枯草芽孢桿菌殼聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其酶解特性

馬 帥，楊紹青，劉翊昊，閆巧娟，江正強(qiáng),*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

殼聚糖是幾丁質(zhì)部分脫乙酰的產(chǎn)物，由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨葡萄糖以β-(1,4)-糖苷鍵隨機(jī)連接而成的直鏈天然多聚物[1]。殼寡糖是殼聚糖降解的產(chǎn)物，聚合度（degree of polymerization，DP）一般在2～10之間，其分子質(zhì)量低，水溶性好，具有許多生理活性，如抑菌性、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇、降血壓、防感染以及控制關(guān)節(jié)炎等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域[2]。殼聚糖酶是專一降解殼聚糖的酶類，分為糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）5、7、8、46、75和80家族，包括兩類：一類是內(nèi)切型殼聚糖酶（EC3.2.1.132），從還原端在殼聚糖鏈中隨機(jī)切割β-(1,4)-糖苷鍵，產(chǎn)生不同DP的殼寡糖及氨基葡萄糖；另一類是外切型殼聚糖酶（EC3.2.1.165），也稱為β-D-葡萄糖胺酶，是從非還原端切割β-(1,4)-糖苷鍵，產(chǎn)生氨基葡萄糖[3]。

殼聚糖酶來源廣泛，主要為細(xì)菌和真菌，少數(shù)來源于植物組織和病毒[3-4]。近年來已篩選到多株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株[4-6]，但是野生型菌株產(chǎn)酶水平低，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的要求，采用異源表達(dá)提高產(chǎn)酶水平逐漸成為研究的重點(diǎn)。自1991年成功從變鉛青鏈霉菌TK-24中克隆表達(dá)了殼聚糖酶后[7]，近年來已克隆出許多微生物殼聚糖酶基因，并在不同宿主中表達(dá)[8-15]，但是僅少數(shù)研究實(shí)現(xiàn)了高水平。如Chen Xiaomei[16]和Huang Liang[17]等將煙曲霉殼聚糖酶基因分別在畢赤酵母和大腸桿菌中表達(dá)，高密度發(fā)酵后酶活力為25 000 U/mL和14 000 U/mL，這分別是殼聚糖酶在畢赤酵母和大腸桿菌分泌表達(dá)中的最高水平。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）殼聚糖酶的基因克隆表達(dá)研究較多，但酶比活力及產(chǎn)酶水平大都偏低。Rivas等[18]將枯草芽孢桿菌168殼聚糖酶基因在該菌株中表達(dá)，酶比活力僅56.9 U/mg。Pechsrichuang[9]和Su Pocheng[12]等又將該基因在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中分泌表達(dá)，高密度發(fā)酵后酶活力分別僅為45 U/mL和208.23 U/mL。Lin等[8]將枯草芽孢桿菌NCHU-05的殼聚糖酶基因分別在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達(dá)，酶比活力分別為3 655 U/mg和3 780 U/mg。Kang Linxin等[19]將枯草芽孢桿菌HD145殼聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，其酶比活力為9 000 U/mg，但是沒有報(bào)道高密度發(fā)酵情況。

