超聲提取/氣相色譜法檢測食用檳榔中的甜蜜素

肖曉義，夏延斌，袁 河，趙志友

（1.湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心，湖南賓之郎食品科技有限公司，湖南湘潭 411201；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙 410128）

檳榔含有多種人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，如脂肪、檳榔油、生物堿等成分[1]，其性味苦、辛、溫，具有殺蟲、消積等功能[2]，可藥用也可食用。在我國，檳榔擁有巨大的市場，僅湖南地區(qū)產(chǎn)值就已達(dá)到40億～50億元[3]。消費(fèi)者對檳榔的口感、口味有一定要求，甜度是影響檳榔口感的重要指標(biāo)之一。甜蜜素（C6H11NH2）化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種人工合成的非營養(yǎng)型低熱能甜味劑，其甜度為蔗糖的30～50倍，且價(jià)格低廉、后苦味小，因此被廣泛用于食品加工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[4-6]。但有研究表明甜蜜素不被人體吸收而且會加重人體肝臟負(fù)擔(dān)，對腎臟有毒副作用，并具有潛在致癌性[7-9]，因此在實(shí)際過程中要嚴(yán)格把控甜蜜素的添加量。國家制定相關(guān)的甜蜜素檢測標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5009.97—2003），該標(biāo)準(zhǔn)中甜蜜素的檢測方法包含填充柱氣相色譜法、比色法、薄層層析法[8-10]。氣相色譜法測定甜蜜素時通常以環(huán)己醇亞硝酸脂作為定量依據(jù)[11-12]，但甜蜜素和亞硝酸鈉在硫酸存在時會生成環(huán)己醇，環(huán)己醇可與亞硝酸鈉發(fā)生酯化反應(yīng)生成環(huán)己醇亞硝酸酯，此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，環(huán)己醇不能完全轉(zhuǎn)換為環(huán)己醇亞硝酸酯，而2種產(chǎn)物之間的峰面積之和一定，因此可以通過2種產(chǎn)物的峰面積之和進(jìn)行定量分析[13-14]。

通過峰面積加和的定量方法并結(jié)合超聲提取，建立了從檳榔中檢測甜蜜素的方法，并通過正交試驗(yàn)篩選出最佳提取工藝，該方法準(zhǔn)確度高，精密度、分離度良好，可以滿足檳榔中的甜蜜素檢測。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

市售食用檳榔。

1.2 試劑

甜蜜素（標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司提供；正己烷、氯化鈉、亞硝酸鈉溶液、硫酸溶液。以上試劑均為分析純。

1.3 儀器

Agilent GC7890B型氣相色譜，配FID檢測器，美國安捷倫公司產(chǎn)品；SHZ-82型恒溫水浴振蕩器，常州市中貝儀器有限公司產(chǎn)品；AR224CN型分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；ZWSH-250型超純水機(jī)，湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍加邢薰井a(chǎn)品；KQ-700E型超聲波清洗機(jī)，昆山美美超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口：加熱器溫度220℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比5∶1；載氣N2，流量40 mL/min；柱箱溫度：恒溫70℃；FID檢測器：溫度250℃，氫氣流量47 mL/min，空氣流量400 mL/min，氮?dú)饬髁?0 mL/min。

2.2 樣品前處理

選取5顆大小、形狀、紋路近似的檳榔，切碎混勻，取2～3 g樣品置于50 mL錐形瓶中，以超純水為提取溶劑，采用超聲的方法提取檳榔中甜蜜素，樣品經(jīng)超聲提取后冷卻至室溫，取1 mL提取液置于100 mL具塞比色管中，依次加入15 mL超純水、5 mL 50 g/L亞硝酸鈉溶液和100 g/L硫酸溶液，冰浴，以轉(zhuǎn)速80 r/min振搖30 min后，加入5 g氯化鈉，10 mL正己烷，振搖100次，靜置分層，取上層正己烷適量注入氣相色譜儀中進(jìn)行測定，每個樣品平行3份。

2.3 單因素及正交試驗(yàn)

稱取檳榔碎塊9份，每份2.0 g，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以甜蜜素提取率為指標(biāo)，考查料液比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）3個因素對甜蜜素提取率的影響。

正交提取試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素考查

表1 正交提取試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

3.1.1 超聲時間對甜蜜素提取率的影響

超聲時間對甜蜜素提取率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對甜蜜素提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，甜蜜素提取率逐漸升高，但在60 min后甜蜜素提取率隨著超聲時間的延長而降低，這可能是因?yàn)槌暡ㄗ饔脮r間過長破壞了甜蜜素分子結(jié)構(gòu)所致。因此選取超聲時間45，60，75 min 3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.2 提取溫度對甜蜜素提取率的影響

