凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠便秘的緩解作用

劉文英，翟齊嘯，田豐偉，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種新型益生菌，菌體為桿狀，芽孢位于一端，屬于革蘭氏陽性菌，兼性厭氧。因具有產(chǎn)芽孢能力，其與傳統(tǒng)的乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌相比，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐熱、易貯藏等獨特的優(yōu)點[1-2]。此外它還具有改善宿主腸道菌群[3]、調(diào)節(jié)免疫和緩解炎癥[4]等生理功能。目前，國內(nèi)外用凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)的產(chǎn)品主要包括飼料、保健品和藥品等，在加拿大、美國、澳大利亞和新西蘭等國家，凝結(jié)芽孢桿菌還被廣泛應(yīng)用于飲料、烘焙食品、糖果等生產(chǎn)中。2016年中國國家衛(wèi)生計生委將凝結(jié)芽孢桿菌列入《可用于食品的菌種名單》中，而目前凝結(jié)芽孢桿菌在食品領(lǐng)域中的研究與應(yīng)用相對較少。

凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢體具有高抗逆性，可抵抗胃酸和膽鹽，從而能夠順利進入腸道，在腸道中萌發(fā)增殖。其分泌的L-乳酸能刺激腸壁蠕動，降低腸道pH，有利于抑制有害菌的生長，并促進雙歧桿菌等有益菌的生長和繁殖。此外，其產(chǎn)生的B族維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸等物質(zhì)能促進腸道蠕動，提高膳食纖維的利用率，加速排便。凝結(jié)芽孢桿菌TBC 169活菌片已經(jīng)成功應(yīng)用于兒童、孕婦和產(chǎn)褥期婦女等人群便秘的臨床治療中[5-7]。有研究表明，有便秘傾向的健康人群服用凝結(jié)芽孢桿菌lilac-01菌株后排便頻率明顯增加，且糞便的尺寸、顏色、氣味等性質(zhì)得到顯著改善[8]。此外，凝結(jié)芽孢桿菌 GBI-30,6086對便秘的緩解功效也已得到眾多臨床文獻支持[9]，該菌株已通過美國GRAS認定。實驗室前期分離得到的凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39菌株，經(jīng)動物試驗證明也具有緩解便秘的功能。

低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉等水溶性膳食纖維作為益生元能夠促進腸道中有益菌的生長，其對便秘的治療效果已經(jīng)得到研究證實。趙晶晶[10]對307例便秘患者進行人體試食試驗，結(jié)果表明，服用7 d低聚果糖后，便秘患者的排便次數(shù)和糞便含水量顯著升高，糞便性狀得到有效改善。另有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，便秘人群服用菊粉或低聚半乳糖連續(xù)4周后，排便頻率顯著提高，且糞便更加柔軟 。將其與雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌復(fù)配使用時，能夠進一步提高便秘的治療效果[13-14]。

通過將凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39芽孢與低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉復(fù)配，得到一種復(fù)合微生態(tài)制劑，凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30,6068作為對照，利用動物試驗評價該復(fù)合制劑對便秘的緩解效果，以期為凝結(jié)芽孢桿菌在功能性食品領(lǐng)域的開發(fā)、應(yīng)用與推廣奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫。

GBI-30(凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30,6068)由美國Schiff公司生產(chǎn)的Digestive Advantage益生菌膠囊分離得到。

1.1.2 主要試劑

低聚果糖(95%)、低聚半乳糖(90%)，保齡寶生物股份有限公司；菊粉(99%)，維樂夫集團；鹽酸洛哌丁胺膠囊，西安楊森制藥有限公司；活性炭粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠 P 物質(zhì)(SP)、內(nèi)皮素(ET-1)、生長抑素(SS)、胃動素(MTL)、胃泌素(Gas)和血管活性腸肽(VIP)ELISA試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；阿拉伯樹膠粉、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸，國藥集團化學(xué)試劑公司。墨汁按照文獻方法配制[15]。

