大黃魚源腐敗菌的黏附特性與生物膜特性分析

張 雯，卞 丹，阮成旭，時祥柱，倪 莉,*

（1.福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350108；2.福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司，福建 福州 350008）

水體中的病原細(xì)菌可通過黏附魚鰓、魚體表和腸道定植魚體，并最終使其感染[1-2]。Van Den Abbeele等[3]發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌的黏附能力差異較大，Lee等[4]研究表明戊糖乳桿菌對腸黏液的黏附率顯著高于其他細(xì)菌。同時，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對黏液的黏附特性與菌體表面性質(zhì)（包括菌體表面疏水性、自凝聚能力）等有關(guān)，Del Re等[5]研究證實雙歧桿菌的黏附性與其表面疏水性和自凝聚能力密切相關(guān)，具有較強疏水性和自凝聚能力的菌株具有更高的黏附能力；許女等[6]也通過實驗證明牛源乳酸菌的表面疏水性和其黏附性能呈正相關(guān)。大量研究表明細(xì)菌能在黏附于物體表面、氣液界面后生長繁殖，形成由菌體細(xì)胞和胞外分泌物如多糖、蛋白質(zhì)和核酸等組成的膜狀結(jié)構(gòu)，即生物膜。致病菌形成的生物膜會促進感染的發(fā)生，阻礙疾病的治療，而魚體腐敗菌形成的生物膜則可能污染加工設(shè)備，加速魚體的衰敗、變質(zhì)。郭慶昕等[7]探究發(fā)現(xiàn)黏附能力強的銅綠假單胞菌，其生物膜形成能力也較強。龔虹等[8]研究表明乳酸菌的疏水性、自凝聚能力和生物膜形成能力有正相關(guān)關(guān)系，可作為菌體黏附能力的指標(biāo)。此外，生物膜的形成也與多種環(huán)境條件相關(guān)，尹清干等[9]實驗表明培養(yǎng)時間、初始菌濃度、溫度、pH值及不同組織和黏液等各種環(huán)境因子均能顯著影響鰻弧菌生物膜的形成。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌及一些致病菌的黏附能力、生物膜特性、疏水性等方面進行了較深入研究，而從黏附特性的角度研究魚體腐敗菌較少。希瓦氏菌和假單胞菌是引起冰鮮魚體腐敗變質(zhì)的特定腐敗菌[10-13]。本研究以大黃魚源腐敗菌為研究對象，比較腐敗菌黏附差異，探究表面疏水性、自凝聚能力及生物膜形成能力與菌體黏附能力的相關(guān)性，并通過微孔板法探究時間、pH值、溫度、初始菌濃度等因素對其成膜的影響。這些研究將進一步明確魚源腐敗菌的腐敗機理，為保鮮劑的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）MA1-5、MA1-7和MA1-13，假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）R3-1、R3-2和R3-5，分離自冰鮮大黃魚，本實驗室保存。

結(jié)晶紫 西隴化工股份有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙醇、甲醇、二甲苯、氯化鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；CF16RXII冷凍高速離心機 日本Hitachi公司；SpectraMax i3+MiniMax多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的活化與培養(yǎng)

希瓦氏菌和假單胞菌經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，劃線接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取1 環(huán)單菌落接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜。

1.3.2 細(xì)菌表面疏水性測定

采用微生物黏著碳?xì)浠衔铮╩icrobial adhesion to hydrocarbons，MATH）法[14]測定魚源腐敗菌的表面疏水性。細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)8 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌2 次，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用生理鹽水重懸菌體沉淀，并調(diào)節(jié)菌懸液濃度，使其A600nm為1.0±0.05。吸取2 mL細(xì)菌懸液和2 mL二甲苯渦旋混合2 min，于室溫靜置30 min。待其分層，取1 mL水相，測其A600nm，每組平行3 管，以生理鹽水為空白對照組。表面疏水率計算如式（1）所示：

式中：A0和A1分別為與二甲苯混勻前后水相吸光度。

1.3.3 菌株自凝聚能力測定

參考Rahman等[15]方法測定細(xì)菌自凝聚能力，細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)8 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌2 次，8 000 r/min離心10 min后，棄上清液，用生理鹽水重懸菌體沉淀制備菌懸液，使菌懸液A600nm為1.0±0.05。吸取4 mL菌懸液置于10 mL試管中，室溫靜置，分別于1、2、3、4、5 h后吸取1 mL上層溶液測定A600nm，分別記作A1、A2、A3、A4、A5，每組每個時間點平行3 管。自凝聚率計算如式（2）所示：