殼聚糖酶在農(nóng)業(yè)生物防治、殼寡糖的制備及海產(chǎn)品廢物處理等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，轉(zhuǎn)化殼聚糖為殼寡糖是殼聚糖酶在工業(yè)上重要的應(yīng)用之一[3]?；瘜W(xué)法、物理法[20-21]制備殼寡糖存在工藝條件難控制、環(huán)境污染大、低寡糖產(chǎn)率、產(chǎn)品中常伴大量單糖等缺點(diǎn)。酶法制備殼寡糖具有條件溫和、過程易控制、對(duì)環(huán)境友好、產(chǎn)率高單糖少等優(yōu)點(diǎn)而成為工業(yè)生產(chǎn)殼寡糖的首選方法。殼聚糖酶是酶法制備殼寡糖的關(guān)鍵酶[3]。由于殼寡糖具有重要的應(yīng)用價(jià)值，挖掘高活性殼聚糖酶并提高其產(chǎn)酶水平是酶法制備殼寡糖的關(guān)鍵和研究的熱點(diǎn)。枯草芽孢桿菌WY-34是本實(shí)驗(yàn)室篩選的1 株高產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株[22]，前期研究從中克隆了1 個(gè)GH46家族殼聚糖酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)[23]，但不適宜工業(yè)化應(yīng)用。為提高該酶工業(yè)應(yīng)用前景，本研究將該酶在巴斯德畢赤酵母GS115中表達(dá)，并研究重組酶的性質(zhì)和酶解特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌WY-34為本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存；大腸桿菌DH5α 博邁德生物技術(shù)公司；表達(dá)載體pPIC9K、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115 美國(guó)Invitrogen公司。

限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I、T4 DNA連接酶 大連TaKaRa公司；TransStart Fast pfu DNA polymerase 北京全式金生物技術(shù)公司；殼聚糖（脫乙酰度75%～85%）、幾丁質(zhì)、乙二醇?xì)ぞ厶?、羧甲基纖維素、微晶纖維素和氨基葡萄糖（GlcN） 美國(guó)Sigma公司；乙二醇幾丁質(zhì)日本W(wǎng)ako公司；殼聚糖（脫乙酰度85%）為國(guó)產(chǎn)分析純；殼寡糖（(GlcN)2、(GlcN)3、(GlcN)4、(GlcN)5、(GlcN)6）標(biāo)準(zhǔn)品 青島博智匯力生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器設(shè)備有限公司；5 L發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生化工程有限公司；蛋白純化系統(tǒng) 上海青浦滬西儀器廠；Kieselgel 60硅膠板德國(guó)E. Merck公司；LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興生物技術(shù)公司；Dionex ICS-5000 SP離子色譜系統(tǒng)美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖酶基因密碼子優(yōu)化及其在畢赤酵母中的表達(dá)

將枯草芽孢桿菌WY-34殼聚糖酶基因序列[23]提交DNAWorks（http：//mcl.ncifcrf.gov/dnaworks/）進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列（BsCsn46）送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用Graphical Codon Usage Analyser（http：//gcua.schodel.de/）分析密碼子使用偏好性和Codon Adaptation Index Calculator（https：//www.biologicscorp.com/tools/CAICalculator）分析基因密碼子適應(yīng)指數(shù)。根據(jù)密碼子優(yōu)化后的基因序列和表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物BsCsn46-F：AACCGGAATTCATGGGACTGAAT AAAGATCAAAAGC（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)）；下游引物BsCsn46-R：AAGAATGCGGCCGCTTA TTTGATTACAAAATTACCGTAC（下劃線為Not I酶切位點(diǎn)）。以密碼子優(yōu)化后的序列為模板，PCR程序：95 ℃、2 min；95 ℃、20 s；55 ℃、20 s；72 ℃、30 s；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物與pPIC9K用EcoR I和Not I雙酶切，采用T4 DNA連接酶16 ℃連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-BsCsn46，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司（北京測(cè)序部）測(cè)序。重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母、重組蛋白在巴斯德畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選參考Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen）。

1.3.2 BsCsn46高密度發(fā)酵

高密度發(fā)酵方法及培養(yǎng)基參照Pichia Fermentation Process Guideline（Invitrogen）。簡(jiǎn)言之，篩選獲得的高酶活轉(zhuǎn)化子接種150 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm約為10，作為種子液。高密度發(fā)酵選用5 L發(fā)酵罐，工作體積為1.5 L。分批發(fā)酵及甘油流加發(fā)酵時(shí)，采用28%氨水調(diào)pH 5.0，溫度30 ℃，起始攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，通氣量1.5 m3/（m3·min）。待分批培養(yǎng)中甘油耗盡開始流加50%甘油6～8 h，通過控制流加補(bǔ)料速度監(jiān)控溶氧大于20%。待菌體濕質(zhì)量達(dá)到200 g/L后停止流加甘油，開始流加100%甲醇，更改pH值和轉(zhuǎn)速分別為6.0和800 r/min。 通過控制甲醇流加速度監(jiān)控溶氧大于20%，甲醇流加速率見表1。誘導(dǎo)開始每12 h取樣測(cè)定菌體濕質(zhì)量、胞外殼聚糖酶活力及胞外蛋白含量。

