綠色木霉耐高溫葡萄糖氧化酶的特性分析

高兆建，王先鳳，尚業(yè)成，許 祥，李寶林，張抗震，焦 魏

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇智薈生物科技有限公司，江蘇 徐州 221018；3.江蘇太合食品有限公司，江蘇 徐州 221018；4.邳州市金大地肥料有限公司，江蘇 徐州 221100）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，全稱為β-D-吡喃型葡萄糖需氧脫氫酶，它可以在有氧條件下專一性地催化β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸-1,5-δ-內(nèi)酯和伴隨的分子氧還原為過(guò)氧化氫，在水相體系中D-葡萄糖酸-1,5-δ-內(nèi)酯自動(dòng)水解為葡萄糖酸[1-2]。GOD對(duì)多種糖有氧化性，但葡萄糖、2-脫氧-D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖共同存在時(shí)，GOD對(duì)葡萄糖有非常高的催化特異性，而對(duì)其他糖氧化能力極其微弱[3]。

基于以上特性，GOD應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，在食品、輕工業(yè)、醫(yī)藥及生物等領(lǐng)域都有應(yīng)用[4]。在食品行業(yè)中，GOD可以除去飲料、紅酒、蛋粉中殘留的葡萄糖及氧氣，從而防止食品發(fā)生褐變，延長(zhǎng)保質(zhì)期[5]。而目前應(yīng)用最多的則是用作生物傳感器，用于在線監(jiān)控發(fā)酵液中殘余葡萄糖含量，或在醫(yī)藥行業(yè)中GOD制成方便快捷使用的檢測(cè)試紙如尿糖試紙、血糖試紙[6]。目前所報(bào)道的GOD多來(lái)源于曲霉屬中的黑曲霉和青霉屬[7-10]。不同來(lái)源的GOD酶學(xué)性質(zhì)有所不同[11-12]。Simpson等[13]報(bào)道了從青霉菌CBS 120262中分離的GOD，酶蛋白由分子質(zhì)量均為70 kDa的兩個(gè)相同亞基構(gòu)成，酶最適作用溫度在25～30 ℃，最適作用pH 6～8。蘇茉等[14]從黑曲霉發(fā)酵液中分離純化了GOD，該酶最適溫度為37 ℃，最適pH 5.7，在30～40 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，酶Km值為30.69 mmol/L，Vmax為21.88 μmol/L。石淑鈺等[15]從海洋低溫菌假單胞桿菌（Pseudomonas migulae）中分離的GOD最適反應(yīng)溫度為20 ℃，超過(guò)40 ℃酶活力迅速下降。Blazic等[16]在酵母中成功表達(dá)了源于黑曲霉的GOD，并通過(guò)離子交換層析和超濾純化了酶蛋白，蛋白分子質(zhì)量在100～140 kDa之間，Km值為33.4，最適作用pH 5.0。Khan等[17]從海洋真菌葡萄青霉（Penicillium viticola）中克隆了一個(gè)開(kāi)放閱讀框?yàn)? 806 個(gè)堿基的GOD基因，其編碼GOD分子質(zhì)量為65.5 kDa，等電點(diǎn)5.01。報(bào)道的GOD最適作用溫度主要在20～40 ℃，酶在較高溫度下很快失活。而從工業(yè)應(yīng)用角度考慮，若酶在高溫下仍具有高活性高穩(wěn)定性，則酶更受歡迎[18]。