式中：A0和At分別為自凝聚前后上層溶液吸光度。

1.3.4 細(xì)菌黏附能力的測定

采用Vinderola等[16]方法對細(xì)菌進行熒光標(biāo)記，參照Larsen等[17]的方法收集大黃魚體表、魚鰓和魚腸部位黏液，以福林-酚法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，并調(diào)節(jié)至0.5 mg/mL，分裝保存于-20 ℃冰箱。取體表、魚鰓和魚腸黏液各150 μL加入96 孔酶標(biāo)板中，4 ℃包被過夜。棄去未結(jié)合黏液，用200 μL無菌0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗2 次，加入150 μL異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的菌懸液，4 ℃孵育120 min。用無菌生理鹽水清洗2 次除去未黏附的細(xì)菌，再加入150 μL 1%十二烷基硫酸鈉（0.1 mol/L NaOH）溶液于60 ℃培養(yǎng)箱中釋放裂解1 h，多功能酶標(biāo)儀上檢測，每組重復(fù)9 孔，以1%十二烷基硫酸鈉為空白對照，通過熒光強度按式（3）計算細(xì)菌黏附率。多功能酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置：激發(fā)光波長：495 nm；發(fā)射光波長：525 nm；光學(xué)位置：bottom；每孔樣品檢測次數(shù)：12 次。

式中：FI2為實驗組的熒光強度；FI1為FITC標(biāo)記的純菌懸液的熒光強度。

1.3.5 細(xì)菌生物膜的檢測

參考Djordjevic等[18]微孔板法并適當(dāng)修改。魚源腐敗菌過夜培養(yǎng)后，與新鮮TSB按1∶1 000稀釋混勻，取200 μL加至96 孔酶標(biāo)板孔中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用200 μL 0.85%無菌生理鹽水輕柔清洗2 次，除去游離菌，室溫下干燥。每孔加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色15 min后棄去染液，去離子水清洗5 次。完全干燥后，加入200 μL 95%乙醇溶液，待結(jié)晶紫充分溶解后，吸取100 μL放于全新96 孔板中，用多功能酶標(biāo)儀檢測A590nm。每組設(shè)置9 個平行，以無菌TSB為空白對照。

1.3.6 不同因素對生物膜形成特性的影響

1.3.6.1 培養(yǎng)時間對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

以希瓦氏菌MA1-7為魚源腐敗菌代表，測定不同因素對細(xì)菌生物膜形成的影響。將生物膜培養(yǎng)時間分別設(shè)置為6、12、24、30、36、48、54、60、72 h，按1.3.5節(jié)方法測定生物膜形成情況。

1.3.6.2 菌濃度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

用TSB培養(yǎng)液配制終密度為108CFU/mL的菌懸液，10 倍系列梯度稀釋法依次得到107、106、105、104、103、102CFU/mL的菌懸液，按1.3.5節(jié)方法測定生物膜形成情況，探究初始菌濃度對生物膜形成的影響。

1.3.6.3 溫度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

TSB肉湯培養(yǎng)液配制終密度為106CFU/mL的菌懸液，分別在4、10、20、28、37、45 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，按1.3.5節(jié)方法測定生物膜形成情況。

1.3.6.4 pH值對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

分別用pH 3、4、5、6、7、8、9、10的TSB培養(yǎng)液配制菌濃度為106CFU/mL的菌懸液，按1.3.5節(jié)方法測定生物膜形成情況。

1.3.6.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

分別配制NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、6%的TSB培養(yǎng)液，以此制備菌懸液，按1.3.5節(jié)方法探究NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對魚源腐敗菌生物膜形成的影響。

1.3.6.6 不同部位黏液對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

分別取體表、魚鰓和魚腸黏液200 μL加入96 孔板中，4 ℃過夜包被，棄去未結(jié)合黏液，用無菌生理鹽水清洗2 次，按1.3.5節(jié)方法測定生物膜形成情況，以未經(jīng)黏液包被的96 孔板作為對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以 ±s表示，采用GraphPad Prism 6.0繪圖，SPSS 22.0的Duncan檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌表面疏水性和自凝聚能力分析

