超聲處理提高米糠蛋白溶解性與乳化性的工藝研究

孫靖辰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

0 引言

米糠中蛋白質(zhì)含量12%～16%[1]，其必需氨基酸組成合理，與FAO/WHO推薦標準相似，可作為特殊人群的優(yōu)質(zhì)植物蛋白食品。由于溶解性的差異，米糠蛋白又可分為鹽溶性的球蛋白、溶于70%乙醇的醇溶蛋白、堿溶性的谷蛋白和水溶性的清蛋白4種蛋白質(zhì)[2]。米糠中有70%左右的可溶性蛋白質(zhì)，這與大豆蛋白相近[3]。在米糠蛋白中清蛋白溶解性好、消化吸收率高且必需氨基酸組成合理，故可直接參與組織代謝；而谷蛋白和醇溶蛋白營養(yǎng)價值較低，但是由于彈性和韌性較好，因此面食產(chǎn)品的品質(zhì)可用其進行改善[4]。

溶解特性是米糠蛋白功能性最重要的判定指標[5]，是決定米糠蛋白在生產(chǎn)實踐中應用的重要體現(xiàn)，米糠蛋白溶解性的高低直接決定了蛋白的乳化、起泡和凝膠等功能特性[6]。蛋白的電荷分布、粒徑大小、疏水與親水的比例，以及pH值、溫度和離子強度等因素都會對蛋白的溶解特性產(chǎn)生影響。由于米糠蛋白是堿溶性的蛋白質(zhì)，在pH值4.0～4.5時蛋白的溶解性最低；隨著pH值的增大，其蛋白的溶解性越來越高，溶解性可達到75%[7]。采用酶法對米糠蛋白進行處理，其蛋白的溶解度明顯提高，且當控制好水解度時，米糠蛋白的溶解度可達到最大值91.83%[8]。乳化性屬于蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)，它是蛋白在油水界面上形成連續(xù)相的能力[9]。而影響蛋白乳化性最關鍵的因素就是其表面疏水性[10]。另外，米糠蛋白的乳化性還受pH值、堿性蛋白酶、溫度等因素的影響[11]。

超聲作用能破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構，使分子間發(fā)生解離和聚合，生成小分子的亞基和肽且加速反應的進行，并暴露出了蛋白質(zhì)分子中的親水和疏水基團[12]，進而改善了蛋白的功能特性[13]。國內(nèi)外利用超聲處理方法主要研究的是對物料的物理性質(zhì)及其蛋白功能性質(zhì)的影響[14]。但利用超聲處理方法對米糠蛋白溶解性和乳化性功能性質(zhì)深入影響的研究還鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

米糠，取自黑龍江省農(nóng)墾總局查哈陽農(nóng)場。米糠蛋白：將新鮮的米糠粉碎過60目篩后加入5倍體積的正己烷，于室溫下攪拌2 h，以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心15 min，重復上述操作，收集沉淀、干燥；將干燥脫脂米糠收集過篩置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；向脫脂米糠中加?0倍體積的蒸餾水，調(diào)pH值至9.0后在45℃下攪拌2 h，以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心20 min，收集上清液；沉淀重復操作并合并上清液，調(diào)至等電點pH值4.5后置于室溫下攪拌30 min；在4℃下靜置4 h，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，沉淀復溶、透析、冷凍干燥制得米糠蛋白粉末，純度可達72.4%。

1.2 試劑及儀器

氫氧化鈉、鹽酸等（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；考馬斯亮藍（分析純），上海源葉試劑有限公司提供；磷酸，北京化學試劑研究所提供；結(jié)晶牛血清蛋白（生物試劑），北京華夏遠洋科技有限公司提供。

KS-JY92-IL型超聲波細胞破碎機，河南兄弟儀器設備有限公司產(chǎn)品；FJ300-S型高速分散均質(zhì)機，北京鑫骉騰達儀器設備有限公司產(chǎn)品；UV-2100型紫外可見分光光度計，上海精科天美儀器有限公司產(chǎn)品；LGR10-4.2型高速冷凍離心機，北京眾益中和生物技術有限公司產(chǎn)品；SY-601型超級恒溫水浴鍋，常州市國旺儀器制造有限公司產(chǎn)品；pH測試儀，美國梅特勒-托利多公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲處理米糠蛋白的試驗方法