表1 誘導(dǎo)階段甲醇流加補(bǔ)給速率Table 1 Methanol feeding rates in induction phases

1.3.3 殼聚糖酶活力及蛋白含量的測(cè)定

殼聚糖酶活力測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[24]，以氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)。500 μL 0.5 g/100 mL殼聚糖（脫乙酰度75%～85%）溶液和100 μL適當(dāng)稀釋的酶液混勻，于55 ℃保溫10 min，加入500 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴10 min顯色。12 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，反應(yīng)每分鐘釋放1 μmoL還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

蛋白含量測(cè)定參照Lowry法[25]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.4 BsCsn46的純化

發(fā)酵培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min，上清液采用50 mmol/L KH2PO4-NaOH（pH 8.0）緩沖液4 ℃透析12 h。透析樣品經(jīng)Q-Sepharose Fast Flow（1.0 cm×10 cm）強(qiáng)陰離子交換層析分離純化，0.5 mL/min流速上樣。層析柱預(yù)先用初始緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-NaOH（pH 8.0））平衡。采用含有0～200 mmol/L NaCl的初始緩沖液以1.0 mL/min流速線性洗脫目的蛋白，通過測(cè)定OD280nm收集蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)蛋白純度。

1.3.5 SDS-PAGE、去糖基化及殼聚糖酶酶譜分析

SDS-PAGE參照Laemmli等[26]的方法。

BsCsn46去糖基化分析采用去糖基化酶（endo-β-N-acetylglucosaminidase，Endo H），SDS-PAGE檢測(cè)去糖基化結(jié)果，以不經(jīng)去糖基化酶處理的樣品作為對(duì)照。

殼聚糖酶酶譜參考Pechsrichuang等[9]方法稍作修改。SDS-PAGE分離膠中加入0.1 g/100 mL的殼聚糖，電泳完成后將分離膠在復(fù)性緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-NaOH（pH 7.5），1 g/100 mL Triton X-100）中浸洗6～8 h；再將分離膠置于10 mmol/L乙酸-乙酸鈉溶液（pH 6.0）中，45 ℃保溫2 h。0.1 g/100 mL剛果紅染色15 min，1 mol/L NaCl溶液脫色至條帶清晰。

1.3.6 BsCsn46的酶學(xué)性質(zhì)分析

最適pH值在3 種緩沖液（乙酸-乙酸鈉 pH 3.5～6.0；MES pH 5.0～7.5；Bistris-HCl pH 5.5～7.5）條件下測(cè)定。用上述緩沖液配制0.5 g/100 mL的殼聚糖溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以酶活力最高點(diǎn)為100%，分別計(jì)算不同pH值條件下的相對(duì)酶活力。pH值穩(wěn)定性在6 種緩沖液（檸檬酸-檸檬酸三鈉pH 3.0～6.0；乙酸-乙酸鈉pH 3.5～6.0；NaH2PO4-Na2HPO4pH 6.0～8.0；Tris-HCl pH 7.0～9.0；CHES pH 8.0～10.0；CAPS pH 10.0～11.0）下測(cè)定，用上述緩沖液適當(dāng)稀釋酶液于45 ℃保溫30 min，在最適條件下測(cè)定溶液殘余酶活力。