1.2 儀器和設(shè)備

PB300-N 電子天平,Mettler Toledo；真空冷凍干燥機，美國 LABCONCO 公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；Milli-Q 水凈化系統(tǒng),密理博(中國)有限公司；Multiscan Go 多功能酶標(biāo)儀,美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物試驗設(shè)計

小鼠為購于上海斯萊克公司的7周齡雄性SPF級BALB/c小鼠。動物試驗方案經(jīng)江南大學(xué)倫理委員會批準(JN.No20180615b1101001)，并按照歐盟指導(dǎo)方針(2010/63/EU)執(zhí)行。飼養(yǎng)環(huán)境保持在(23± 2)℃，相對濕度在(50±10)%，12 h光照12 h黑夜交替。30只小鼠隨機分成空白組、模型組、GBI-30組、B.C-39組和復(fù)合組，每組6只，其中B.C-39組為僅含凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39的對照組，旨在驗證此菌株對便秘的緩解效果。適應(yīng)7d后，空白組每天灌胃無菌生理鹽水，其余各組小鼠灌胃鹽酸洛哌丁胺(10 mg/kg b.w)，1 h 后空白組和模型組灌胃無菌生理鹽水，GBI-30組、B.C-39組灌胃對應(yīng)的芽孢生理鹽水懸液 (5×108CFU/mL) ，復(fù)合組灌胃復(fù)配制劑生理鹽水懸液(B.C-39芽孢5×108CFU/mL，低聚果糖0.8 g/kg b.w，低聚半乳糖0.8 g/kg b.w，菊粉1.92 g/kg b.w)，灌胃體積均為0.2 mL，連續(xù)14 d。低聚糖、菊粉劑量選擇的主要依據(jù)是人體每日推薦量，低聚糖5 g/d，菊粉12 g/d，人的體重以60 kg計，相當(dāng)于低聚糖0.08 g/(d·kg b.w)，菊粉0.192 g/(d·kg b.w)，凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39芽孢人體有效量1×107CFU/d。小鼠的灌胃劑量按人體使用劑量的10倍計算，即凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39芽孢1×108CFU，低聚果糖0.8 g/kg b.w，低聚半乳糖0.8 g/kg b.w，菊粉1.92 g/kg b.w。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量、食物和水?dāng)z入量的測定

1～14 d每天均進行小鼠體重、采食量、飲水量的檢測。

1.3.3 小鼠糞便粒數(shù)、重量和水分含量的測定

第0、7、14天，灌胃結(jié)束后小鼠立即單只單籠放置3 h，收集糞便，計顆粒數(shù)，稱重，凍干后記錄干質(zhì)量。

(1)

1.3.4 小鼠腸道運動能力的測定

第13天，小鼠禁食過夜，空白組小鼠灌胃無菌生理鹽水，其余各組灌胃鹽酸洛哌丁胺(10 mg/kg b.w)，1 h 后，所有小鼠灌胃含相應(yīng)受試制劑的墨汁，灌胃體積均為0.2 mL。隨后動物立即轉(zhuǎn)移到干凈的籠子，隨意攝入食物和水。記錄從灌胃墨汁到第1顆黑色糞便排出的時間。

第14天，小鼠禁食過夜，灌胃方法同第13天，30 min后，小鼠腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg b.w)麻醉，取血后脫頸椎處死，開腹，小心地取出從幽門到盲腸的整個小腸，測量墨汁行進的距離和小腸全長。

(2)

1.3.5 小鼠血清胃腸調(diào)節(jié)肽的測定

將收集到的小鼠血液靜置 2 h，3 000×g離心15 min后獲得血清，參照相應(yīng)試劑盒說明書進行試驗，根據(jù)標(biāo)準曲線計算血清中胃動素(motilin，MTL)、胃泌素(gastrin，Gas)、內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)、生長抑素(somatostatin，SS)、P 物質(zhì)(substance P，SP)和血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)的濃度。