菌體表面疏水作用和自凝聚能力是細(xì)菌非特異性黏附到各種生物和非生物表面及界面的重要理化作用力，被認(rèn)為是細(xì)菌與宿主間相互作用的因素之一，且與其特異性黏附相關(guān)[14]。本研究通過疏水性細(xì)菌易聚集到水-油界面這一特點，采用二甲苯測定各菌株的疏水性。圖1表明，不同魚源腐敗菌的表面疏水性存在高度差異性，疏水率由弱至強依次為R3-2、MA1-5、R3-1、R3-5、MA1-7、MA1-13，其中希瓦氏菌MA1-13的表面疏水性顯著高于其他菌株，假單胞菌R3-2顯著低于其他菌株。MATH法[19]中菌株疏水率大于50%為高疏水性，小于20%為非疏水性，由此可知魚源腐敗菌MA1-13、MA1-7、R3-5和R3-1為高疏水性菌株，而不存在非疏水性菌株。比較兩屬細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌屬的表面疏水性強于假單胞菌屬。疏水作用的強弱取決于細(xì)菌表面非極性基團的數(shù)量，與菌體表面蛋白、菌毛、莢膜等附著器有關(guān)，因此不同屬細(xì)菌表面疏水性存在差異性。圖2中魚源腐敗菌的自凝聚能力隨著靜置時間的推移而顯著增強，且菌株間自凝聚率具有明顯差異，自凝聚能力由弱至強依次是R3-5、R3-1、R3-2、MA1-5、MA1-7和MA1-13，其中希瓦氏菌MA1-7和MA1-13的自凝聚能力最強，希瓦氏菌MA1-5在靜置1 h時的自凝聚能力較弱，但之后隨著時間的推移，迅速提高。假單胞菌屬的自凝聚能力則明顯弱于希瓦氏菌屬。

圖1 希瓦氏菌和假單胞菌的表面疏水性Fig. 1 Surface hydrophobicity of Shewanella and Pseudomonas

圖2 希瓦氏菌和假單胞菌的自凝聚能力Fig. 2 Auto-aggregation ability of Shewanella and Pseudomonas

細(xì)菌表面疏水性及自凝聚能力兩個指標(biāo)的比較中，希瓦氏菌強于假單胞菌。細(xì)菌黏附分為兩階段，第1階段為聚集和吸附，細(xì)菌接近黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合；第2階段為特異性受體與細(xì)菌發(fā)生特異性結(jié)合過程。細(xì)菌表面性質(zhì)如疏水性和自凝聚能力則在第1階段發(fā)揮作用，有助于細(xì)菌聚集形成生物膜并在宿主表面定植和感染，可以推測希瓦氏菌在魚體黏附能力上將更強于假單胞菌。

2.2 細(xì)菌黏附能力分析

魚源腐敗菌黏附于宿主是其侵襲和致腐的先決條件，細(xì)菌定植后，才可在該部位大量繁殖，產(chǎn)生代謝物或毒素進攻宿主。探究希瓦氏菌和假單胞菌對大黃魚黏液的黏附能力差異，圖3表明不同細(xì)菌的黏附能力不同，對魚體不同部位黏液的黏附能力也顯著不同。就菌株而言，希瓦氏菌MA1-5和MA1-7對各部位的黏附能力均強于其他菌株（P＜0.05），3 株假單胞菌的黏附能力無明顯差異（P＞0.05）。Chen Qiang等[20]表明溶藻弧菌對大黃魚黏液的黏附取決于細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)，不同的黏液成分影響細(xì)菌的黏附作用強弱。細(xì)菌黏附過程由細(xì)菌表面的黏附素和黏液中的特異性受體共同完成，而黏附素包括糖蛋白、脂多糖、外膜蛋白等。因此細(xì)菌對不同黏液的黏附能力具有差異性，與其對黏液的宿主特異性及細(xì)菌自身的黏附素都有關(guān)[8]。從黏液部位分析，細(xì)菌對魚腸黏液的黏附能力顯著低于其對魚鰓黏液和體表黏液的黏附能力（P＜0.05）；不同腐敗菌對魚鰓黏液的黏附能力均強于其他黏液，說明魚鰓是魚在環(huán)境中攜帶細(xì)菌最重要的場所，魚鰓對腐敗菌的黏附可能在魚體腐敗和保鮮中扮演重要的角色。致病弧菌對大黃魚的黏附作用研究中，同樣發(fā)現(xiàn)其對魚鰓黏液有較高的黏附量[1]。

