傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的微生物群落結(jié)構(gòu)和游離氨基酸組成及其相關(guān)性分析

張慧林，王永勝，李沖偉,*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室，黑龍江 哈爾濱 150080）

豆醬是以大豆為主要原料，利用微生物經(jīng)過自然發(fā)酵制成的半流動狀態(tài)的發(fā)酵食品[1]。不同發(fā)酵方法生產(chǎn)的豆醬產(chǎn)品質(zhì)量不同。Kim等[2]通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）研究了10 個豆醬樣品的微生物多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣本的群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。Zhu Linjiang等[3]通過研究蠶豆醬在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的微生物群落，揭示了微生物群落結(jié)構(gòu)對發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的影響。因此，分析不同地區(qū)傳統(tǒng)豆醬的微生物多樣性對于了解產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。Namgung等[4]通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸可能與口感、風(fēng)味、營養(yǎng)和生理活性有關(guān)。康旭等[5]對豆醬中氨基酸與揮發(fā)性物質(zhì)的關(guān)系分析表明，氨基酸種類與豆醬風(fēng)味物質(zhì)有一定的相關(guān)性，酸性氨基酸會增加豆醬的鮮味，中性氨基酸可能產(chǎn)生丁香味的風(fēng)味物質(zhì)，堿性氨基酸對風(fēng)味影響較小。可見，氨基酸對豆醬產(chǎn)品質(zhì)量起著重要作用?；谝陨衔⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)與游離氨基酸對豆醬質(zhì)量的影響，本實(shí)驗采用高通量測序技術(shù)和氨基酸分析技術(shù)研究不同地區(qū)豆醬產(chǎn)品的質(zhì)量，采用偏最小二乘回歸（partial least-squares regression，PLSR）模型分析豆醬微生物多樣性和游離氨基酸組成的相關(guān)性，尋找?guī)追N不同豆醬產(chǎn)品質(zhì)量差異的原因，并為將來企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。本實(shí)驗具體分析得到豆醬中游離氨基酸的組成以及豆醬中微生物結(jié)構(gòu)組成的關(guān)系，并明確東北地區(qū)質(zhì)量較好的豆醬產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵豆醬樣品，從黑龍江省黑河、黑龍江省寶泉嶺、黑龍江省樺南和吉林省長春4 個地區(qū)采集新鮮的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品（分別為HeiH、BaoQL、HuaN、ChangC）。采集的樣品經(jīng)無菌容器密封后低溫保藏運(yùn)輸，在實(shí)驗室-80 ℃保存。

DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增的全套試劑及擴(kuò)增引物生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GeneAmp PCR System 9700 鄭州杜甫儀器廠；Power Pac Universal水平電泳儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Gel DOCXR凝膠成像系統(tǒng)、日立L8800氨基酸自動分析儀 上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法評價豆醬樣品的質(zhì)量

QDA是一種以描述性分析為主的對樣品進(jìn)行感官評定的方法，利用多元統(tǒng)計方法分析獲得數(shù)據(jù)，對樣品進(jìn)行定性和定量相結(jié)合的分析。具體分析過程為：首先挑選評定員組成定量描述分析小組，提出并挑選能反映樣品感官特性的描述詞匯，然后采用線性標(biāo)度對其進(jìn)行評價打分，打分結(jié)束后進(jìn)行統(tǒng)計分析，用雷達(dá)圖直觀表示對測定樣品的質(zhì)量評價[6]。本研究挑選10 名評定員，從色澤、香氣、滋味和體態(tài)4 個方面對不同地區(qū)的發(fā)酵豆醬樣品進(jìn)行質(zhì)量評價，評價結(jié)果采用QDA圖表示[7-9]。

1.3.2 發(fā)酵豆醬中微生物多樣性的測定

提取每個樣品總DNA，檢驗合格后，利用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對細(xì)菌的16S rDNA的V3-V4區(qū)域擴(kuò)增。利用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對真菌ITS的ITS1區(qū)域擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增及測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3.3 發(fā)酵豆醬中氨基酸的種類及含量測定

稱取1 g豆醬樣品，加10 mL 6 mol/L鹽酸溶液于水解管中，混勻，充氮并迅速封口，110 ℃水解22～24 h，冷卻后過濾，濾液真空濃縮至干，重復(fù)1～2 次。加入5 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液，濾膜過濾后利用氨基酸自動分析儀測定[10-11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件，對樣品中氨基酸進(jìn)行主成分分析和綜合性評價[12]。用Simca14.1軟件以PLSR建立模型，分析微生物菌群結(jié)構(gòu)與游離氨基酸之間的相關(guān)性[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆醬產(chǎn)品質(zhì)量評價

表1 豆醬感官特性評分與微生物OTU數(shù)Table 1 Sensory evaluation and microbial OTU number of fermented soybean paste

圖1 4 種發(fā)酵豆醬的QDA圖Fig. 1 QDA diagram of 4 fermented soybean pastes

由表1和圖1可知，4 種豆醬在4 個感官特性強(qiáng)度上差異較大，尤其樣品BaoQL在4 個感官特性強(qiáng)度上都較強(qiáng)，而樣品HeiH在香氣、滋味、體態(tài)感官特性強(qiáng)度上都較弱。BaoQL綜合評分最高，HeiH綜合評分最低。