用最適pH值的緩沖液配制底物，在25～80 ℃范圍測(cè)定酶反應(yīng)最適溫度。以酶活力最高點(diǎn)為100%，分別計(jì)算不同溫度條件下的相對(duì)酶活力。溫度穩(wěn)定性在20～60 ℃測(cè)定，將酶液分別在20～60 ℃保溫30 min，冰水浴30 min后，測(cè)定殘余酶活力。半衰期在45、50、55 ℃條件下測(cè)定，將酶液用50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4溶液（pH 7.5）適當(dāng)稀釋后于上述溫度下處理不同時(shí)間，測(cè)定溶液殘余酶活力，計(jì)算不同溫度下酶活力衰變至50%所需的時(shí)間。

1.3.7 BsCsn46底物特異性及水解特性

用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉（pH 6.0）緩沖液分別配制0.5 g/100 mL的殼聚糖、乙二醇?xì)ぞ厶恰⒛z體幾丁質(zhì)、乙二醇幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素鈉及微晶纖維素溶液；按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)酶活力，考察酶對(duì)不同底物的特異性。

水解特性采用1 g/100 mL的殼聚糖（脫乙酰度85%）溶液（50 mmol/L pH 6.0乙酸-乙酸鈉緩沖液），加酶量1 U/mL，45 ℃反應(yīng)，間隔不同時(shí)間（0.25、0.5、1、2、4、8、12 h）取樣，薄層層析法（thin-layer chromatography，TLC）分析水解產(chǎn)物。TLC條件：展層劑為正丙醇-25%氨水-水（3∶1∶1，V/V）；顯色劑為體積分?jǐn)?shù)5%硫酸-甲醇溶液。

1.3.8 BsCsn46水解殼聚糖制備殼寡糖

采用3 g/100 mL殼聚糖（脫乙酰度85%，溶于0.1 mol/L乙酸溶液）溶液，加酶量6 U/mL，pH 6.0、45 ℃水解8 h，沸水浴5 min滅酶，加入適量5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值大于9，以沉淀未反應(yīng)的殼聚糖，12 000 r/min離心15 min，上清液和沉淀分別冷凍干燥稱質(zhì)量。水解率及殼寡糖得率計(jì)算參考Qin Zhen等[14]方法，如式（1）、（2）所示：

式中：m1為殼聚糖的質(zhì)量；m2為上清液冷凍干燥后的質(zhì)量；m3為沉淀冷凍干燥的質(zhì)量；m4為乙酸的質(zhì)量；m5為NaOH的質(zhì)量。

1.3.9 水解產(chǎn)物成分分析及定量

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析水解液的寡糖組成。水解液送北京中科百測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用AB SCIEX 4000 QTRAP系統(tǒng)，陽離子模式，基質(zhì)為2,5-二羥基苯甲酸。

采用高效陰離子交換色譜（high-performance anionexchange chromatography，HPAEC）法對(duì)水解液的寡糖定量分析。取1 mL水解液加入等體積0.25 mol/L NaOH溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用于HPAEC分析。色譜柱：CarboPac PA1（4 mm×250 mm）；檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器（配備一個(gè)金電極和Ag/AgCl參比電極）；流動(dòng)相：100 mmol/L NaOH，0～25 mmol/L乙酸鈉溶液線性洗脫30 min；進(jìn)樣量：25 μL；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。

寡糖得率計(jì)算如式（3）所示：

式中：Yn為DP 2～4的寡糖得率/%；Cn為DP 2～4的寡糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為水解反應(yīng)總體積/mL；m為總殼聚糖的質(zhì)量/mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖片處理，數(shù)據(jù)均為3 次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖酶基因密碼子優(yōu)化及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)