1.3.6 小鼠腸道短鏈脂肪酸的測定

根據(jù)毛丙永[16]的方法，利用GC-MS測量小鼠凍干糞便中的短鏈脂肪酸含量。使用Rtx-Wax 柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)，載氣、流速、分流比、進樣量、進樣溫度和 GC 升溫程序的設(shè)置與毛丙永[16]的方法一致，質(zhì)譜分析為全掃描模式。通過外標(biāo)法制得標(biāo)準曲線，小鼠糞便樣品經(jīng)凍干、飽和NaCl浸泡、H2SO4(10%)酸化、無水乙醚萃取后，上機檢測，根據(jù)標(biāo)準曲線計算樣品中各種短鏈脂肪酸和總酸的濃度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準差”，數(shù)據(jù)繪圖用GraphPad Prism 5完成。用SPSS(22版)中的單因素ANOVA 和 Duncan’s多量程檢驗進行顯著性分析。P<0.05，在統(tǒng)計學(xué)意義上具有差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合微生態(tài)制劑對體質(zhì)量、食物攝入量和飲水量的影響

體質(zhì)量、攝食量和飲水量是評估小鼠便秘癥狀的重要參數(shù)。但在洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘小鼠模型中，這些參數(shù)變化趨勢不同，這可能與動物品系及洛哌丁胺用量等因素有關(guān)。WINTOLA[17]研究證實，灌胃洛哌丁胺的小鼠會出現(xiàn)體重下降，食物和水的攝入量減少，而LEE[18]的研究結(jié)果說明洛哌丁胺對這些參數(shù)無顯著影響。

由圖1可知，空白組小鼠體質(zhì)量持續(xù)增長，模型組和治療組小鼠體質(zhì)量先呈下降趨勢，其中模型組下降最嚴重，第8天起體重又逐漸上升。試驗?zāi)┢谶M行的小鼠首次排黑便試驗需禁食過夜，導(dǎo)致第13天各組小鼠體質(zhì)量均有所降低，禁食結(jié)束后體質(zhì)量上升。結(jié)果表明，灌胃GBI-30、B.C-39和復(fù)合制劑均能抑制便秘引起的小鼠體質(zhì)量的降低，且隨時間延長自然恢復(fù)與微生態(tài)制劑治療都能使小鼠體質(zhì)量恢復(fù)增長趨勢。復(fù)合組增長幅度較低可能與灌胃制劑的飽腹感造成的采食量降低有關(guān)。洛哌丁胺會引起小鼠水?dāng)z入量降低，由圖2和3可知，GBI-30、B.C-39及復(fù)合制劑對小鼠食物和水?dāng)z入量無顯著影響，與WINTOLA[17]的研究結(jié)果一致。

圖1 試驗期間各組小鼠體質(zhì)量變化情況Fig.1 Changes in body weight of mice in each group during experiments

圖2 試驗期間各組小鼠攝食量情況Fig.2 Food intake of mice in each group during the experiment 注：字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，圖3同

圖3 試驗期間各組小鼠飲水量情況Fig.3 Water intake of mice in each group during the experiment

2.2 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠糞便粒數(shù)、質(zhì)量和水分含量的影響

便秘的癥狀包括排便頻率降低，糞便堅硬干結(jié)、難排出等。本試驗通過檢測小鼠3 h排便顆粒數(shù)、糞便干質(zhì)量/體質(zhì)量和糞便水分含量，評價小鼠的便秘程度。

如圖4～6所示，第0天，各組小鼠糞便參數(shù)無顯著差異(P>0.05)。隨造模時間的延長，模型組糞便顆粒數(shù)、糞便干質(zhì)量/體質(zhì)量和含水量呈下降趨勢。第14天GBI-30組、B.C-39組和復(fù)合組排便指標(biāo)顯著高于模型組(P<0.05)，其中復(fù)合組最高，該結(jié)果與叢麗敏等[19]研究結(jié)果一致。凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39芽孢制劑能顯著緩解洛哌丁胺引起的排便頻率和糞便水分含量的降低，且與低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉復(fù)配使用時有效果更強的趨勢，可能原因是復(fù)合微生態(tài)制劑中的低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉成分的水溶性極強，在腸道中能通過吸收水分增加糞便質(zhì)量和潤滑度，從而有助于糞便運輸和排出[20]，增強了復(fù)合制劑的通便效果。