從發(fā)酵液中分離純化酶蛋白，因發(fā)酵液色素、雜蛋白等雜質(zhì)的存在分離過(guò)程更為困難[19]，造成高純度的酶產(chǎn)品成本較高，因此高活力高純度的GOD主要依賴進(jìn)口。也因成本因素，限制了其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用[20]。另外近年來(lái)隨著工業(yè)制造的轉(zhuǎn)型發(fā)展，對(duì)高活力、高穩(wěn)定性、高純度的GOD需求越來(lái)越大。因此尋找這種酶的新生產(chǎn)資源、酶高效分離純化方法、在苛刻環(huán)境保持高穩(wěn)定性是目前滿足市場(chǎng)需要的重要研究課題方向?，F(xiàn)已報(bào)道的GOD來(lái)源非常有限，酶的耐受惡劣條件性能差，如不耐受高溫、pH值適用范圍窄等。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室篩選到的1 株高產(chǎn)GOD的綠色木霉（Trichoderma viride），從其發(fā)酵液中分離純化到高純度酶制劑（T. viride glucose oxidase，TvGOD），所產(chǎn)TvGOD耐高溫耐酸性及抗逆性顯著，有潛力在工業(yè)生產(chǎn)中使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用產(chǎn)GOD菌株為前期實(shí)驗(yàn)室篩選獲得，經(jīng)過(guò)生理生化及分子生物學(xué)鑒定確定為綠色木霉，菌種編號(hào)為WX24，本實(shí)驗(yàn)室保存。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow、Sephadex G-75 瑞典Amersham pharmacia公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker、牛血清白蛋白 美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基：20 g/100 mL馬鈴薯，2 g/100 mL葡萄糖，1.5 g/100 mL瓊脂，自然pH值，121 ℃滅菌20min；種子培養(yǎng)基：蔗糖2 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，葡萄糖0.2 g/100 mL，酵母粉0.2 g/100 mL，KH2PO40.05 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.01 g/100 mL，pH 6.0，121 ℃蒸汽滅菌15 min；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖5 g/100 mL，蛋白胨0.8 g/100 mL，酵母粉0.5 g/100 mL，葡萄糖0.5 g/100 mL，NaNO30.5 g/100 mL，KH2PO40.2 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.04 g/100 mL，F(xiàn)eSO40.001 g/100 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA Explorer 100型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；Hoefer 2-D電泳系統(tǒng) 美國(guó)Hoefer公司；3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 TvGOD的發(fā)酵制備

種子液培養(yǎng)在斜面培養(yǎng)基上接種綠色木霉WX24孢子，32 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3～4 d。搖瓶發(fā)酵采用250 mL錐形瓶，裝液量50 mL，121 ℃滅菌15 min后，按照15%的接種量接種種子液37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d即達(dá)產(chǎn)酶高峰。發(fā)酵液先用4 層紗布過(guò)濾，濾液冷凍離心（4 ℃、10 000 r/min離心15 min），所得的上清液即為粗酶液，于4 ℃保存。

1.3.2 酶的分離純化

在4 ℃條件下，發(fā)酵上清液中加入硫酸銨粉末，4 ℃靜置過(guò)夜，收集30%～85%飽和度的沉淀，用少量50 mmol/L、pH 6.0磷酸緩沖溶液（緩沖溶液A）溶解，置于透析袋中透析除鹽。透析后的粗酶液離心后上樣緩沖溶液A平衡好的DEAE-Sepharose（2.6 cm×30 cm）陰離子交換柱，上樣后緩沖溶液A洗柱至無(wú)蛋白洗脫下來(lái)。然后用含0～1.0 mol/L NaCl的緩沖溶液A進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫速率為1 mL/min，每管收集3 mL。測(cè)定收集管中溶液酶活力。有活性部分合并，超濾管超濾濃縮，濃縮后樣品硫酸銨濃度調(diào)節(jié)后，加到已用含1.0 mol/L硫酸銨的pH 7.0、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（緩沖溶液B）平衡好的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析柱（1.0 cm×20 cm），繼續(xù)用含1.0 mol/L硫酸銨緩沖溶液B洗柱至蛋白基線走平，然后改用含1.0～0 mol/L硫酸銨的緩沖溶液B逆梯度洗脫。檢測(cè)獲得的活性組分超濾濃縮后，上樣于緩沖溶液A平衡的Sephadex G-75（1.6 cm×90 cm）分子篩凝膠柱并洗脫，控制流速為0.5 mL/min。洗脫液經(jīng)紫外檢測(cè)并分部收集（3 mL/管），分別測(cè)定各收集管的酶活力，將有活性的部分合并，用于檢測(cè)酶純度及用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1.3.3 酶活力檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[21]的方法并加以改進(jìn)。以50 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖溶液配制鄰聯(lián)茴香胺、葡萄糖及過(guò)氧化物酶溶液。向離心管中分別加入適當(dāng)稀釋酶液100 μL、2.4 mL 0.21 mmol/L鄰聯(lián)茴香胺溶液、0.5 mL 10%葡萄糖溶液、100 μL 100 U/mL的過(guò)氧化物酶溶液，在60 ℃條件下，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，再置于沸水浴中快速滅活4 min，冷卻至室溫，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度；用預(yù)先滅活的酶液作空白對(duì)照，其他處理?xiàng)l件相同。酶活力單位（U）定義為：每分鐘催化葡萄糖氧化產(chǎn)生1 μmoL H2O2所需的酶量為1 個(gè)活力單位。

