響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取山竹果皮中原花青素的研究

龔玉石，侯方麗，郭 娟，黎英權(quán)

（廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006）

山竹（Garcinia mangostana L.），別名鳳果、倒捻子，這種水果原產(chǎn)于馬來(lái)群島。其果肉中含有人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)，果皮占單果鮮質(zhì)量的52%～68%，總體呈紫褐色[1]，其在化工、醫(yī)藥、食品等許多領(lǐng)域得到了運(yùn)用，主要由于山竹含有原花青素、花色苷和氧雜蒽酮等多種活性成分，具有抗癌、抗氧化、鎮(zhèn)痛消炎等多種功效[2-3]。

原花青素，廣泛存在于植物界，是一大類多酚類化合物的總稱，能夠很好地幫助人體清除自由基，對(duì)高血壓、腫瘤、衰老、炎癥等起到抵抗作用，能夠保護(hù)心血管甚至具有美容功效[4-5]，已被普遍應(yīng)用于醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。

很少有人研究山竹精加工工藝，人們通常直接食用山竹的果肉，而山竹果皮在整個(gè)果實(shí)中約占55%，通常將其視為精加工后的工業(yè)廢料或者食用垃圾直接舍棄，這不僅對(duì)果皮中所含有的大量活性成分造成浪費(fèi)，又引起了環(huán)境污染問題。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)階段對(duì)原花青素的提取原料的研究大多為葡萄籽[6-7]、松樹皮[8]、藍(lán)莓[9]、蘋果[10]、蓮科植物[11-12]等。人們?nèi)找嬷匾晫?duì)山竹果皮的生物活性組成成分的研究。原花青素在山竹果皮中的含量很高[13]，因此在試驗(yàn)中選取山竹果皮作為提取材料，從而能對(duì)于其提取原花青素的工藝展開研究，對(duì)山竹果皮資源的開發(fā)具有一定意義，不但有利于開發(fā)富含原花青素新的材料，也可以變廢為寶創(chuàng)造山竹果皮更高的經(jīng)濟(jì)效益，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。

目前，對(duì)山竹活性物質(zhì)的純化與分離還處于初級(jí)階段，以山竹果皮為原料進(jìn)行原花青素的提取工藝研究較少[14-17]，纖維素酶輔助對(duì)山竹果皮原花青素的提取相關(guān)工藝未見報(bào)道。在細(xì)胞壁的組成成分中，纖維素占有重要地位，葡萄糖與纖維二糖是其被纖維素酶分解之后的2個(gè)產(chǎn)物，試驗(yàn)為了提高其提取效率，借助纖維素酶來(lái)破壞、降解山竹果皮的細(xì)胞壁，從而溶出更多的細(xì)胞內(nèi)容物。而針對(duì)響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取山竹果皮中原花青素進(jìn)行研究，以期對(duì)相關(guān)研究起到一定的借鑒意義，從而有利于今后開展相關(guān)的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：新鮮山竹。

試劑：兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；C2H5OH，CH3OH，H2SO4，香草醛等，均為分析純。

儀器：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海中賢恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品；SL-1000型移液槍，德國(guó)Eppendorfer公司產(chǎn)品；HH-8型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；電子天平，北京聯(lián)合科力科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制

配制3%香草醛甲醇溶液：在100 mL的CH3OH中溶解已稱量好的香草醛3.0 g。

配制30%硫酸甲醇溶液：在通風(fēng)廚中，用量筒量取70 mL的CH3OH于燒杯中，然后在攪拌條件下，將30 mL 98%硫酸緩慢加入其中。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制母液：精確稱量20 mg的兒茶素對(duì)照品，用H2O溶解后移至20 mL的容量瓶中，搖勻備用。分別吸取母液 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL于10 mL容量瓶中，各自加H2O至刻度后搖勻。然后從這些樣品中分別取0.5 mL移至10 mL比色管中，向其中加入2.5 mL的3%香草醛甲醇與30%硫酸甲醇溶液，于30℃下，避光反應(yīng)15 min后，以去離子水作為空白，于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度（Abs），然后作圖，以質(zhì)量濃度（mg/mL） 為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到Y(jié)=0.760 3X+0.002 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 7的回歸方程（X表示兒茶素質(zhì)量濃度，Y表示吸光度）。

