7 葉）的葉中總多酚含量（11.78 mg/g）接近于?amec等[25]報道的生長于馬來西亞和德國的絞股藍(lán)中總多酚的含量（11.57 mg/g和10.42 mg/g），而野生絞股藍(lán)的葉中總多酚含量均較高（均高于30 mg/g），這可能與野生絞股藍(lán)在野外的生長環(huán)境有關(guān)。此外，6 種多酚化合物之間有顯著或極顯著正相關(guān)，且在同一供試樣品的葉中含量均高于莖中，在不同供試樣品中，蘆丁含量均為最高，原兒茶酸和對羥基苯甲酸含量則相對較低。研究表明影響植物中多酚化合物的組成及含量的因素很多，比如遺傳因子、氣候因子[26]、土壤因子[27]等，且在同一株植物體上，部位不同，多酚含量也會有所差異[28]。

植物多酚類化合物的抗氧化活性常被作為植物功效評價的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明，DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力與總多酚含量極顯著正相關(guān)，清除DPPH自由基活性與6 種多酚的含量極顯著正相關(guān)，但蘆丁和異槲皮苷的含量對絞股藍(lán)醇提物的清除ABTS陽離子自由基活性并無顯著影響。山柰酚、槲皮素、異槲皮苷和蘆丁屬于黃酮醇類化合物，研究表明山柰酚在黃烷酮3-羥化酶催化下形成槲皮素，槲皮素經(jīng)黃酮醇-3葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的催化作用形成異槲皮素，異槲皮素再經(jīng)1,6-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下形成蘆丁[29-30]，但在本實驗中異槲皮苷與槲皮素之間并未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。絞股藍(lán)中黃酮成分可能隨產(chǎn)地、氣候等差異有所不同，且其藥效受到顯著影響[31-32]。