2.2 樣品序列OTU分析

采用FLASH、Trimmomatic軟件處理原始數(shù)據(jù)[14]，將獲得的所有序列進(jìn)行OTU分類。由表1可知，4 份樣品的細(xì)菌OTU總數(shù)為238，平均數(shù)為60，最大值為70，最小值為47。4 份樣品的真菌OTU總數(shù)為254，平均數(shù)為64，最大值為70，最小值為53，由此可以看出，4 份樣品中真菌的OTU數(shù)比細(xì)菌的OTU數(shù)大，真菌的物種豐富度較大。

圖2 細(xì)菌（a）和真菌（b）的Rank-Abundance曲線圖Fig. 2 Rank-Abundance curves of bacteria (a) and fungi (b)

在Rank-Abundance曲線中，OTU等級代表系統(tǒng)群落物種的豐度，OTU等級越高，表示系統(tǒng)里物種越豐富。OTU曲線越平滑，表示系統(tǒng)里物種越均勻[15]。由圖2a可知，BaoQL的細(xì)菌物種豐度最高，物種數(shù)量分布也最均勻，ChangC的次之；由圖2b可知，HeiH的真菌物種豐度最高，BaoQL次之；真菌物種數(shù)量分布上，BaoQL更加均勻，這可能與兩個地區(qū)的緯度差異和氣候不同有關(guān)。

2.3 Alpha多樣性分析

表2 豆醬Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity index of bacteria and fungi in fermented soybean pastes

OTU分析后，分別計算各Alpha多樣性指數(shù)[16]。由表2可知，4 份豆醬樣品細(xì)菌的Chao l指數(shù)平均值為75.19，ACE指數(shù)平均值為75.00，Shannon指數(shù)平均值為1.58。4 份豆醬樣品真菌的Chao l指數(shù)平均值為26，ACE指數(shù)平均值為30.60，Shannon指數(shù)平均值為0.83。從Chao l和ACE指數(shù)可以看出，豆醬樣品的細(xì)菌菌群豐度高于真菌菌群豐度。從Shannon指數(shù)可以看出，豆醬樣品的細(xì)菌物種均勻度高于真菌物種均勻度。因此，傳統(tǒng)豆醬中細(xì)菌菌群多樣性更加豐富[17]。

2.4 豆醬樣品菌群結(jié)構(gòu)組成分析

圖3 屬水平上豆醬細(xì)菌豐度分析Fig. 3 Relative abundance of bacteria from fermented soybean paste samples at the genus level

4 份豆醬樣品中共檢測到21 種細(xì)菌，如圖3所示，包括四聯(lián)球菌（Tetragenococcus）、乳桿菌（Lactobacillus）、腸球菌（Enterococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、明串珠菌（Leuconostoc）、假單胞菌（Pseudogracilibacillus）等。4 份豆醬樣品的細(xì)菌組成差異較大，樣品HuaN和HeiH的優(yōu)勢細(xì)菌為Tetragenococcus（54.71%～84.52%）；樣品ChangC的優(yōu)勢細(xì)菌為Lactobacillus（83.86%）；樣品BaoQL的優(yōu)勢細(xì)菌為Weissella（32.88%）。

圖4 屬水平上醬醅真菌豐度分析Fig. 4 Relative abundance of fungi from soybean paste samples at the genus level

4 份豆醬樣品共檢測到11 種真菌，如圖4所示，包括青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Aspergillus）、unclassified-k-Fungi、假絲酵母（Candida）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）、魯氏酵母菌（Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（Millerozyma）等。4 份豆醬樣品的真菌組成差異也較大，樣品HuaN和HeiH的優(yōu)勢真菌為Penicillium（78.28%～89.90%）；樣品ChangC的優(yōu)勢真菌為unclassified-k-Fungi（67.37%）；樣品BaoQL的優(yōu)勢真菌為Aspergillus（94.01%）。

2.5 豆醬樣品中游離氨基酸組成分析

2.5.1 豆醬樣品中游離氨基酸的測定

由表3可知，4 種豆醬都含有17 種游離氨基酸，包括甜味氨基酸、苦味氨基酸和無味氨基酸，其中游離氨基酸總量最多的為BaoQL（（9.482±0.044）mg/g），最少的為HeiH（（3.685±0.031）mg/g）。檢測出人體必需氨基酸7 種，BaoQL中7 種氨基酸含量均高于其他樣品。

表3 豆醬樣品中各游離氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents in fermented soybean paste samples mg/g

2.5.2 豆醬樣品主成分分析與豆醬質(zhì)量評價

表4 豆醬各游離氨基酸的主成分特征值及其累計變異百分比Table 4 Characteristic values and cumulative percentage variations of principal components