1.2.3 山竹果皮中原花青素提取率的計(jì)算

式中：C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液總體積，mL；

W——樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4 山竹果皮原花青素提取的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）提取。樣品制備：取0.2 g山竹果皮樣品，搗碎后加入50 mL比色管中，加入適量纖維素酶與10 mL的H2O，保持反應(yīng)溫度不變，進(jìn)行一段時(shí)間的水浴酶解后，將適量的C2H5OH加入其中，在一定的溫度下進(jìn)行一段時(shí)間的水浴提取，過濾后在50 mL容量瓶中用提取溶劑定容，備用。

采用硫酸-香草醛法[18-19]測(cè)定原花青素在樣品中的含量：進(jìn)行空白調(diào)零，即將0.5 mL樣品用等量水替代，然后逐步加入2.5 mL香草醛甲醇與2.5 mL硫酸甲醇溶液，避光處理，于30℃下進(jìn)行15 min的反應(yīng)。吸取0.5 mL樣品至比色管，加入2.5 mL香草醛甲醇與2.5 mL硫酸甲醇溶液，避光處理，于30℃下進(jìn)行15 min的反應(yīng)，于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度A1。對(duì)于波長(zhǎng)500 nm處的光提取液中的色素也可以吸收，所以將2.5 mL的香草醛甲醇與等量的甲醇溶液加入到0.5 mL的樣液中，進(jìn)行相同反應(yīng)步驟測(cè)定吸光度A0，則原花青素的吸光度為A=A1-A0[13]，由此能夠?qū)悠奉伾?、本底造成的誤差進(jìn)行消除。然后以原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)對(duì)提取率進(jìn)行計(jì)算。

（2）單因素試驗(yàn)。在保證其他條件相同的情況下改變其中的一個(gè)條件，分別考查纖維素酶添加量1%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%，20%；乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%，90%；酶解溫度35，40，45，50，55，60，65，70℃；酶解時(shí)間 10，20，40，60，80，100，120 min；提取時(shí)間 10，20，30，40，50，60，70 min；提取溫度40，50，60，70，80，90，100℃對(duì)山竹果皮中原花青素提取率的影響。

（3） 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理為依據(jù)，基于單因素試驗(yàn)，選取對(duì)山竹果皮原花青素的提取率影響最大的4個(gè)因素進(jìn)行確定，然后借助響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化實(shí)際的提取條件。在試驗(yàn)過程中采用Design Expert V8.0.6軟件完成回歸分析。試驗(yàn)分別選取了纖維素酶添加量、酶解溫度、提取時(shí)間和酶解溫度這4個(gè)單因素作為優(yōu)化對(duì)象。

Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)原花青素提取率的影響

纖維素酶添加量對(duì)原花青素提取率的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)原花青素提取率的影響

由圖1可知，原花青素的提取率先隨著纖維素酶添加量的增加而隨之上升，在14%左右獲得最大提取率，之后原花青素的提取率反而隨著纖維素酶添加量增多而減小，這可能是因?yàn)殡S著纖維素酶添加量的提升，纖維素酶的添加量處于過飽和狀態(tài)，使得原花青素的提取率降低。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響

由圖2可知，原花青素的提取率先隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在80%左右達(dá)到提取率最大值，之后原花青素的提取率反而隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而減小。分析原因，可能由于過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)纖維素酶的活性造成了抑制，不利于原花青素的浸出。

2.1.3 酶解溫度對(duì)原花青素提取率的影響

酶解溫度對(duì)原花青素提取率的影響見圖3。

由圖3可知，在酶解溫度35～60℃時(shí)，原花青素的提取率隨著酶解溫度升高而增大，最大值在60℃處獲得，之后呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槊附鉁囟壬呤沟美w維素酶部分或全部變性，酶促反應(yīng)受到抑制，不利于原花青素的浸出與提取。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

圖3 酶解溫度對(duì)原花青素提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

由圖4可知，原花青素的提取率在10～40 min內(nèi)隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而提高，主要由于延長(zhǎng)酶解時(shí)間能夠充分利用酶的活性，使得酶解反應(yīng)較完全，山竹果皮的細(xì)胞壁在這個(gè)過程中得到的破壞不斷加大，使其中原花青素成分不斷溶出，從而更好地提高提取率。酶解一定時(shí)間后，已經(jīng)幾乎全部溶出了原花青素成分，提取率隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而降低，所以最佳酶解時(shí)間為40 min。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