（1）工藝流程。米糠蛋白→超聲處理→離心→上清液→溶解性、乳化性的測定。量取一定量米糠蛋白溶于水中配成懸浮液，設定超聲功率、超聲時間、米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)與超聲溫度進行單因素試驗，超聲改性后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，然后經(jīng)冷凍干燥，保存樣品。

（2）蛋白質(zhì)含量的測定。采用考馬斯亮藍法對提取液中蛋白含量進行測定；采用國標凱氏定氮法（GB 5009.5—2010） 對原料中蛋白含量進行測定，蛋白質(zhì)系數(shù)為5.95。

（4） 乳化性的測定。根據(jù)Pearce和Kinsella[14]的方法進行，稍加改進。配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL樣品溶液（溶于10 mmol/L pH值7.0磷酸緩沖溶液中），取大豆油和上述蛋白溶液（1∶3，V/V），置于高速均質(zhì)機中以轉(zhuǎn)速24 000 r/min均質(zhì)1 min，分別在0，10 min時，從測試管底部取樣50 μL，用0.1%（W/V）SDS稀釋100倍，于波長500 nm處測定吸光度，記為A500，以SDS溶液為空白。乳化性指數(shù)（EAI，m2/g） 的計算公式如下：

（3）溶解度的測定。準確稱取米糠蛋白樣品2.50 g，加入到溫度25℃，pH值7.0，濃度為0.05 mol的100 mL磷酸鹽緩沖液中攪拌1 h，并以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心20 min，上清液的蛋白含量采用雙縮脲法進行測定。

按下式計算溶解性：

式中：DF——稀釋倍數(shù)，100；

C——蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；

φ——比色皿光程，1 cm；

θ——乳液中油相所占比例，0.25；

A0——0 min時的吸光度；

A10——10 min時的吸光度。

（5）持水性的測定。準確稱取0.500 g米糠蛋白樣品于離心管中，加入5 mL蒸餾水并用玻璃棒將樣品攪勻，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min后棄去上清液，稱量此時離心管的質(zhì)量。

（6）持油性的測定。準確稱取0.500 g米糠蛋白樣品于10 mL帶刻度的離心管中，加入5 mL食用油并經(jīng)漩渦振蕩混合均勻后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，除去上層油，稱量此時離心管的質(zhì)量。

（7） 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定。取1%的米糠蛋白溶液100 mL加入到250 mL燒杯中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min于高速分散器中分散2 min后迅速移入250 mL量筒中。起泡性按下式計算：

式中：V0——分散停止時液體與泡沫的總體積，mL；

100——原液的體積，mL。

泡沫穩(wěn)定性測定：將發(fā)泡后的泡沫靜置30 min，泡沫穩(wěn)定性按下式計算：

式中：V30——靜置30 min后液體與泡沫的總體積，mL。

（8）凝膠性的測定。凝膠的制備：分別將3種物理預處理后的蛋白樣品溶于去離子水中，攪拌均勻（質(zhì)量分數(shù)為12%）后將此蛋白質(zhì)溶液倒入100 mL燒杯中，將燒杯上用鋁箔加蓋于80℃的水浴中恒溫保存30 min，用冰浴冷卻至室溫后置4℃的冰箱保存24 h，然后取出陳化30 min測定其凝膠強度。

采用物性測試儀測定其凝膠強度，設置沖壓速度2 mm/s，沖壓深度10 mm，每個樣品抽取不同部位3次測量后取平均值。

（9）黏度的測定。參考丁金龍的方法分別配制質(zhì)量濃度為10 g/L的米糠濃縮蛋白溶液，并在30℃水浴中采用數(shù)顯黏度計進行測定。

（10）分散性的測定。將蛋白粉以相同攪拌速度分散于20 mL水中，并觀察、記錄樣品完全分散所需要的時間。

（11）超聲改性處理工藝條件的優(yōu)化。①米糠蛋白溶解性及乳化性受米糠蛋白濃度的影響。超聲功率200 W，超聲溫度40℃，超聲時間10 min的試驗條件下，考查米糠蛋白溶解性及乳化性受米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)1%，2%，3%，4%，5%的影響。②米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲功率的影響。米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲溫度40℃，超聲時間10 min，考查米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲功率0，100，200，300，400 W的影響。③米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲時間的影響。超聲功率200 W，米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲溫度40℃，考查米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲處理時間0，5，10，15，20 min的影響。④米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲溫度的影響。超聲功率200 W，米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲時間10 min，考查米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲處理溫度20，30，40，50，60℃的影響。⑤響應面優(yōu)化超聲處理工藝的最佳參數(shù)。根據(jù)單因素的研究確定各因素的水平值范圍，并采用響應面試驗設計，以米糠蛋白溶解性和乳化性為響應值，以超聲功率、米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)、超聲溫度和超聲時間為自變量，對米糠蛋白改性工藝的最佳參數(shù)進行優(yōu)化。

