高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定翹嘴紅鲌肌肉中磷脂的組成

韓迎雪，林婉玲，楊少玲，李來好,3,*，黃 卉，楊賢慶，王錦旭，吳燕燕，翟紅蕾，郝淑賢

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300）

翹嘴紅鲌（Ergthroculter ilishaeformis）是隸屬鯉形目、鯉科、鲌亞科、紅鲌屬的一種魚類，俗名翹嘴巴、大白魚等，是名貴的兇猛性淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。翹嘴紅鲌廣泛分布于中國各主要水系，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長迅速、營養(yǎng)價值高、肉質(zhì)潔白細(xì)嫩、味道鮮美等特點(diǎn)，被稱為魚中上品[2]，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛，目前市場價格比較高[3-4]。除此之外，還含有豐富的磷脂。磷脂是一類含有磷元素的脂類物質(zhì)，主要包括磷脂酰膽堿（phosphatidyl cholines，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、二磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerol，DPG）以及溶血磷脂酰乙醇胺（lysopnosphatidylethanolamine，LPE）等。磷脂是構(gòu)成生物膜的重要物質(zhì)，也是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)之一[5]，與細(xì)胞的識別、種特異性和組織免疫功能等有著密不可分的聯(lián)系[6-7]，同時磷脂還是食品的重要營養(yǎng)成分和風(fēng)味前體物質(zhì)[8-9]。研究表明，磷脂具有提高記憶、調(diào)節(jié)血脂、提高免疫力、抗衰老等功能[10-12]。目前有關(guān)翹嘴紅鲌的研究主要集中于該魚的生物學(xué)[13]、形態(tài)分布[14]、人工養(yǎng)殖[15]及其肌肉營養(yǎng)組分[16]等方面。何雄等[17]研究了腌制方式和濕腌溫度、時間對翹嘴紅鲌肉品質(zhì)的影響；周丹珺等[18]比較了乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、茶多酚這3 種添加劑對翹嘴紅鲌腌制品的保鮮效果；楊立[19]從水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸等方面比較了巢湖野生翹嘴紅鲌和養(yǎng)殖翹嘴紅鲌肌肉的營養(yǎng)成分并對其營養(yǎng)價值進(jìn)行評價。但有關(guān)翹嘴紅鲌肌肉中磷脂的研究鮮見報道，因此對翹嘴紅鲌磷脂成分的分析研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

因此，本實(shí)驗(yàn)以翹嘴紅鲌為研究對象，采用氯仿-甲醇法提取脂質(zhì)，純化后選擇高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection，HPLC-ELSD）方法，采用梯度洗脫程序測定磷脂組成，旨在為翹嘴紅鲌的深入研究和合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

翹嘴紅鲌（Ergthroculter ilishaeformis）（1.8 kg）8 條，6月在佛山市水產(chǎn)市場進(jìn)行采樣；正己烷、異丙醇（色譜純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；PE（純度＞98%）、LPE（純度＞99%）、PI（純度＞98%）、PS（純度＞98%）、SM（純度≥98%）、PC（純度＞98%）、LPC（純度＞98%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT） 美國Sigma公司；氯仿、甲醇、丙酮（均為分析純） 廣州市華嶼欣實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD HPLC儀、LTII ELSD檢測器 日本島津公司；YP1002N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS低速離心機(jī) 東莞布魯斯儀器有限公司；N-EVAP-24氮吹儀 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取翹嘴紅鲌背部肌肉，用流動水沖洗后絞碎，備用。

1.3.2 脂肪的提取

淡水魚肌肉脂肪根據(jù)Folch等[20]的方法略作修改后進(jìn)行提取。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的絞碎魚肉于50 mL具塞離心管中，加入15 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液（含0.01% BHT），在冰浴條件下用高速分散均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速勻漿2 次，每次15 s，2 次間隔30 s，然后用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液定容至30 mL，靜置1 h后過濾，直接將濾液盛放到已知質(zhì)量的具塞離心管中，加入20%濾液體積的0.85%生理鹽水，最后3 000 r/min離心15 min，棄去上層水與甲醇等液體雜質(zhì)，下層脂質(zhì)溶液用氮?dú)獯祾哂袡C(jī)試劑，冷卻至恒質(zhì)量后稱量，得到濃縮脂質(zhì)。

1.3.3 樣品制備

用氯仿-甲醇提取樣品中的脂類物質(zhì)，樣品中除含有磷脂外，還含有甘油三酯、游離脂肪酸、膽固醇等物質(zhì)，這些物質(zhì)會干擾磷脂的檢測，并且有些物質(zhì)會在硅膠柱上殘留積累，使色譜系統(tǒng)的柱壓升高，并降低柱效，故樣品分析前需進(jìn)行純化處理。根據(jù)磷脂不溶于丙酮的性質(zhì)[21]，將1.3.2節(jié)得到的濃縮脂質(zhì)倒入4 ℃的冷丙酮，不斷振蕩攪拌，待沉淀析出后3 000 r/min離心6 min，除去上清液，冷丙酮清洗沉淀，重復(fù)多次，直至上清液無色為止，用氮?dú)獯蹈芍频玫~肌肉磷脂，于-20 ℃冷凍保存，備用。