圖3 希瓦氏菌和假單胞菌的黏附能力Fig. 3 Adhesion ability of Shewanella and Pseudomonas

2.3 細(xì)菌生物膜形成能力分析

生物膜是指細(xì)菌黏附于物體或組織表面時形成的含有微菌落及其胞外分泌物的基質(zhì)層，它能增強細(xì)菌對外環(huán)境的抵抗力[21]，因此腐敗菌生物膜形成能力越強，則其抵御能力越強，導(dǎo)致魚體腐敗越嚴(yán)重。通過微孔板法測定各腐敗菌的生物膜形成能力，圖4表明不同腐敗菌形成生物膜的能力顯著不同，希瓦氏菌強于假單胞菌。希瓦氏菌MA1-7是6 株大黃魚源腐敗菌中生物膜形成能力最強的；其次是MA1-5和MA1-13，兩者形成生物膜的能力無顯著差異；而假單胞菌R3-5最弱。結(jié)果表明腐敗菌的黏附能力與成膜能力存在一定的一致性。任真真[22]的研究認(rèn)為以生物膜形成情況可用于評估乳酸菌的黏附能力，這都說明細(xì)菌的生物膜形成能力與其黏附作用息息相關(guān)。

圖4 希瓦氏菌和假單胞菌的生物膜形成能力Fig. 4 Biofilm formation ability of Shewanella and Pseudomonas

2.4 細(xì)菌黏附特性相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

以6 株魚源腐敗菌的表面疏水性、自凝聚能力、黏附能力及生物膜形成能力為因素，用皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示黏附特性與黏附能力之間的相關(guān)性，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析探究希瓦氏菌屬和假單胞菌屬在黏附作用上的差異。

表1 黏附能力與黏附特性間皮爾遜相關(guān)性分析Table 1 Correlation of adhesive ability with adhesive properties using Pearson correlation coefficient

對不同部位黏液黏附能力與黏附特性指標(biāo)進行相關(guān)性分析，通過表1可看出，菌體對魚腸黏附性與自凝聚能力和生物膜形成能力具有較高的相關(guān)性，對體表黏附性只與生物膜形成能力有關(guān)，對魚鰓黏附性與表面疏水性、自凝聚能力和生物膜形成能力都具有一定的相關(guān)性。

圖5 希瓦氏菌和假單胞菌的黏附特性的PCAFig. 5 PCA plot of adhesion characteristics of Shewanella and Pseudomonas

圖5 中F1和F2累計方差貢獻為82.68%，能反映出大部分信息，說明通過PCA可較好地區(qū)分腐希瓦氏菌屬和假單胞屬的黏附能力差異。希瓦氏菌屬細(xì)菌聚集F1軸正坐標(biāo)，假單胞菌屬細(xì)菌F1負(fù)坐標(biāo)，說明假單胞菌和希瓦氏菌在黏附特性上具有顯著差異，可通過4 個指標(biāo)可不同菌屬區(qū)分開。同時，假單胞菌間聚集度高于希瓦氏菌屬，這也表明假單胞菌屬細(xì)菌在黏附特性上具有更多的相似性。

圖6 基于黏附特性的希瓦氏菌和假單胞菌聚類分析Fig. 6 Clustering analysis of adhesion characteristics of Shewanella and Pseudomonas

由聚類分析結(jié)果（圖6）可知，取閾值為6時，細(xì)菌以4 項指標(biāo)可分為3 類，即I類（R3-1、R3-5、R3-2）、II類（MA1-13）、III類（MA1-5、MA1-7）。這說明假單胞菌屬細(xì)菌間的黏附作用相近，希瓦氏菌屬細(xì)菌MA1-5和MA1-7能力相近，而與MA1-13有一定差異。這與PCA有一定相似性，PCA中MA1-13距離MA1-5和MA1-7較遠(yuǎn)，MA1-13表現(xiàn)出更強的表面疏水性，但表面疏水性與黏液黏附性沒有高的相關(guān)性，因此在黏附能力上，較MA1-5和MA1-7弱。