Box-Behnken試驗因素水平見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0，Design Expert軟件進行統(tǒng)計分析，使用Origin8.6繪制圖表。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理提高米糠蛋白溶解性與乳化性工藝研究

2.1.1 米糠蛋白溶解性及乳化性受米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響

米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響見圖1。

圖1 米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響

由圖1可知，隨著米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)的上升米糠蛋白的溶解度呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。當米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)達到3%時溶解度達最大值。米糠蛋白的乳化性隨著米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)達到3%時，乳化性達最大值。

2.1.2 米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲功率的影響

超聲功率對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響見圖2。

圖2 超聲功率對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響

由圖2可知，隨著超聲功率的不斷增加，米糠蛋白的溶解度呈現(xiàn)顯著上升趨勢，當超聲功率達到200 W時，溶解度達到最大值；當超聲功率大于200 W時，溶解度趨于穩(wěn)定。產(chǎn)生以上變化是由于超聲波的空化作用改變了米糠蛋白的結(jié)構，從而提高了蛋白的溶解度。故選擇200 W的超聲功率對米糠蛋白的溶解性研究最合適。

2.1.3 米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲時間的影響

超聲時間對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響見圖3。

圖3 超聲時間對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響

由圖3可知，米糠蛋白的溶解度隨著超聲時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當超聲時間10 min時，溶解度達到最大值。最終結(jié)果顯示，超聲時間10 min時可提高米糠蛋白的溶解度和乳化性。

2.1.4 米糠蛋白溶解性及乳化性受超聲溫度的影響

超聲溫度對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對米糠蛋白溶解性與乳化性的影響

由圖4可知，隨著超聲溫度從20℃上升到40℃，米糠蛋白的溶解度變化不大；當超聲溫度達到40℃時，米糠蛋白的溶解度達到最大值。之后隨著超聲溫度的提高米糠蛋白的溶解度迅速下降。超聲溫度從20℃上升到40℃期間，隨著超聲溫度的逐漸上升米糠蛋白的乳化性呈顯著上升趨勢；而當超聲溫度達40℃時，蛋白乳化性達最大值0.83 m2/g；當超聲溫度超過40℃時，乳化性呈顯著下降趨勢。

2.1.5 響應面結(jié)果分析與優(yōu)化

采用Design Expert軟件對單因素試驗結(jié)果進行優(yōu)化。以米糠蛋白溶解度R1（%）、乳化性R2（m2/g）為響應值，選擇米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C） 和超聲溫度（D） 為影響因素，設計四因素三水平的二次回歸方程，確定擬合因素和指標之間的函數(shù)關系及最優(yōu)處理工藝參數(shù)。

試驗方案及結(jié)果見表2。

由表2可知，利用響應曲面法對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到以溶解度（R1）為響應值，選擇米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）和超聲溫度（D） 為影響因素的二次多項回歸預測模型方程為：

表2 試驗方案及結(jié)果

模型方程利用Design Expert軟件進行方差分析。

回歸與方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，響應面優(yōu)化擬合出的方程回歸項及各因素二次項對響應值均為極顯著影響（p＜0.01），且失擬項0.058 4＞0.05，擬合模型方程的均方值R2=0.989 4，R2Adj=0.978 9。因此，上述指標證明該模型方程用于研究的試驗擬合是可行的。通過F值檢驗可得到4個因素對溶解度影響的主次關系為B＞C＞A=D，即超聲功率＞超聲時間＞米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)=超聲溫度。