枯草芽孢桿菌殼聚糖酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化將一些稀有密碼子（CGG（Arg）、CGC（Arg）和GCA（Ala），在巴斯德畢赤酵母中的使用頻率小于10%）替換為巴斯德畢赤酵母使用偏好的密碼子，密碼子適應(yīng)指數(shù)由0.66提高到0.92，G+C含量由47.9%調(diào)整為51.8%，這說明優(yōu)化后的序列與畢赤酵母密碼子使用偏好性高度匹配。密碼子優(yōu)化后的基因序列（BsCsn46）已提交GenBank，登錄號(hào)為MH715979。優(yōu)化后的序列導(dǎo)入畢赤酵母中表達(dá)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)遺傳霉素抗性（G418）平板篩選后獲得1 株高殼聚糖酶活力（414.4 U/mL）的重組菌株。該菌株在5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵144 h后，胞外殼聚糖酶活力及蛋白質(zhì)量濃度分別為50 370.0 U/mL和15.7 mg/mL，菌體濕質(zhì)量高達(dá)428.6 g/L（圖1a）。甲醇誘導(dǎo)過程中胞外蛋白組成的SDS-PAGE分析見圖1b，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，目的條帶逐漸變粗，發(fā)酵上清液中重組殼聚糖酶含量逐漸增多。

圖1 BsCsn46畢赤酵母表達(dá)高密度發(fā)酵歷程（a）及胞外蛋白SDS-PAGE分析（b）Fig. 1 Time course of BsCsn46 expression in P. pastoris (a) and SDS-PAGE profile of extracellular protein production (b) during high cell-density fermentation

密碼子偏好、基因拷貝數(shù)和高密度發(fā)酵等是影響外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的重要因素[27]。提高偏好密碼子的使用頻率及密碼子適應(yīng)指數(shù)是提高外源蛋白表達(dá)量的有效方法之一[27-28]。本研究通過密碼子優(yōu)化使得目的基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)顯著提高，具有在巴斯德畢赤酵母中高效表達(dá)的潛力。在一定范圍內(nèi)，增加基因拷貝數(shù)能夠提高蛋白表達(dá)量[27]。研究通過G418抗性為篩選標(biāo)記，從G418質(zhì)量濃度為3 mg/mL的平板上篩選了1 株高殼聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子，相當(dāng)于12 個(gè)基因拷貝數(shù)，一定程度提高了蛋白表達(dá)量。甲醇流加策略是影響菌體密度和外源蛋白表達(dá)量的關(guān)鍵因素之一，適宜的甲醇流加速率是細(xì)胞形成高密度的關(guān)鍵[29]。根據(jù)溶氧反饋機(jī)制，采用甲醇四階段流加策略，根據(jù)不同生長(zhǎng)階段溶氧變化調(diào)整甲醇流加速率，維持溶氧大于20%，避免了發(fā)酵過程中溶氧不足和甲醇累積，從而使菌體密度顯著提升。在以上多種因素的共同影響下，目的蛋白的表達(dá)水平顯著提高。與文獻(xiàn)報(bào)道的殼聚糖酶基因克隆表達(dá)水平相比，該酶的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于現(xiàn)有文獻(xiàn)的重組殼聚糖酶高密度發(fā)酵水平（表2），具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

表2 殼聚糖酶基因異源表達(dá)水平Table 2 Heterologous expression levels of different chitosanases

2.2 BsCsn46的純化

表3 BsCsn46的純化Table 3 Purification of BsCsn46

粗酶液經(jīng)一步Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換層析得到電泳級(jí)純酶。純酶比活力為4 065.7 U/mg，純化過程中純化倍數(shù)為1.2，酶活回收率為88.3%（表3）。如圖2所示，粗酶和純酶均有2 條明顯條帶，酶譜顯示兩條帶均有殼聚糖酶活性；純酶經(jīng)Endo H處理后顯示為一條帶，說明重組酶發(fā)生了部分糖基化現(xiàn)象。純酶經(jīng)凝膠過濾法及SDS-PAGE法測(cè)得兩條目的帶分子質(zhì)量分別為39、34 kDa及38、32 kDa，說明該酶為單亞基蛋白。