1.3.4 蛋白含量測(cè)定

蛋白含量測(cè)定采用Lowry法[22]，以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.3.5 表觀分子質(zhì)量測(cè)定

按Laemmli等[23]的方法，分離膠10%，濃縮膠5%。將樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白（兔磷酸化酶B（97 400 Da）、牛血清白蛋白（66 200 Da）、兔肌動(dòng)蛋白（43 000 Da）、牛碳酸酐酶（31 000 Da）、胰蛋白酶抑制劑（20 100 Da）、雞蛋清溶菌酶（14 400 Da））進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后以相對(duì)遷移率對(duì)分子質(zhì)量作圖，從圖中求出該蛋白酶的分子質(zhì)量。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

酶最適作用溫度測(cè)定：在20～70 ℃按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以酶活力最高者為100%。

酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液在20～70 ℃分別保溫2 h，迅速冷卻至室溫，測(cè)殘余酶相對(duì)活力，以未經(jīng)過(guò)熱保溫的酶液作為空白對(duì)照（100%）。

1.3.6.2 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

酶最適作用pH值測(cè)定：將酶液分別在pH 3.0～10.0的緩沖液體系中，在60 ℃測(cè)定酶活力，以酶活力最高者為100%。

酶pH值穩(wěn)定性測(cè)定：酶液在pH 3.0～10.0的緩沖液中，4 ℃存放48 h，測(cè)殘余酶活力，以測(cè)得的最高酶活力為100%。所用緩沖液為：pH 3.0～6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 6.0～7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH 8.0～8.5的Tris-HCl緩沖液，pH 9.0～10.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

1.3.6.3 金屬離子及抑制劑對(duì)酶活力的影響

取適當(dāng)酶液，向其中分別加入金屬鹽和抑制劑溶液，金屬離子終濃度為5 mmol/L，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（cetyltriethylammnonium bromide，CTAB）為0.1 g/100 mL，Tween-80和Trition X-100為1%，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA） 5 mmol/L，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）4 mmol/L。25 ℃保溫1 h后，測(cè)定殘余酶活力。以上均以不加任何試劑的酶液作為空白對(duì)照（100%）。

1.3.7 酶的動(dòng)力學(xué)分析

分別用濃度為10～80 mmol/L的葡萄糖為底物，在50 mmol/L、pH 6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中，60 ℃條件下與TvGOD反應(yīng)，測(cè)定酶活力，計(jì)算相應(yīng)的反應(yīng)速度，利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Michaelis-Menten常數(shù)Km值及Vmax。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以 ±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Microsoft Excel軟件繪制曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TvGOD的分離純化

圖1 DEAE-Sepharose離子交換層析Fig. 1 Elution profile of TvGOD by DEAE-Sepharose ion-exchange column chromatography