由圖5可知，原花青素的提取率會(huì)隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而提高，最大值在30 min處獲得，之后呈下降趨勢(shì)。主要原因是由于提取時(shí)間不足時(shí)，沒有溶出原花青素，但提取時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)原花青素的結(jié)構(gòu)可能受到破壞，會(huì)溶出部分雜質(zhì)成分。因此，最佳提取時(shí)間選為30 min。

2.1.6 提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響

提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響見圖6。

圖6 提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響

由圖6可知，原花青素的提取率在一定溫度區(qū)間內(nèi)與提取溫度成正比，最大提取率在70℃獲得。提取溫度升高，提取率卻隨之減小，主要由于過高的溫度會(huì)使得其化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到一定的破壞。所以，最佳提取溫度為70℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

通過單因素結(jié)果分析可知，纖維素酶添加量、酶解溫度、提取時(shí)間和酶解時(shí)間這4個(gè)因素對(duì)山竹果皮原花青素提取率的影響最大。所以，借助Design Expert V8.0.6軟件對(duì)這4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)。

響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

將表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，最終可得到如下多元二次線性回歸方程式，其反映了各因素在回歸擬合后對(duì)于山竹果皮中原花青素提取率Y的影響：

式中：首先要對(duì)其中的纖維素酶添加量X1、酶解溫度X2、提取時(shí)間X3和酶解時(shí)間X4等4個(gè)變量進(jìn)行量綱一線性編碼處理，使得其絕對(duì)值大小與影響程度間存在直接聯(lián)系，而正負(fù)則代表影響的方向性[13]。由于式中各二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，因此方程一定有極大值點(diǎn)，故而對(duì)方程進(jìn)行優(yōu)化分析。得出結(jié)論為酶解溫度、酶解時(shí)間、纖維素酶添加量與提取時(shí)間等4個(gè)變量對(duì)山竹果皮中原花青素影響率的影響程度依次遞減。同時(shí)觀察各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值可知，其中的酶解溫度線性項(xiàng)、纖維素酶用量和酶解溫度的交互項(xiàng)，以及各因素的二次項(xiàng)對(duì)原花青素得率影響最大。為檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析

表3中對(duì)該模型進(jìn)行了方差分析顯著性檢驗(yàn)，p值小于0.000 1，該模型達(dá)到極顯著；失擬檢驗(yàn)中的p值大于0.05，為不顯著。模型總決定系數(shù)R2=0.964 4，即該模型能夠?qū)?6%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異現(xiàn)象進(jìn)行解釋，也即該模型對(duì)新數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)性極佳。

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表4。

根據(jù)表4可知，試驗(yàn)因素與Y值間不止存在簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，不同變量間的交互作用和二次項(xiàng)也對(duì)Y值存在較大影響。其具體表現(xiàn)為：所有二次項(xiàng)影響表現(xiàn)均為極顯著，X2和X1X2影響表現(xiàn)為顯著。

2.2.2 單因素交互作用及分析

對(duì)于因變量受到自變量的影響，能夠從自變量和響應(yīng)值繪制的三維圖中觀察到，其中兩因素交互作用的顯著程度隨著等高線圖越圓而越低。

纖維素酶添加量和酶解溫度對(duì)提取率的交互影響見圖7，纖維素酶添加量和提取時(shí)間對(duì)提取率的交互影響見圖8，纖維素酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)提取率的交互影響見圖9，酶解溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率的交互影響見圖10，酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)提取率的交互影響見圖11，酶解時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)提取率的交互影響見圖12。

圖7顯示了在提取溫度（C） 與酶解時(shí)間（D）不變時(shí)，原花青素提取率受到纖維素酶添加量（A）與酶解溫度（B） 的交互作用的影響。保持B不變，提取率隨著纖維素酶添加量的增加呈現(xiàn)先大后小的趨勢(shì)；保持A不變，提取率的變化趨勢(shì)亦是如此。兩者存在明顯的交互作用，且在纖維素酶添加量為13%～15%時(shí)原花青素提取率最大。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

圖7 纖維素酶添加量和酶解溫度對(duì)提取率的交互影響

圖8顯示，纖維素酶添加量和提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響，可以看到在控制酶解溫度和酶解時(shí)間2個(gè)變量不變時(shí)，可以完全不考慮提取時(shí)間這一影響因素。這與顯著性分析的結(jié)果一致。