2.5 不同因素對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

2.5.1 培養(yǎng)時間對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖7 培養(yǎng)時間對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 7 Effect of culture time on biofilm formation of Shewanella

由圖7可知，培養(yǎng)時間對魚源腐敗菌形成生物膜有顯著影響。培養(yǎng)6 h時細(xì)菌增長繁殖但還未聚集，而12 h觀察到細(xì)菌開始在培養(yǎng)基表面聚集，生物膜開始形成，呈現(xiàn)易被破壞的細(xì)條狀。12～24 h培養(yǎng)期間，生物膜量逐漸增加；在36 h達(dá)到最大值，并維持至54 h，該階段生物膜形成量無顯著差異；54 h之后生物膜量開始下降，厚度逐漸降低。Stoodley等[23]認(rèn)為生物膜的形成是一個動態(tài)過程，經(jīng)歷形成、成熟和老化3 個階段，Lin Shiqi等[21]則是將形成期再分成初始附著期和早期發(fā)展期。根據(jù)本研究結(jié)果，腐敗菌生物膜的形成可分為形成期0～36 h，成熟期36～54 h，老化期60～72 h。細(xì)菌黏附后，產(chǎn)生的不溶性多糖有助于其群體間的聚集，生物膜三維結(jié)構(gòu)逐漸形成，厚度顯著增加。但進入成熟期后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分消耗，且代謝物累積，菌體生長受到限制；老化期時，生物膜上的細(xì)菌活性降低，胞外多糖量減少，生物膜開始脫落、減少[24-25]。

2.5.2 初始菌濃度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖8 希瓦氏菌初始菌濃度對細(xì)菌生物膜形成的影響Fig. 8 Effect of initial bacterial concentration on biofilm formation of Shewanella

圖8 表明，隨著細(xì)菌初始菌濃度（102～106CFU/mL）的提高，其生物膜形成量顯著增加。但達(dá)到106CFU/mL后，即使?jié)舛仍黾?，生物膜的形成結(jié)果無顯著差異，即濃度達(dá)到一定值后對生物膜形成無顯著影響。細(xì)菌黏附到接觸面后便利用環(huán)境中的營養(yǎng)成分生長繁殖，適當(dāng)?shù)木w濃度可加速生物膜的形成[24]；當(dāng)細(xì)菌增殖達(dá)到一定濃度，環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗完全，細(xì)菌生長被抑制，從而導(dǎo)致生物膜的形成受到抑制。

2.5.3 培養(yǎng)溫度對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖9 培養(yǎng)溫度對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 9 Effect of incubation temperatures on biofilm formation of Shewanella

微生物在適宜溫度下進行生長繁殖和代謝活動，因此細(xì)菌生物膜的形成與培養(yǎng)溫度密切相關(guān)。圖9表明，溫度在4～20 ℃之間時，由于細(xì)菌處于不適宜溫度下，生長緩慢，幾乎不形成生物膜，此期間溫度對成膜無顯著影響（P＞0.05）。而在20～37 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，細(xì)菌生物膜形成量顯著增加，且在37 ℃達(dá)到最大值。37～45 ℃，溫度繼續(xù)升高，生物膜形成量顯著下降，這可能是細(xì)菌不耐受高溫或胞外酶類失活導(dǎo)致。有研究認(rèn)為高溫抑制鞭毛的生成，而鞭毛與生物膜形成有關(guān)[25]。溫度對鰻弧菌[5]、溶藻弧菌[24]等都具有相似的影響。

2.5.4 pH值對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖10 pH值對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 10 Effect of pH valus on biofilm formation of Shewanella