脫鹽后的粗酶液上樣DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，洗脫后得到多個(gè)洗脫峰，洗脫曲線如圖1所示。不含酶活力的大量雜蛋白峰在低中濃度NaCl條件下先被洗脫下來(lái)，而后隨著NaCl濃度的提高，大量蛋白被洗脫下來(lái)，對(duì)收集管檢測(cè)酶活力顯示，酶活洗脫峰與第3大蛋白洗脫峰基本重合，接著在高NaCl濃度條件下雜蛋白被洗脫下來(lái)。測(cè)定結(jié)果表明，在該分離條件下，蛋白組分與雜質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)了較好分離，有酶活力的對(duì)應(yīng)收集管合并后用于后續(xù)純化操作。經(jīng)過(guò)離子交換層析，TvGOD比活力達(dá)到134.47 U/mg，酶回收率為52.80%，純化倍數(shù)為4.53。

圖2 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析Fig. 2 Elution profile of TvGOD by Phenyl Sepharose 6 Fast Flow hydrophobic chromatography

收集離子交換層析活性部分上樣到Phenol Sepharose 6 Fast Flow疏水層析柱上，逆硫酸銨濃度梯度洗脫得到一系列蛋白洗脫峰，如圖2所示，硫酸銨濃度在0.6～0.8 mol/L范圍，洗脫管峰具有TvGOD活力，其他蛋白峰檢測(cè)不到活性。收集所有具有酶活力的流出液，測(cè)得比活力為232.76 U/mg，純化倍數(shù)為7.83，回收率為33.08%。

圖3 Sephadex G-75分子篩凝膠過(guò)濾層析Fig. 3 Chromatography of TvGOD on Sephadex G-75

收集合并有活性的蛋白峰，進(jìn)一步通過(guò)Sephadex G-75分子篩凝膠柱分離純化。從圖3可看出，樣品出現(xiàn)5 個(gè)蛋白質(zhì)峰，說(shuō)明TvGOD與其他雜蛋白得到了有效分離。5 個(gè)峰中僅有位于第25～37管之間的第2峰具有酶活力。在其他峰處沒(méi)有檢測(cè)到酶活力，故該層析可有效除去大部分雜蛋白。活力峰峰形尖陡且較窄，說(shuō)明分子篩凝膠過(guò)濾層析分離效果較好。各步純化情況如表1所示，經(jīng)此步純化后酶比活力達(dá)426.67 U/mg，酶活力回收率為19.15%，純化倍數(shù)為14.36。

表1 綠色木霉WX24 TvGOD的分離純化Table 1 Purification of TvGOD from T. viride WX24

2.2 TvGOD純度和分子質(zhì)量測(cè)定

圖4 TvGOD的SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE profile of purified TvGOD

由圖4可見(jiàn)，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow分離后酶液中還含有大量雜蛋白；Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析后，雜蛋白顯著降低，但仍有多條清晰條帶；而經(jīng)Sephadex G-75分子篩凝膠過(guò)濾色譜柱分離后的酶液僅有1 條條帶，說(shuō)明采用以上分離純化后已獲得純度較高的TvGOD。經(jīng)計(jì)算其分子質(zhì)量約為93 kDa。

2.3 TvGOD酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 TvGOD最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

圖5 TvGOD最適作用溫度及熱穩(wěn)定性Fig. 5 Optimum reaction temperature of TvGOD

如圖5所示，在20～60 ℃酶活力隨溫度的升高而增加，在20～40 ℃之間酶活力增加幅度較小，40 ℃時(shí)相對(duì)酶活力約為30%；在40～50 ℃酶活力隨溫度升高急速增加，50～60 ℃酶活力隨溫度升高活力增加速度變緩，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高；隨后酶活力逐漸降低，但當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)酶活力還能達(dá)到75%，說(shuō)明該酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，可以看出該酶嗜高溫，在實(shí)際生產(chǎn)中有較好的應(yīng)用前景。