圖4 各組小鼠排便顆粒數(shù)Fig.4 Fecal pellet numbers of mice in each group注：同一天柱形圖上的字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，圖5、6同

圖5 各組小鼠糞便干重/體重Fig.5 Dry fecal weight/body weight of mice in each group

圖6 各組小鼠糞便水分含量Fig.6 Water content of defecation of mice in each group

2.3 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠腸道運動能力的影響

小腸推進率可直接反映小腸的運動能力[21]。洛哌丁胺能抑制腸道蠕動，延遲腸道內(nèi)容物的輸送。由圖7可知，模型組小鼠小腸推進率(45%)顯著低于空白組(P<0.05)，說明使用洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘模型造模成功。治療組的各組小鼠小腸推進率顯著高于模型組(P<0.05)，其中復(fù)合組最高(88.9%)，其次是B.C-39組(P<0.05)。該結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30,6086、B.C-39和復(fù)合制劑均能顯著緩解洛哌丁胺對小腸蠕動的抑制作用。食糜在整個腸道中的轉(zhuǎn)運時間可通過檢測小鼠排首粒黑便的時間來確定[21]。由圖8可知，GBI-30組、B.C-39組和復(fù)合組排首粒黑便的時間均顯著短于模型組(193 min)，其中復(fù)合組用時最短(68 min)，GBI-30組次之。小腸推進率試驗表明，B.C-39組促進小腸蠕動的能力優(yōu)于GBI-30組，但本試驗結(jié)果表明GBI-30組整個腸道的轉(zhuǎn)運能力優(yōu)于B.C-39組，可能原因是不同菌株的主要作用位點不同。小腸推進率僅反映小腸運動能力，而排首粒黑便的時間除受小腸運動能力影響外，還受食糜在結(jié)腸中水分和電解質(zhì)的吸收、糞便對直腸黏膜的充盈刺激等排便的各個環(huán)節(jié)的影響[21]，推測B.C-39主要作用位點集中在小腸，而GBI-30,6086在排便的各個環(huán)節(jié)均發(fā)揮積極作用，導(dǎo)致B.C-39小腸推進率更高，而GBI-30,6086排出首粒黑便的時間更短。可見，凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39能促進便秘小鼠的腸道運動，與低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉復(fù)配有增效作用，使其優(yōu)于GBI-30,6086對照菌株。

圖7 各組小鼠小腸推進率Fig.7 The small intestinal transit rate of mice in each group注：柱形圖上的字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

圖8 各組小鼠排首粒黑便時間Fig.8 First black stool defecation time of mice in each group注：柱形圖上的字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

2.4 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的影響

胃腸調(diào)節(jié)肽在調(diào)節(jié)胃腸道運動方面起著非常重要的作用，胃腸調(diào)節(jié)肽的水平與便秘程度密切相關(guān)[22]。其中MTL、Gas和SP為興奮性遞質(zhì)，而ET-1、SS和VIP為抑制性遞質(zhì)。MTL主要作用于上消化道，能促進胃腸運動[23]。Gas能刺激胃酸、胰液和腸液的分泌，促進胃黏膜細胞增殖和胃腸運動，抑制幽門括約肌收縮[24]。ET-1在維持心血管功能穩(wěn)態(tài)和胃腸功能等方面起重要作用。SP能刺激胃腸道平滑肌收縮，SP水平升高能加快胃腸道收縮和運動[25]。VIP是調(diào)節(jié)腸道蠕動的重要因子。SS能抑制MTL、Gas等的釋放，減少消化液的分泌[26]。