將各樣品游離氨基酸值輸入計算機(jī)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行主成分分析[18]，結(jié)果如表4所示，2 個主成分的特征值均大于1，且累計貢獻(xiàn)率達(dá)到97.823%，說明前2 個主成分基本包含了全部游離氨基酸具有的信息[19]，因此可以將原來的17 種氨基酸轉(zhuǎn)化為2 個主成分。從圖5可知，第1主成分與其中16 種氨基酸含量呈正相關(guān)，與半胱氨酸呈負(fù)相關(guān)。第2主成分與半胱氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸含量呈正相關(guān)，與酪氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸含量呈負(fù)相關(guān)。

圖5 因子載荷圖Fig. 5 PCA factor loading plot

表5 豆醬的游離氨基酸綜合評價指數(shù)Table 5 Comprehensive evaluation index of fermented soybean paste samples

利用綜合評價指標(biāo)F1、F2替代原有的17 個氨基酸指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，以每個主成分所對應(yīng)的特征值的方差貢獻(xiàn)率建立綜合評價模型[20]，即F=0.849 0F1+0.129 3F2，其中F為綜合得分，如表5所示，BaoQL的游離氨基酸綜合評分最高，ChangC次之，HeiH綜合評分最低。

2.6 豆醬樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)與游離氨基酸相關(guān)性分析

利用PLSR模型對豆醬樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)與游離氨基酸之間的相關(guān)性進(jìn)行分析[21]，數(shù)據(jù)所建PLSR模型對X與Y相關(guān)性的解釋能力R2cum為0.807，且該模型對新數(shù)據(jù)集的預(yù)測能力Qc2um為0.539，這說明該模型滿足分析的需要。

圖6 與游離氨基酸相關(guān)的重要微生物分析Fig. 6 Analysis of important microbes related to free amino acids

通過VIPpred表示微生物組成與游離氨基酸的相關(guān)性。從圖6可知，豆醬中33 個微生物的VIPpred在0.42～1.40之間，與游離氨基酸相關(guān)性最大的細(xì)菌為Weissella，VIPpred值為1.40；與游離氨基酸相關(guān)性最大的真菌為Millerozyma和Aspergillus， VIPpred值均為1.40。Weissella、Millerozyma和Aspergillus對豆醬的氨基酸組成和含量影響最大；細(xì)菌的VIPpred值大于真菌，說明細(xì)菌群落對游離氨基酸的組成和含量起主導(dǎo)作用。BaoQL豆醬的微生物群落結(jié)構(gòu)中，優(yōu)勢細(xì)菌為Weissella，優(yōu)勢真菌為Aspergillus，而這兩類菌對氨基酸的生成均起著重要作用，這也解釋了BaoQL豆醬產(chǎn)品質(zhì)量好的關(guān)鍵原因。

3 結(jié) 論

QDA可知，4 種發(fā)酵豆醬中，黑龍江省寶泉嶺的豆醬產(chǎn)品質(zhì)量最優(yōu)。黑龍江省寶泉嶺豆醬中游離氨基酸種類和總質(zhì)量濃度最高，因此，游離氨基酸種類和總質(zhì)量濃度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響至關(guān)重要。這與武俊瑞等[22]在豆醬中氨基酸的種類和數(shù)量決定豆醬品質(zhì)中的結(jié)論和Lin Hongbin等[23]得出氨基酸有望用于評價和代表郫縣蠶豆醬的風(fēng)味品質(zhì)的結(jié)論一致。

豆醬中游離氨基酸的組成和含量與發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，細(xì)菌中Weissella對游離氨基酸的種類和含量影響最大，真菌中Millerozyma和Aspergillus對游離氨基酸的種類和含量影響最大；細(xì)菌菌群對游離氨基酸種類和含量的影響顯著高于真菌菌群。黑龍江省寶泉嶺豆醬樣品的質(zhì)量明顯好于其他3 個樣品，主要因為黑龍江省寶泉嶺豆醬中含有上述幾種優(yōu)勢菌群，導(dǎo)致氨基酸種類和含量均高于其他樣品，這與Kim等[24]研究的韓國發(fā)酵大豆醬微生物群落與豆醬的感官屬性密切相關(guān)和Li Zhihua等[25]研究的中國傳統(tǒng)紅辣椒豆瓣醬中細(xì)菌群落和揮發(fā)性化合物之間高度協(xié)變關(guān)系的結(jié)論一致。

微生物發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量與其微生物多樣性的關(guān)系，近年來已經(jīng)引起國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注。Lee等[26]通過對豆醬的微生物多樣性與代謝組學(xué)進(jìn)行相關(guān)性分析表明，魯氏接合酵母和四聯(lián)球菌屬與氨基酸代謝、曲霉屬與糖代謝、芽孢桿菌屬與脂肪酸代謝都有顯著相關(guān)。Li Zhihua等[27]分別通過對豆醬中的細(xì)菌多樣性和代謝產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)性分析，得到假單胞菌與含氮代謝物顯著相關(guān)，鏈球菌屬與含碳代謝物等顯著相關(guān)。因此，還需要進(jìn)一步分析豆醬中微生物多樣性與其他代謝產(chǎn)物之間的相互關(guān)系，為發(fā)酵豆醬產(chǎn)品質(zhì)量提供更全面的理論依據(jù)。