由圖5熱穩(wěn)定性曲線看出，在所檢測(cè)溫度下，酶活力非常穩(wěn)定。當(dāng)TvGOD在20～60 ℃時(shí)殘余酶活力都能保持90%以上，當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)酶活力隨溫度的升高穩(wěn)定性下降比較明顯，但在70 ℃時(shí)保溫2 h殘余酶活力扔有65%?？梢钥闯鲈揟vGOD對(duì)于溫度耐受性較好，使用范圍較廣，在工廠使用中無(wú)需冷凍保藏。

2.3.2 pH值對(duì)酶活力和酶穩(wěn)定性的影響

圖6 pH值對(duì)TvGOD活性及穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of temperature on the stability of TvGOD

如圖6所示，pH 3.0～6.0范圍內(nèi)酶活力隨pH值升高而增加，當(dāng)pH值超過(guò)6.0時(shí)，酶活力急速下降，故酶最適作用pH 6.0。pH 3.0～4.0酶活力增加較為顯著；當(dāng)pH值超過(guò)4.0時(shí)酶活力增加幅度減緩。pH 5.0時(shí)相對(duì)酶活力為85%，pH 7.0時(shí)相對(duì)酶活力為87%，但當(dāng)pH 10.0時(shí)，酶活力幾乎測(cè)不到，故TvGOD適合弱酸性條件下使用。從圖6的pH值穩(wěn)定性曲線看出，在pH 4.0～7.0之間，TvGOD非常穩(wěn)定，酶活力保持在85%以上。特別是在pH 4.5～6.0之間，48 h內(nèi)酶活力保持90%以上。由此表明，TvGOD在在弱酸性條件下較為穩(wěn)定，這同酶的活性條件相一致。

2.3.3 金屬離子及抑制劑對(duì)TvGOD活力的影響

表2 金屬離子及抑制劑對(duì)TvGOD活性的影響Table 2 Effect of various metal ions and inhibitors on TvGOD activity

如表2所示，在5 mmol/L離子濃度下，Mg2+和Ca2+對(duì)酶均有激活作用，其中Mg2+激活作用更為顯著，相對(duì)酶活力達(dá)到138%，Ca2+的相對(duì)酶活力達(dá)到112%；Na+和K+對(duì)酶活力幾乎沒(méi)有影響，但Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+對(duì)酶活力有輕微的抑制作用，而Hg2+和Pb2+幾乎能夠完全抑制酶活力；表面活性劑SDS、CTAB、Tween-80、Trition X-100對(duì)酶活力有輕微抑制作用；金屬螯合劑EDTA對(duì)酶的抑制作用較弱；PSFM對(duì)酶活力抑制作用非常強(qiáng)烈，酶活力僅有10.2%。

2.3.4 TvGOD動(dòng)力學(xué)分析

利用不同濃度葡萄糖（10～80 mmol/L）作為底物，測(cè)定TvGOD的反應(yīng)初速率。按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，結(jié)果如圖7所示，求得TvGOD的表觀米氏常數(shù)Km為11.62 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為8.244 mmol/（L·min）。

圖7 酶催化不同濃度的葡萄糖Lineweaver-Burk曲線Fig. 7 Lineweaver-Burk plot of TvGOD activity at different glucose concentrations