各組小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽水平如表1所示，相比模型組，GBI-30組、B.C-39組和復(fù)合組顯著增高了小鼠血清中Gas、MTL、SP等興奮性遞質(zhì)的水平(P<0.05)，并顯著降低了VIP、ET-1、SS等抑制性遞質(zhì)的水平(P<0.05)。復(fù)合組對Gas、MTL、SP、VIP、ET-1的恢復(fù)能力與B.C-39組相比無顯著差異， 降低SS的能力優(yōu)于B.C-39。與GBI-30組相比，復(fù)合組對MTL和VIP的恢復(fù)能力更優(yōu)。以上結(jié)果說明便秘嚴重影響了小鼠體內(nèi)胃腸激素水平，口服凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39復(fù)合微生態(tài)制劑可明顯改善便秘引起的胃腸調(diào)節(jié)肽的分泌失調(diào)。

表1 各組小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的水平 單位：ng/L

注：同行肩標(biāo)的不同字母表示不同組之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響

乙酸、丙酸、正丁酸和異丁酸等短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)的含量是益生菌緩解便秘效果的重要評價指標(biāo)之一。SCFAs是腸道微生物的最終代謝產(chǎn)物，可降低腸道pH值，抑制致病菌的生長，促進有益菌的增殖，從而改善腸道微環(huán)境；SCFAs為腸黏膜細胞提供能量來源，促進腸上皮細胞增殖，有利于維護腸屏障，抵抗炎癥，緩解便秘[21]。研究表明乙酸、丙酸等有機酸可直接刺激腸壁神經(jīng)，加快腸道蠕動；乙酸是微生物的主要代謝產(chǎn)物，其濃度的增加可使腸管內(nèi)滲透壓增大，腸道內(nèi)水分吸收增加，提高糞便質(zhì)量和潤滑度，使其更易于運輸與排出[27]。

由表2可知，B.C-39組和復(fù)合組各種SCFAs及總酸的含量均高于模型組，復(fù)合組丙酸、正丁酸、總酸含量顯著高于B.C-39組。表明口服凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39及其復(fù)合微生態(tài)制劑能增加腸道SCFAs含量，且復(fù)合制劑效果優(yōu)于B.C-39，可能原因是SCFAs含量與微生物的發(fā)酵底物有關(guān)，復(fù)合制劑中低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉不能被動物或人體消化吸收，從而能夠順利到達結(jié)腸，增加了微生物的發(fā)酵底物量，進而SCFAs的產(chǎn)量也有所增加。結(jié)合腸道運動能力試驗結(jié)果綜合分析，表明便秘程度與腸道中SCFAs含量具有相關(guān)性，與WANG[26]、 RANILLA等[28]、季超等[29]研究結(jié)果一致。

表2 各組小鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量 單位：μmol/g

注：同行肩標(biāo)的不同字母表示不同組之間存在顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

本試驗通過建立洛哌丁胺誘導(dǎo)的小鼠便秘模型，探討了凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39及其復(fù)合微生態(tài)制劑對便秘的緩解效果。結(jié)果表明,B.C-39和復(fù)合制劑均起到了緩解便秘的作用，復(fù)合制劑對便秘癥狀的改善效果優(yōu)于B.C-39。復(fù)合微生態(tài)制劑能夠顯著增加便秘小鼠的排便顆粒數(shù)、糞便質(zhì)量和水分含量，提高腸道內(nèi)容物在小腸中的推進速率，縮短小鼠首粒黑便的排出時間。此外，灌胃B.C-39復(fù)合制劑使便秘小鼠Gas、MTL、SP、VIP、ET-1和SS等胃腸激素的分泌趨于正常，并增加小鼠腸道內(nèi)SCFAs的含量。可見，凝結(jié)芽孢桿菌B.C-39芽孢復(fù)合制劑能夠有效緩解鹽酸洛哌丁胺引起的小鼠便秘。