提取溫度對甜蜜素提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對甜蜜素提取率的影響

由圖2可知，提取溫度低于70℃時，提取溫度越高，甜蜜素提取率越高。提取溫度高于70℃后，甜蜜素提取率下降。造成這種現(xiàn)象的原因可能是在低溫時，隨著溫度的升高，分子運(yùn)動加快，使得甜蜜素從檳榔中充分釋放；當(dāng)溫度高于70℃后，超聲波與高溫的協(xié)同作用使得甜蜜素分子破壞降解，導(dǎo)致提取所得甜蜜素含量降低。因此選取提取溫度50，60，70℃3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.3 料液比對甜蜜素提取率的影響

料液比對甜蜜素提取率的影響見圖3。

由圖3可知，對比料液比1∶5與1∶10，前者的甜蜜素提取率遠(yuǎn)低于后者，料液比在1∶10后，甜蜜素提取率幾乎沒有變化。可以判斷料液比1∶10可溶解檳榔中大部分甜蜜素，所以繼續(xù)增大料液比對甜蜜素含量幾乎沒有變化。因此，綜合考慮選用料液比1∶10，1∶15，1∶20 3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 料液比對甜蜜素提取率的影響

3.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果如下，結(jié)果表明，影響甜蜜素提取的主次因素為A＞B＞C，即料液比＞提取溫度＞超聲時間。其中，料液比與提取溫度達(dá)到顯著水平，其最佳提取工藝為A2B2C2，即料液比1∶15，提取溫度60℃，超聲時間60 min。

正交提取試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析見表2。

表2 正交提取試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

3.3 方法學(xué)考查

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限的測定

精確稱取20.0 mg甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；將儲備液以正己烷稀釋成質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0，1.4，1.6，1.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，將甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)使用液注入氣相色譜儀，測定其峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

由圖4可知，在0.2～1.8 mg/mL線性范圍內(nèi)良好，回歸方程為Y=116.967 2X-2.811 2，R2=0.999 1。對質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析5次，根據(jù)其3倍噪聲值（S/N=3） 計(jì)算出檢測限為13.99 μg/mL。

圖4 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 準(zhǔn)確度與精密度

經(jīng)檢測，正己烷空白溶劑中未檢出甜蜜素，向正己烷空白溶劑中分別加入質(zhì)量濃度0.5，1.0，1.5 mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混合均勻。通過測定正己烷空白溶劑加標(biāo)后的甜蜜素質(zhì)量濃度，計(jì)算實(shí)際樣品的回收率。

甜蜜素加標(biāo)回收率的測定見表3。

表3 甜蜜素加標(biāo)回收率的測定

由表3可知，該方法對甜蜜素的加標(biāo)回收率為98.0%～100.6%。

連續(xù)采用該方法對同一個樣品測定6次，測量其平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

精密度結(jié)果的測定見表4。

表4 精密度結(jié)果的測定

由表4可知，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值均小于5%，能滿足分析化學(xué)的要求。

3.4 樣品檢測

試驗(yàn)在湘潭市隨機(jī)購買的5種不同品牌樣品按照2.2所述處理后，以提取溫度60℃，超聲時間60 min，料液比1∶15進(jìn)行提取，經(jīng)氣相色譜儀分析。

檳榔甜蜜素含量抽樣檢測結(jié)果見表5。

表5 檳榔甜蜜素含量抽樣檢測結(jié)果

以上5種品牌檳榔中的甜蜜素檢出量分別為7.89，7.79，7.62，6.42，7.81 g/kg，沒有超過國家標(biāo)準(zhǔn)中8 g/kg 的使用量[15]。

4 結(jié)論

采用超聲提取/氣相色譜法測定檳榔中甜蜜素的含量，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝為提取溫度60℃，超聲時間30 min，料液比1∶15（mg∶mL）。同時，使用HP-5毛細(xì)管柱管對樣品中的甜蜜素進(jìn)行了分離，用組校準(zhǔn)的方法對樣品進(jìn)行了定量分析。測定檳榔中甜蜜素的方法，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、甜蜜素峰形好、線性范圍廣、良好的準(zhǔn)確度和精確度，重復(fù)性、再現(xiàn)性好，可以滿足檳榔中甜蜜素含量的檢測，在檳榔行業(yè)中具有推廣意義。