3 討 論

目前，我國(guó)在微生物GOD的應(yīng)用還處于剛起步階段，由于高純度GOD的提取工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)依賴大量高價(jià)進(jìn)口GOD產(chǎn)品，限制了微生物GOD的廣泛應(yīng)用。層析技術(shù)在生物酶制劑的分離純化中具有重要意義，與其他分離技術(shù)相比，其分離效率高、適用范圍廣、過(guò)程易于放大和易于自動(dòng)化等特點(diǎn)。但迄今為止，層析技術(shù)應(yīng)用于微生物GOD純化的報(bào)道及產(chǎn)品甚少，主要原因是發(fā)酵液成分復(fù)雜、野生型微生物的GOD產(chǎn)量低等。本研究從綠色木霉WX24菌株發(fā)酵液中，利用硫酸銨分級(jí)鹽析及離子交換層析、疏水層析以及分子篩凝膠過(guò)濾層析技術(shù)，分離純化到了電泳純的TvGOD，比活力達(dá)到426.67 U/mg，純化倍數(shù)14.36，回收率19.15%。郝杰清等[24]從重組畢赤酵母發(fā)酵液中一步Q-Sepharose Fast Flow層析，實(shí)現(xiàn)了純化酶比活力73.17 U/mg，純化倍數(shù)為1.35。Simpson等[13]建立的青霉屬菌株CBS 120262（Penicillium sp. CBS 120262）GOD純化方法，采用兩步柱層析、兩步沉淀、兩步超濾，比活力達(dá)到312.0 U/mg，產(chǎn)率14.1%。與報(bào)道相比，本研究所應(yīng)用的純化方法所得酶的比活力和純化倍數(shù)均較高，主要源于采用了3 種柱層析方法，而報(bào)道的大多采用兩種層析技術(shù)，本研究增加了疏水層析，更為有效地去除了雜蛋白、色素等雜質(zhì)，而對(duì)酶的回收率影響不大。在傳感器領(lǐng)域，GOD的純度、特異性以及苛刻環(huán)境的耐受性對(duì)傳感器的靈敏度、專一性及使用壽命具有重要影響。本研究純化的方法，在酶的純度和酶比活力方面具有較大優(yōu)勢(shì)，所純化酶制劑適用于對(duì)酶純度較高的研究中。但因純化環(huán)節(jié)多，酶的回收率偏低。因此，從成本和純化的規(guī)模考慮，本純化的方法可以借鑒，并需要進(jìn)一步深入研究。

目前有關(guān)GOD的報(bào)道主要源于曲霉屬[25-26]和青霉屬[8,13,27]以及基因重組表達(dá)的畢赤酵母[28]，又以黑曲霉來(lái)源的為主，而本研究所用菌株綠色木霉因其安全性好、生長(zhǎng)速度快、對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件要求低等優(yōu)點(diǎn)，常用于發(fā)酵制備各種酶，是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的常用菌株。TvGOD生產(chǎn)還鮮見(jiàn)報(bào)道，這對(duì)于開(kāi)發(fā)新特性的GOD、增加資源多樣性具有積極意義。

來(lái)源于不同細(xì)菌或真菌的GOD，酶的理化性質(zhì)都差異很大，包括分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、最適水解反應(yīng)條件等[29]。而且大多數(shù)不同來(lái)源的GOD活力低，適用范圍比較單一，或酸性，或堿性，且不耐高溫，這導(dǎo)致GOD在工業(yè)上的應(yīng)用受到了極大的限制。本研究的TvGOD酶學(xué)性質(zhì)表明，酶最適溫度為60 ℃，在50～60 ℃之間，酶活力保持在90%以上。Simpson等[13]報(bào)道的Penicillium sp. GOD最適溫度25～30 ℃，Courjean等[30]從P. amagasakiense克隆的基因重組表達(dá)GOD最適溫度50 ℃，石淑鈺等[15]報(bào)道了1 株海洋細(xì)菌假單胞桿菌（P. migulae），所產(chǎn)GOD最適溫度20 ℃，與報(bào)道相比，本研究的TvGOD更適合于高溫環(huán)境下使用。就熱穩(wěn)定性來(lái)看，本研究的TvGOD在60 ℃以下保溫2 h，殘余酶活力均在90%以上，65 ℃保溫2 h后相對(duì)酶活力為87%。石淑鈺等[15]報(bào)道的GOD超過(guò)40 ℃保存時(shí)，酶活力迅速降低；蘇茉等[14]報(bào)道的黑曲霉GOD在30～40 ℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。通過(guò)以上比較發(fā)現(xiàn)，TvGOD高溫耐受性非常好，這可能因?yàn)槊傅鞍追肿咏Y(jié)構(gòu)中存在二硫鍵等促進(jìn)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的因素存在，本課題組將進(jìn)一步克隆GOD基因，研究基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從分子角度分析耐熱性的原因。具有耐高溫優(yōu)良特性的酶，適用于高溫環(huán)境工藝中，比如飼料高溫造粒、食品巴士殺菌、傳感器高溫環(huán)境下檢測(cè)等。

