蒲公英內(nèi)生真菌分離純化及其形態(tài)學(xué)鑒定

趙 秋，丁海娥，黨苗苗，陳 思，張道順，從炳超

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124）

0 引言

近年來，已經(jīng)成為生物制藥有效途徑之一的是將生物活性成分從天然產(chǎn)物中提取出來[1-2]。挑選天然藥物最主要的原料一直以植物為主，但用于藥用的植物中活性物質(zhì)在其組織中含量一般很低，如果為了自身利益，人們一直過度使用野生藥用植物資源，該物種就會瀕危直至滅絕，這樣就會使環(huán)境遭到破壞，還會破壞生物多樣性。為了解決環(huán)境資源問題，近年來，研究了野生藥用植物的熱點，重點是藥用植物的內(nèi)生真菌。其內(nèi)生真菌的研究始于19世紀(jì)后期，國內(nèi)對內(nèi)生真菌的研究才剛剛開始[3-4]。到20世紀(jì)90年代中期，研究內(nèi)容僅限于對植物中某些內(nèi)生真菌的研究[5]。利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)藥理成分可以為尋找天然藥物資源和保護(hù)植物資源提供新途徑[6-7]。

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand-Mazz），是多年生草本植物。根部呈圓錐形，表面呈棕色，萎縮，葉片邊緣有時呈波浪狀或羽狀，基部逐漸變窄為葉柄，葉柄和主脈通常呈紅紫色，花萼上部為紫紅色，密布在蜘蛛絲上。白色具長柔毛；花頭呈鐘形，瘦果深褐色，長冠毛白色，開花期4月至翌年10月。蒲公英主要含有的化學(xué)成分包括黃酮類、三萜類化合物、倍半萜烯內(nèi)酯類、色素類、揮發(fā)油類和植物甾醇類，具有清熱解毒、利尿通淋、消腫散等多種功能[8]。

內(nèi)生真菌，在學(xué)術(shù)界沒有一個準(zhǔn)確的定義。內(nèi)生菌的最早概念是指通過區(qū)分生活在植物表面的一些附生植物來生活在植物中的微生物。內(nèi)生真菌是指宿主植物在某一階段或生命的所有階段都不會表現(xiàn)出外部疾病癥狀并生活在健康植物組織或器官中的微生物。研究表明，內(nèi)生真菌的祖先可能是植物病原體，長期存在于植物組織中，與寄主植物“共同進(jìn)化”，因此在此過程中，形成的代謝物可能與宿主植物相同或相似。許多物質(zhì)都有多種活性。內(nèi)生真菌，從不同植物中分離純化出來，其種類數(shù)目不同，少的有幾種到十幾種，多的有幾百種。通過對蒲公英內(nèi)生真菌的培養(yǎng)、純化和鑒定，為將藥用微生物資源更好地開發(fā)奠定堅實基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試驗所用植物的材料來源

蒲公英取自西北民族大學(xué)格物1號樓正前方玫瑰園內(nèi)，由試驗指導(dǎo)教師郭俊珍鑒定。

1.2 儀器

ISO 9001型電子分析天平，北京賽多利斯儀器公司產(chǎn)品；VS-1300-U型超凈工作臺，蘇州止痙凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPX-100B-Z型生化恒溫培養(yǎng)箱、MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司產(chǎn)品；FT-101A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科威永興儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 玻璃儀器

量筒、玻璃棒、燒杯、培養(yǎng)皿、錐形瓶等。

1.4 藥品與試劑

75%酒精，山東利爾康消毒科技有限公司提供；升汞0.1%（分析純），北京化工廠提供；葡萄糖（分析純），上海化學(xué)試劑廠提供；瓊脂粉，上海山浦化工集團(tuán)提供；注射用青霉素鈉（80萬U）、注射用硫酸鏈霉素（100萬U），華北制藥集團(tuán)提供。

1.5 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

2 試驗方法

2.1 制作培養(yǎng)基

稱取土豆200 g，經(jīng)清潔、去皮后切成塊，用蒸餾水煮沸，紗布折疊成8層，然后過濾，加入20 g葡萄糖，并加入20 g瓊脂。化妝用1 L量筒至1 000 mL和分配到3個錐形瓶中，然后用高壓蒸汽鍋滅菌。除菌后，將介質(zhì)的溫度降低至約55℃，并加入青霉素鈉的80×104U和100×104U硫酸鏈霉素去除內(nèi)生細(xì)菌。倒30個平板，放置于超凈臺內(nèi)，等待接種。

2.2 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

選擇沒有害蟲和傷口的新鮮蒲公英并用無菌水沖洗。在超潔凈平臺上，采用組織切割法采集植物的莖、葉和根，用手術(shù)刀將蒲公英的莖和根切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，0.5 cm×0.5 cm的小塊。將切割的材料置于乙醇中2，4 min，并比較消毒時間。將混合物用蒸餾水洗滌3次，然后將該材料置于浸有汞的溶液中浸泡2 min，用蒸餾水沖洗3次，并置于無菌濾紙上。吸去水后，將其分別置于含有硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基上，在各板上放置4片，密封膜，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d。