因子間交互作用對溶解度影響的響應面圖見圖5。

由圖5可知，應用響應面尋優(yōu)分析方法對R1回歸模型進行描述，選取米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C） 和超聲溫度（D）對應的編碼值分別為0.011，0.019，-0.006，0.001，所對應最優(yōu)工藝參數(shù)為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3.01%，超聲功率201.91 W，超聲時間9.97 min，超聲溫度40.01℃，此條件下米糠蛋白的溶解度為64.09%。但考慮實際的操作情況，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲功率202 W，超聲時間10 min，超聲溫度40℃。

表3 回歸與方差分析結(jié)果

利用DesignExpert軟件中響應面對乳化性（R2）試驗數(shù)據(jù)及結(jié)果進行分析，建立回歸預測模型如下：

模型方程利用Design Expert軟件進行方差分析。

回歸與方差分析結(jié)果見表4。

表4 回歸與方差分析結(jié)果

由表4可知，響應面優(yōu)化擬合出的方程回歸項及各因素二次項對響應值均為極顯著影響（p＜0.01），且失擬項0.998 6＞0.05。而擬合模型方程的均方值R2=0.998 4，證明99.84%數(shù)據(jù)的響應變化可用建立的模型來解釋，擬合程度較好。故可應用此方程對響應值進行預測。因此，上述指標可證明該模型方程用于試驗擬合是可行的。通過F值檢驗可得到4個因素對乳化性影響的主次關系為A＞D＞C＞B，即米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)＞超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率。

圖5 因子間交互作用對溶解度影響的響應面圖

利用Design Expert軟件繪制響應面曲線圖。

因子間交互作用對乳化性影響的響應面見圖6。

由圖6可知，應用響應面尋優(yōu)分析方法對R2回歸模型進行描述，選取米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）對應的編碼值分別為-0.007，-0.003，-0.011，0.040，所對應最優(yōu)工藝參數(shù)為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)2.99%，超聲功率199.74 W，超聲時間9.94 min，超聲溫度40.40℃，此條件下米糠蛋白的乳化性為0.82 m2/g。但考慮實際的操作情況，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲功率200 W，超聲時間10 min，超聲溫度40℃。

為同時獲取最佳乳化性及溶解度，采用聯(lián)合求解法確定最佳工藝條件為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3.00%，超聲功率200.54 W，超聲時間9.96 min，超聲溫度40.05℃，為適應實際生產(chǎn)需求，將上述指標優(yōu)化為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲功率201 W，超聲時間10 min，超聲溫度40℃。利用探尋的最優(yōu)處理工藝進行3次重復驗證試驗，得到溶解度平均值為64.30%，乳化性為0.85 m2/g，該值與理論值接近程度較高，證明預測模型準確。

圖6 因子間交互作用對乳化性影響的響應面圖

2.1.6 最優(yōu)超聲處理工藝下的米糠蛋白的提取率

從上述分析得到了經(jīng)超聲處理提高米糠蛋白溶解性和乳化性的最優(yōu)處理工藝，可知米糠蛋白的溶解性和乳化性經(jīng)超聲處理后均有顯著提高。然后在這個最佳超聲處理工藝的基礎上又研究了米糠蛋白的提取率，結(jié)果顯示，經(jīng)研究在這個最佳超聲處理工藝下米糠蛋白的提取率為47.83%，而未經(jīng)改性處理的米糠蛋白的提取率為38.72%，相比之下經(jīng)超聲處理的蛋白提取率提高了23.53%。

3 結(jié)論

利用響應曲面法對超聲處理工藝參數(shù)進行優(yōu)化，為同時獲取最佳溶解度和乳化性，采用聯(lián)合求解法確定處理米糠蛋白工藝條件為米糠蛋白質(zhì)量分數(shù)3%，超聲功率201 W，超聲時間10 min，超聲溫度40℃，在此處理工藝條件下，米糠蛋白溶解度為64.30%，乳化性為0.85 m2/g。該試驗結(jié)果可為今后米糠蛋白在食品領域中的應用提供理論參考。

通過對比經(jīng)超聲處理的米糠蛋白與未經(jīng)超聲處理的米糠蛋白的溶解性、乳化性、持水性、持油性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、凝膠性、黏度、分散性等功能特性。結(jié)果表明，經(jīng)過超聲處理制備的米糠蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、凝膠性、持油性都要高于對照組，而持水性、黏度和分散性均低于對照組。故利用超聲處理方法可定向提高米糠蛋白的功能特性，進而滿足生產(chǎn)上的需求。