酶學(xué)性質(zhì)研究顯示TvGOD在pH 5.0～7.0都可以保持80%以上活力，并且該酶在pH 5～10之間保持85%以上酶活力，酶的最適作用pH 6.0，這與郝杰清[24]以及Crognale[4]等報(bào)道的重組畢赤酵母GOD相同。而有報(bào)道來(lái)源于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）GOD最佳作用pH 7.5[31]，假單胞桿菌（P. migulae）GOD最適pH 7.0[15]，黑曲霉（Aspergillius niger）H1-9b GOD最佳pH 5.7[14]。從穩(wěn)定性來(lái)看，GOD在弱酸性條件下保持了高穩(wěn)定性。綜上，TvGOD適合酸性環(huán)境下使用，可用作飼料添加劑，在畜禽胃的酸性環(huán)境中，酶依然具有高的催化活性。金屬離子Mg2+和Ca2+對(duì)酶有強(qiáng)烈的激活作用，特別是Ca2+的激活作用更為顯著，這種激活特性在目前報(bào)道的GOD還鮮見(jiàn)。表面活性劑SDS、CTAB、Tween-80、Trition X-100對(duì)酶的抑制作用非常有限，說(shuō)明酶對(duì)表面活性劑的耐受性較好。這種苛刻環(huán)境的耐受性與酶的高溫耐受性相一致，進(jìn)一步說(shuō)明TvGOD分子結(jié)構(gòu)中存在穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)的因素。

不同來(lái)源的GOD之間Km值差異性較大。對(duì)比報(bào)道的GOD，本研究所分離得到的TvGOD的Km值處于已報(bào)道文獻(xiàn)中相對(duì)較低的范圍，說(shuō)明其對(duì)底物葡萄糖具有相對(duì)較好的親合力，因此具有潛在的應(yīng)用研究?jī)r(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究建立了TvGOD分離純化方法，并得到電泳純的TvGOD，對(duì)照已有報(bào)道的GOD純化，本研究酶的比活力、回收率以及純化倍數(shù)較高，酶分子質(zhì)量與報(bào)道的大部分相比偏小。進(jìn)一步酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶在高溫下活性較高，60 ℃達(dá)到最高，在65 ℃以下酶比較穩(wěn)定。酶在弱酸性條件下催化活性及穩(wěn)定性高，表明該酶更適合酸性環(huán)境下使用。金屬離子與抑制劑實(shí)驗(yàn)顯示常規(guī)金屬離子對(duì)酶沒(méi)有明顯抑制作用，而Mg2+和Ca2+有顯著的激活作用，表面活性劑對(duì)酶活力沒(méi)有強(qiáng)烈抑制作用。酶的催化動(dòng)力學(xué)研究表明，酶Km值低于大部分目前文獻(xiàn)報(bào)道的水平，說(shuō)明酶對(duì)底物葡萄糖親和力高，特異性強(qiáng)。GOD在傳感器領(lǐng)域有重要應(yīng)用，而傳感器的使用環(huán)境復(fù)雜，很多是非?？量痰拇呋瘲l件，本研究純化得到的TvGOD在溫度、pH值、常規(guī)金屬離子以及表面活性劑等方面表現(xiàn)出突出的耐受優(yōu)勢(shì)，因此TvGOD在傳感器領(lǐng)域以及食品、飼料等行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外，為了使該酶進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，本研究團(tuán)隊(duì)將測(cè)定酶的N-端序列或內(nèi)肽序列，從而反推出TvGOD的部分DNA基因序列，進(jìn)而通過(guò)基因步移或Race技術(shù)克隆出完整的GOD基因，最后開(kāi)展構(gòu)建基因工程菌等后續(xù)研究，最終實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。