該酶具有很高的酶比活力，除枯草芽孢桿菌HD145殼聚糖酶（9 000 U/mg）[19]外，高于其他重組枯草芽孢桿菌殼聚糖酶的比活力，如大腸桿菌表達(dá)的枯草芽孢桿菌168殼聚糖酶（900 U/mg）[9]和枯草芽孢桿菌NCHU-05殼聚糖酶（3 655 U/mg）[8]、畢赤酵母表達(dá)的枯草芽孢桿菌CH2殼聚糖酶（338.1 U/mg）[30]，也遠(yuǎn)高于其他重組芽孢桿菌屬殼聚糖酶比活力，如畢赤酵母表達(dá)的蘇云金芽孢桿菌BMB171殼聚糖酶（240 U/mg）[13]及大腸桿菌表達(dá)的芽孢桿菌屬KCTC 0377BP殼聚糖酶（1 700 U/mg）[31]和芽孢桿菌屬TS殼聚糖酶（555.3 U/mg）[11]。同時(shí)，研究結(jié)果遠(yuǎn)高于在大腸桿菌中表達(dá)該酶的酶比活力（1 051.8 U/mg）[23]，可能是重組酶被糖基化的作用。

圖2 BsCsn46純化過程SDS-PAGE分析及去糖基化和酶譜分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of BsCsn46 purification and zymogram of deglycosylated BsCsn46

2.3 BsCsn46的酶學(xué)性質(zhì)分析

BsCsn46最適pH值為6.0（圖3a），在pH 4.5～10.0的緩沖液中處理30 min后，保持90%以上的殘余酶活力（圖3b）；該酶最適溫度為55 ℃（圖3c），45 ℃以下處理30 min酶活力幾乎沒有變化（圖3d）；該酶在45、50 ℃及55 ℃的半衰期分別為3 468.4、91.9 min及4.9 min（圖3e）。

圖3 BsCsn46的最適pH值（a）、pH穩(wěn)定性（b）、最適溫度（c）、溫度穩(wěn)定性（d）及半衰期（e）Fig. 3 Optimal pH (a), pH stability (b), optimal temperature (c),thermal stability (d) and thermal inactivation (e) of purified BsCsn46

微生物殼聚糖酶的最適pH值一般為弱酸性（pH 4.5～6.5），少數(shù)為弱堿性（pH 7.0～8.0），最適溫度一般為30～60 ℃[3,15]。除報(bào)道的Paenibacillus sp. 1794和煙曲霉殼聚糖酶[1,16]外，大多數(shù)殼聚糖酶熱穩(wěn)定性較差。該酶性質(zhì)和大多數(shù)殼聚糖酶相近（表4）。與該酶同源性最高的枯草芽孢桿菌168殼聚糖酶[9]相比，該酶最適溫度較高，熱穩(wěn)定性較好；與在大腸桿菌中表達(dá)該酶的酶學(xué)性質(zhì)[23]相比，該酶最適溫度提高了10 ℃，熱穩(wěn)定性提高5 ℃，可能是該酶被糖基化修飾的結(jié)果，有研究報(bào)道糖基化能提高蛋白熱穩(wěn)定性[32]。

表4 BsCsn46與代表性殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 4 Comparison of the enzymatic properties of BsCsn46 with representative chitosanases

2.4 BsCsn46的底物特異性及水解特性

BsCsn46對(duì)殼聚糖的水解能力很強(qiáng)（4 065.7 U/mg），對(duì)乙二醇?xì)ぞ厶堑乃饽芰苋酰?.74 U/mg），對(duì)乙二醇幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素和微晶纖維素則沒有水解能力，說明該酶具有嚴(yán)格的底物專一性。該酶水解殼聚糖終產(chǎn)物主要為二糖和三糖（圖4）。水解0.25 h，即有三糖、四糖、五糖及少量六糖產(chǎn)生，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，寡糖量逐漸增加，寡聚度逐漸變小，同時(shí)沒有檢測(cè)到單糖的產(chǎn)生，這些結(jié)果說明該酶為內(nèi)切型殼聚糖酶。