取適量淡水魚肌肉磷脂樣品，按照一定的質(zhì)量濃度溶解于甲醇中。HPLC進(jìn)樣前使用0.22 μm孔徑有機(jī)相濾膜過濾進(jìn)樣品瓶。

1.3.4 色譜條件

HPLC條件：Chromolith?Performan-ce-Si型正相硅膠色譜柱（100 mm×4.6 mm）；柱溫箱溫度30 ℃；流動相A為正己烷和三乙胺的混合溶液，流動相B為異丙醇，流動相C為13%乙酸溶液；流速為1.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。采用三元梯度洗脫，梯度洗脫程序如表1所示[22]。

表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution program

ELSD條件：以氮?dú)庾鳛殪F化氣，氣體壓強(qiáng)320 kPa，漂移管溫度70 ℃。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

PC、PE、PS、PI、SM、LPC和LPE標(biāo)準(zhǔn)品在配制溶液前應(yīng)放置在-20 ℃貯存。分別準(zhǔn)確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，PI和LPE用氯仿溶解，其他用甲醇溶解后于棕色容量瓶中定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液配好后使用前置于4 ℃條件下避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

將配制好的一定質(zhì)量濃度的PE、LPE、PI、PS、PC、SM、LPC標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別單獨(dú)進(jìn)樣，記錄每個標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間，以相對保留時間對樣品中檢測出的磷脂進(jìn)行定性。明確各峰歸屬后，將各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品按一定比例混合成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣混合物，質(zhì)量濃度從低到高多次進(jìn)樣，每樣重復(fù)進(jìn)樣2 次，以各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時確定各組分的最適檢測范圍。

1.4 數(shù)據(jù)處理

磷脂分析按其磷脂各標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間確定磷脂的種類，用面積歸一化法（以峰值面積的百分比表示）確定磷脂的相對含量[23]。翹嘴紅鲌樣品平行測定3 次，上述所有數(shù)據(jù)均用Excel統(tǒng)計，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

磷脂成分復(fù)雜，由一系列極性各不相同的磷脂組分組成，而每種磷脂組分有著不同的端基、分子骨架和脂肪酸鏈[24]，因此磷脂的定量分析難度較大。綜合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[22,25-26]，本實(shí)驗(yàn)選用德國默克的Chromolith?Performan-ce-Si型正相硅膠色譜柱（100 mm×4.6 mm）。

2.1.2 檢測器的選擇

紫外檢測器只對具有π鍵和孤對電子的物質(zhì)有響應(yīng)，且其響應(yīng)值隨物質(zhì)所含的官能團(tuán)以及官能團(tuán)的連接方式不同而有差異。磷脂類化合物的紫外吸收很弱，且為末端吸收，干擾較大。ELSD是一種通用型檢測器，對大多數(shù)物質(zhì)均有響應(yīng)，對磷脂的分子種類無特殊要求，因此適用于磷脂類化合物的檢測[27]。由于淡水魚磷脂的組分復(fù)雜，是一個極性范圍較寬的混合物，采用通常的等度洗脫體系很難將磷脂的各個組分完全分離，且分析時間較長[28]。磷脂類物質(zhì)本身不含發(fā)色基團(tuán)，而且也無較好的衍生化處理技術(shù)。為了提高分離效果，縮短分析時間，選擇ELSD檢測。

2.1.3 流動相的選擇

在磷脂化合物的分離和測定中，常見的流動相體系有甲醇[29]、乙腈-甲醇-85%磷酸[30]和正己烷-異丙醇-乙酸溶液[31-32]。最常用的是第3類流動相，這是由于該流動相體系具有良好的色譜分離效果，并且溶劑不易揮發(fā)，同時考慮到柱子壽命問題，最終選用正己烷-異丙醇-乙酸溶液體系作為流動相。

2.1.4 柱溫的選擇

在1.3.4節(jié)條件下，考察柱溫對磷脂分離效果的影響，結(jié)果見圖1。在25～40 ℃之間對7 種磷脂的分離影響較小。但在25 ℃和40 ℃時，PE的色譜圖峰形不好，30 ℃和35 ℃時PE的峰形較好?？紤]到溫度過高磷脂易發(fā)生變性，故選擇的柱溫為30 ℃。

圖1 不同柱溫下7 種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-ELSD圖譜Fig. 1 HPLC profiles of mixed standards of 7 phospholipids at different column temperatures

2.1.5 ELSD漂移管溫度的選擇

參考ELSD漂移管溫度的設(shè)置原則，考察相同色譜條件下ELSD漂移管溫度分別為50、60、70、80 ℃時對磷脂標(biāo)準(zhǔn)品分離結(jié)果的影響，結(jié)果見圖2。50 ℃時PE峰形不好，80 ℃條件下基線噪音比較大，綜合各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品峰形，最終選擇ELSD漂移管溫度為70 ℃。