圖10 表明，生長環(huán)境的pH值顯著影響魚源腐敗菌的生物膜形成情況。pH值在3～4時為強酸性環(huán)境，不利于細(xì)菌生物膜的形成，A590nm顯著低于其他組。pH值從4升到7的過程中，酸性逐漸減弱至中性，魚源腐敗菌的生物膜形成能力顯著增強，并在pH 7時達(dá)到最大值。隨后，pH值從8繼續(xù)升高至10，堿性慢慢增強，A590nm迅速減小，即細(xì)菌的生物膜形成量顯著下降。由此猜測在強酸性和強堿性環(huán)境中，魚源腐敗菌的活性可能受到抑制，從而導(dǎo)致生物膜形成能力也受到阻礙。

2.5.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對魚源腐敗菌生物膜形成的影響

圖11 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 11 Effect of of NaCl concentration on biofilm formation of Shewanella

圖11 顯示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對魚源腐敗菌生物膜的形成有顯著影響。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時，希瓦氏菌生物膜的形成量最多，此后隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，生物膜形成量顯著下降。這說明低濃度NaCl會促進希瓦氏菌生物膜的形成，其主要原因是Na+可驅(qū)動端鞭毛的運動，從而促進生物膜的形成[26]，而高濃度NaCl溶液卻抑制細(xì)菌生物膜的形成。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，希瓦氏菌生長速率最大[27]，而本結(jié)果中該質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的生物膜量僅次于最適濃度下的形成量。希瓦氏菌可在較高鹽條件下生長，這可能是其在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%～6%條件下仍可形成生物膜的原因。陸文偉等[28]探究雙歧桿菌生物膜的成膜規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其對氯化鈉、硫酸鎂等離子具有一個最適濃度；副溶血性弧菌在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時形成生物膜能力最強，但當(dāng)其在NaCl和葡萄糖混合溶液中時，其生物膜的形成受葡萄糖濃度的調(diào)控[29]。

2.5.6 不同部位黏液對希瓦氏菌生物膜形成影響

圖12 不同部位黏液對希瓦氏菌生物膜形成的影響Fig. 12 Effect of fish mucus type on biofilm formation of Shewanella

魚源腐敗菌對不同部位大黃魚黏液的黏附能力不同，進一步探究不同部位的黏液對細(xì)菌形成生物膜的影響。如圖12所示，與對照組正常TSB培養(yǎng)基中形成的生物膜量相比，包被黏液后的實驗組生物膜量產(chǎn)生顯著差異。當(dāng)96 孔板包被魚腸黏液和體表黏液后，希瓦氏菌形成的生物膜量低于對照組，但包被魚鰓黏液后，生物膜量顯著高于對照。此部分結(jié)果與菌體對魚體黏液層黏附能力具有對應(yīng)關(guān)系。黏附實驗表明魚源腐敗菌對魚鰓黏液的黏附能力最強，而腐敗菌對魚腸和體表黏液的黏附能力較弱。黏液層是生物體防御機制的重要組成部分，體表和魚腸黏液可能含有某些抑菌成分，在一定程度上抑制細(xì)菌繁殖、分泌胞外多糖等，從而降低生物膜的形成量。由此可以推測，魚體表和魚腸黏液可能存在某些因素，抑制腐敗菌的黏附與生物膜的滋生。

3 結(jié) 論

希瓦氏菌屬比假單胞菌屬具有更強的對海水魚體黏液的黏附能力，同時具有很好的生物膜形成能力。黏附能力與自凝聚能力和生物膜形成能力有較高的相關(guān)性。希瓦氏菌的生物膜形成受初始菌濃度、培養(yǎng)時間、溫度、pH值、鹽含量等多種環(huán)境因素影響。希瓦氏菌在初始菌濃度大于106CFU/mL、37 ℃、pH 7～8、0.8% NaCl時形成的生物膜量最多；生物膜在12～24 h期間快速形成，并在36 h達(dá)到峰值后，隨培養(yǎng)時間延長而逐漸下降。大黃魚黏液對腐敗菌的黏附和成膜都具有一定程度的影響，魚腸黏液對菌體的黏附性最小，對生物膜形成具有抑制作用，而魚鰓黏液對菌體的黏附性最高，對生物膜形成具有促進作用。希瓦氏菌和假單胞菌是常見的魚體腐敗菌，但不同水域、不同種類的魚體中特定腐敗菌種類不同、比例不同。深入了解腐敗菌在魚體的黏附、定植、成膜，并取得腐敗優(yōu)勢的成因，是解釋魚體腐敗機理的一個重要途徑。