另在一個平板內(nèi)倒入無菌水，與上述平板一起放入培養(yǎng)箱中，觀察是否有細(xì)菌長出，作為無菌參照。

2.3 分離與純化

菌落出現(xiàn)在切口。根據(jù)菌落形態(tài)、色差和生長時間，挑取每個菌落的邊緣菌絲并轉(zhuǎn)移到分離培養(yǎng)基平板進(jìn)行再培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)天后，觀察并記錄菌落的形態(tài)。

在最后一次沖洗后，取少量表面消毒的無菌水，將其涂于含有硫酸鏈霉素（100 U/mL） 和青霉素鈉（80 U/mL）的分離介質(zhì)上，并在30℃下孵育。觀察是否有任何真菌長出作為無菌處理的參考。

將獲得的菌株反復(fù)純化并培養(yǎng)。菌株編號后，將其轉(zhuǎn)移到PDA傾斜培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，并貯存在4℃冰箱中。

3 結(jié)果與分析

3.1 蒲公英內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

從新鮮蒲公英根部、莖部、葉部分離獲得14株內(nèi)生真菌，分別編號PY-1～PY-14。

純化菌落PY-1見圖1，純化菌落PY-2見圖2，純化菌落PY-3見圖3，純化菌落PY-4見圖4，純化菌落PY-5見圖5，純化菌落PY-6見圖6，純化菌落PY-7見圖7，純化菌落PY-8見圖8，純化菌落PY-9見圖9，純化菌落PY-10見圖10，純化菌落PY-11見圖11，純化菌落PY-12見圖12，純化菌落PY-13見圖13，純化菌落PY-14見圖14。

3.2 蒲公英內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)觀察及初步鑒定

從蒲公英內(nèi)分離得到的內(nèi)生真菌，菌落形式豐富多樣，菌絲形態(tài)也不同，有絨、粉、絮狀、顆粒等。每個菌落的顏色和色素沉著也有各自的特點。沒有產(chǎn)生色素的細(xì)菌和產(chǎn)生色素的細(xì)菌；有常見的菌落顏色，如白色和黑色，以及深綠色、亮黃色、灰綠色、粉紅色等；邊緣整齊和爬壁菌絲，進(jìn)一步表明內(nèi)生真菌物種的多樣性。

所分離內(nèi)生真菌菌株編號及初步形態(tài)學(xué)觀察見表1。

4 結(jié)論

作為微生物資源的植物內(nèi)生微生物，較普遍地存在于植物中。與通常的微生物相比，植物內(nèi)生微生物對植物表現(xiàn)出一定的親和力。植物又是內(nèi)生微生物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，植物生產(chǎn)極大地關(guān)系到社會的繁榮和發(fā)展。因此，植物內(nèi)生微生物研究、資源的積累及其操作技術(shù)和利用技術(shù)的研究有著重要意義[9]。

圖1 純化菌落PY-1

圖2 純化菌落PY-2

圖3 純化菌落PY-3

圖4 純化菌落PY-4

圖5 純化菌落PY-5

圖6 純化菌落PY-6

圖9 純化菌落PY-9

圖10 純化菌落PY-10

圖11 純化菌落PY-11

圖12 純化菌落PY-12

圖13 純化菌落PY-13

圖14 純化菌落PY-14

表1 所分離內(nèi)生真菌菌株編號及初步形態(tài)學(xué)觀察

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）用作試驗的培養(yǎng)基。使用組織切割方法，組織塊消毒時間的平行試驗在試驗期間進(jìn)行，用酒精消毒的時間為1，2，3，4 min。結(jié)果表明，酒精最適消毒時間為2 min，接種消毒1 min組織的培養(yǎng)基上長有雜菌，接種消毒3 min組織的培養(yǎng)基內(nèi)生真菌基本不生長，接種消毒4 min組織的培養(yǎng)基不生長內(nèi)生真菌；用于消毒和沖洗材料的無菌水被電鍍和培養(yǎng)；如果板上沒有長細(xì)菌，則表面消毒相對徹底；有14株內(nèi)生真菌從蒲公英中分離純化出來。

據(jù)觀察，大多數(shù)組織塊在3 d在組織切割切口處生長了菌絲體，并且應(yīng)該是組織中的主要菌株；有些菌株直到6 d才出現(xiàn)甚至更長時間。這些菌株的生長速度也相對較慢。而且，根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)不同植物組織中內(nèi)生真菌的種類不同，生長速度都不盡相同。

此研究與其他類似研究相比，在蒲公英根系和莖內(nèi)分離出菌種數(shù)量較多，形態(tài)各異，菌種多樣性和特殊性大于其他類似研究的成果。藥用植物組織中存在著多樣的菌落特征和豐富的色澤，不同植物組織內(nèi)的真菌的種類和數(shù)量不同，藥用植物蒲公英組織的內(nèi)生真菌也不同。多種次級代謝產(chǎn)物由內(nèi)生真菌產(chǎn)生，這些次級代謝產(chǎn)物能夠用于很多新藥的研發(fā)，對下一步的菌種形態(tài)學(xué)和生理生化功能鑒定等試驗提供了基礎(chǔ)。