圖2 不同漂移管溫度下7 種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-ELSD圖譜Fig. 2 HPLC profiles of mixed standards of 7 phospholipids at different drift tube temperatures

圖3 7 種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）和翹嘴紅鲌（B）的HPLC-ELSD圖譜Fig. 3 HPLC profiles of mixed standards of 7 phospholipids (A) and phospholipids from E. ilishaeformis (B)

在1.3.4節(jié)色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和翹嘴紅鲌樣品出峰時間均可以在15 min內(nèi)全部完成，結(jié)果見圖3，混合磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的所有磷脂組分均能達(dá)到基線分離呈現(xiàn)單峰，LPC呈現(xiàn)前肩峰，計算峰面積時按兩峰面積相加之和來算，這是由于隨磷脂分子結(jié)構(gòu)中酯基上烴基鏈長短和雙鍵位置的不同，每種磷脂又可分為許多分子種類，因而在某一色譜條件下，某一種磷脂組分的譜峰可能會出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)肩峰，甚至分出2 個或更多的峰[33]，但并不影響各磷脂的分離與定量分析，計算峰面積時按兩峰面積相加之和來算。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

實(shí)驗(yàn)中進(jìn)樣量為20 μL，在實(shí)驗(yàn)所選定的檢測范圍之內(nèi)，得到的各磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，結(jié)果均為線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。通過線性參數(shù)的確定，可以對試液制備的稀釋倍數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以便減少測定誤差。

表2 磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2值Table 2 Equations and R2 values of calibration curves for phospholipid standards

2.3 方法的精密度結(jié)果

對含有PC、PE、PS、PI、SM、LPC和LPE 7 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，同一質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣3 次，記錄每次的峰面積，計算出各磷脂組分對應(yīng)的峰面積的均值與變異系數(shù)，結(jié)果見表3。由此可知，各個磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積重復(fù)性很好，變異系數(shù)值均小于3.0%。

表3 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的重復(fù)性Table 3 Reproducibility of detector response to phospholipid standards

2.4 回收率結(jié)果

準(zhǔn)確稱取相同的淡水魚肌肉樣品4 份，每份2 g。其中3 份加入已知量的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，渦旋混勻，配成新樣品，另1 份不加，按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法處理，用1.3.4節(jié)色譜條件每份平行測定3 次。根據(jù)線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出各磷脂組分的加樣回收率，結(jié)果見表4。從表4可以看出，平均回收率為 88.38%～107.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.40%～4.95%，達(dá)到了檢測要求。

表4 磷脂的加標(biāo)回收率Table 4 Recovery of phospholipids from spiked samples

2.5 翹嘴紅鲌磷脂分析

在1.3.4節(jié)色譜條件下，利用HPLC-ELSD對翹嘴紅鲌肌肉的磷脂組成進(jìn)行測定，將測得的峰面積帶入線性回歸方程，計算各磷脂的相對含量，結(jié)果見表5。

表5 翹嘴紅鲌磷脂組成及相對含量Table 5 Composition and relative contents of phospholipids in E. ilishaeformis%

從表5可以看出，翹嘴紅鲌肌肉中共檢測出5 種磷脂，分別為PE、PI、PS、PC和SM，其中PE、PI和PC是翹嘴紅鲌肌肉磷脂的重要組成成分，相對含量順序?yàn)镻E＞PI＞PC。PE作為構(gòu)成生物膜的重要組成部分，具有維持生物體結(jié)構(gòu)和功能的作用，影響著一系列生物代謝活動，如調(diào)節(jié)血壓、視覺活動等[34]；PI在細(xì)胞的各種生理功能起著非常重要的作用[35]；PC具有預(yù)防和輔助治療動脈硬化、改善記憶力、延緩衰老等功能[36-37]。飲食中適當(dāng)增加翹嘴紅鲌淡水魚的攝入量，對人體健康有很大的益處。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)參考盧航等[22]的洗脫條件，通過優(yōu)化柱溫和ELSD參數(shù)，得到HPLC-ELSD測定翹嘴紅鲌肌肉磷脂的方法，該方法可以準(zhǔn)確檢測翹嘴紅鲌肌肉中各磷脂組成，樣品的分離度高，方法精密度高，變異系數(shù)均小于3.0%，平均回收率為88.38%～107.41%，RSD為0.40%～4.95%，達(dá)到了檢測要求。

方法所用試劑配制簡單，樣品中磷脂的提取過程操作簡便，且損失很少，所以利用本方法檢測淡水魚中的磷脂操作更為簡單，結(jié)果更為準(zhǔn)確，可以滿足日常磷脂的檢測要求。

雖然該方法是針對翹嘴紅鲌肌肉磷脂檢測建立的，但由于磷脂是較復(fù)雜的體系，且一般認(rèn)為魚類磷脂組分很相近，因此該方法也適用于其他淡水魚磷脂成分的檢測。