圖9顯示，不變的兩因素為酶解溫度和提取時(shí)間，主要研究原花青素提取率受纖維素酶添加量與酶解時(shí)間交互作用的影響。

圖8 纖維素酶添加量和提取時(shí)間對(duì)提取率的交互影響

圖9 （a） 顯示，纖維素酶添加量不變時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，提取率反而表現(xiàn)出來(lái)降低的現(xiàn)象，也就是說，就原花青素提取率而言，A和D間的相互作用對(duì)其影響較小。

圖10顯示，不變的兩因素為纖維素酶添加量與酶解時(shí)間，取變量酶解溫度和提取時(shí)間進(jìn)行研究，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，原花青素提取率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)為先增后減，而當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，提取率的變化趨勢(shì)亦是如此。這就充分表明了這二者并不存在明顯的交互作用。

圖11顯示，纖維素酶添加量與提取時(shí)間保持不變，對(duì)酶解時(shí)間和酶解溫度進(jìn)行調(diào)整，研究二者的交互作用是如何影響提取率的。酶解時(shí)間和酶解溫度分別不變時(shí)，隨著自變量增大，提取率表現(xiàn)出先增加后減小的現(xiàn)象。而二者之間的交互作用并沒有明顯的反映。

圖9 纖維素酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)提取率的交互影響

圖10 酶解溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率的交互影響

圖11 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)提取率的交互影響

圖12 酶解時(shí)間和提取時(shí)間對(duì)提取率的交互影響

圖12 顯示，不變量為纖維素酶添加量與酶解溫度，提取時(shí)間和酶解時(shí)間改變。在圖12（a）中，提取時(shí)間不變，提取率隨酶解時(shí)間的增加先升高后降低；反之，當(dāng)酶解時(shí)間不變時(shí)，提取率隨提取時(shí)間的增加呈相同變化趨勢(shì)?？傮w上這2種因素交互作用影響不大。

2.2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

對(duì)于提取山竹果皮原花青素的工藝，其最適合的提取條件為纖維素酶添加量13.99%，提取時(shí)間30.14 min，提取溫度70℃，酶解時(shí)間39.06 min，酶解溫度59.57℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在這樣的條件下，理論上提取率為25.52%，實(shí)際提取率為25.43%，二者相較，僅存在0.35%的誤差。由此認(rèn)為此模型能夠適用于試驗(yàn)，確立的最佳條件具有較高的可靠性。

3 結(jié)論

首先選取了6種單因素進(jìn)行試驗(yàn)，在選取的過程中主要根據(jù)其可能對(duì)山竹果皮中原花青素的提取率產(chǎn)生影響的單因素，并分別探索其中的影響程度。結(jié)果表明，在纖維素酶添加量14%，提取時(shí)間30 min，提取溫度70℃，酶解時(shí)間39 min，酶解溫度59.5℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%條件下，獲得最大提取率，但是最佳提取條件并非簡(jiǎn)單的各因素最佳值的結(jié)合。鑒于試驗(yàn)的可行性，從中選取了纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、提取時(shí)間這4項(xiàng)對(duì)提取率影響最大的單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

制定四因素三水平的方案，然后經(jīng)過相應(yīng)的回歸擬合處理，得到響應(yīng)值為Y的回歸方程。由方程一次項(xiàng)系數(shù)知道，酶解溫度、酶解時(shí)間、纖維素酶添加量、提取時(shí)間對(duì)提取率的影響逐漸減小。再觀察其他項(xiàng)可知，酶解溫度、酶解時(shí)間、纖維素酶用量、提取時(shí)間這4個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)提取率的影響均表現(xiàn)為非常顯著；而在較大程度上影響提取率的因素為酶解溫度、纖維素酶添加量和酶解溫度的交互作用。

最后，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)于山竹果皮提取原花青素的工藝，其最佳的提取條件為纖維素酶添加量13.99%，提取時(shí)間30.14 min，提取溫度70℃，酶解時(shí)間39.06 min，酶解溫度59.57℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在這樣的條件下，理論上提取率為25.52%，實(shí)際提取率為25.43%，二者相較，僅存在0.35%的誤差。由此認(rèn)為此模型能夠適用于試驗(yàn)。另外，與沒有添加纖維素酶的實(shí)際提取率17.38%[13]相比，山竹果皮中原花青素的提取率提高了約8%。

原花青素在山竹果皮中的含量豐富，將提取材料選為果皮不僅充分利用其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也增添了新的材料來(lái)提取原花青素。在傳統(tǒng)提取工藝中添加纖維素酶，能夠在很大程度上提高原花青素提取率，也為今后的相關(guān)工藝起到一定的借鑒意義。