圖4 BsCsn46水解殼聚糖產(chǎn)物TLC分析Fig. 4 TLC patterns of products from chitosan hydrolysis by BsCsn46

微生物殼聚糖酶大都專一性水解殼聚糖，但一些殼聚糖酶具有羧甲基纖維素[1]和膠體幾丁質(zhì)[31]的水解能力。除P. dendritiformis殼聚糖酶[15]水解殼聚糖產(chǎn)物為單一的殼二糖外，大多數(shù)GH46家族殼聚糖酶水解產(chǎn)物均為DP 2～6的殼寡糖，但是一些殼聚糖酶水解產(chǎn)物存在單糖[10]。該酶與多數(shù)GH46家族殼聚糖酶底物特異性和水解特性相近，專一性水解殼聚糖主要產(chǎn)生二糖和三糖，無單糖產(chǎn)生，說明其適合生產(chǎn)殼寡糖。

2.5 水解殼聚糖制備殼寡糖

圖5 BsCsn46水解殼聚糖產(chǎn)物的MALDI-TOF MS（a）及離子色譜（b）分析Fig. 5 MALDI-TOF MS (a) and HPAEC (b) analysis of products from chitosan hydrolysis by BsCsn46

殼聚糖經(jīng)過8 h后基本水解完全，水解產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF MS分析為DP 2～6的寡糖（圖5a），其中二糖、三糖和四糖為脫乙酰的殼寡糖，即(GlcN)2、(GlcN)3和(GlcN)4，五糖和六糖為帶一個(gè)乙酰基的殼寡糖，即(GlcN)4-GlcNAc和(GlcN)5-GlcNAc。采用冷凍干燥法定量分析水解產(chǎn)物，水解率為92.8%，殼寡糖得率為90.9%。采用HPAEC法對(duì)水解主產(chǎn)物定量分析，主要產(chǎn)物為二糖、三糖和四糖（圖5b），其得率為77.2%，二糖、三糖和四糖占總可溶性殼寡糖的比例分別為30.6%、46.9%和4.3%。

表5 代表性殼聚糖酶水解殼聚糖制備殼寡糖的比較Table 5 Comparison of chitooligosaccharide production of chitosan with representative chitosanases

幾丁質(zhì)類生物質(zhì)是自然界含量?jī)H次于纖維素的第二大類生物質(zhì)[2]，酶法轉(zhuǎn)化殼聚糖為殼寡糖是目前研究的熱點(diǎn)。如表5所示，在相同定量方法下，本研究的殼寡糖得率高于Choij等[31]的水平，低于Gao Xingai等[33]的水平，與Chen Xiaomei等[16]和Qin Zhen等[14]的殼寡糖得率基本相當(dāng)。同時(shí)本研究的殼聚糖酶水解時(shí)間僅8 h，分別約為Cheng[34]、Choij[31]、Chen Xiaomei[16]和Gao Xingai[33]等的1/8、1/7、1/3和1/2。雖然比G. sunshinyii殼聚糖酶水解時(shí)間（6 h）[14]略長(zhǎng)，但是其水解溫度（30 ℃）低于本研究（45 ℃）。因此，BsCsn46在工業(yè)制備殼寡糖上具有很大潛力。

3 結(jié) 論

本研究采用密碼子優(yōu)化和高密度發(fā)酵技術(shù)成功將枯草芽孢桿菌殼聚糖酶基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)，經(jīng)5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后胞外殼聚糖酶活力達(dá)50 370 U/mL，蛋白質(zhì)量濃度為15.7 mg/mL，為文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平。該殼聚糖酶水解3 g/100 mL的殼聚糖時(shí)有較高的殼寡糖得率（90.9%）和水解率（92.8%），水解產(chǎn)物主要為殼二糖、殼三糖和少量殼四糖，表明該酶具有工業(yè)化生產(chǎn)殼寡糖的潛力。