玉米淀粉濃度對酶法制備直鏈麥芽低聚糖的影響

陳殿寧，李才明,2，顧正彪,2，洪雁,2，程力,2，李兆豐,2*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

直鏈麥芽低聚糖是一種特殊的功能性淀粉糖，它通常是指由3～10個(gè)葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵連接而成的寡糖聚合體，是一種集營養(yǎng)與功能于一體的新型淀粉糖[1]。直鏈麥芽低聚糖具有極易溶于水、黏度高、甜度低、保濕能力強(qiáng)而吸濕性小等特性，食品加工適應(yīng)性良好，在改善食品質(zhì)地和風(fēng)味以及延長面包和速凍食品保質(zhì)期方面有較好的應(yīng)用[1-2]；同時(shí)，直鏈麥芽低聚糖不會(huì)引起餐后血糖的迅速升高，可以為人體緩慢持續(xù)地提供能量，賦予其獨(dú)特的生理功效，在特殊疾病患者的食療和功能性運(yùn)動(dòng)運(yùn)料的開發(fā)中有較好的應(yīng)用前景[1]。據(jù)報(bào)道，直鏈麥芽低聚糖(麥芽三糖到麥芽六糖)還可以作為磷酸寡糖合成的前體，促進(jìn)機(jī)體對鈣的吸收[3]；直鏈麥芽六糖也可參與治療細(xì)菌感染疾病，有效消除多藥耐藥性細(xì)菌對人體的威脅[4]。直鏈麥芽低聚糖生成酶(maltooligosaccharide-forming amylase, MFA酶)是生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的主要酶制劑，可水解淀粉中的α-1,4-糖苷鍵生成直鏈麥芽低聚糖。另外，在傳統(tǒng)的淀粉糖生產(chǎn)工藝中，玉米淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般控制在20%～35%[5]，在淀粉酶解過程中只有極少部分的水被消耗[6]，這導(dǎo)致在淀粉糖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的能耗和水耗，以及大量的工業(yè)廢水[7]。解決上述問題最直接的方法是提高淀粉的初始濃度[8]。楊倩雯和曲世洋等[9-10]研究了底物濃度對酶法生產(chǎn)麥芽糖和葡萄糖的影響，而底物濃度對MFA酶酶解玉米淀粉生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的研究還未見報(bào)道。目前美國、日本等少數(shù)發(fā)達(dá)國家已實(shí)現(xiàn)直鏈麥芽低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)，但國內(nèi)未見相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11]。因此，有必要對酶法生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的工藝進(jìn)行深入研究，并探究玉米淀粉初始濃度對酶法制備直鏈麥芽低聚糖的影響。

本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacillusstearothermophilusSTB04)的直鏈麥芽低聚糖生成酶(Bst-MFA酶) (GenBank: AIV43245.1)的枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisWB600)表達(dá)系統(tǒng)，并研究了Bst-MFA酶酶解低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5%)玉米淀粉的產(chǎn)物合成情況[12]，以高質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉為底物的酶解產(chǎn)物合成情況還未研究。因此，本研究以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉為底物，探究底物初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對Bst-MFA酶酶解玉米淀粉生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的影響，并探究相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉(水分含量11.85%)，購于山東大宗生物開發(fā)股份有限公司；直鏈麥芽低聚糖生成酶(Bst-MFA酶)為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵所得；酵母粉和蛋白胨購于英國Oxoid公司；麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)、麥芽七糖(G7)標(biāo)準(zhǔn)品，購于上?；菡\生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A560型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；RW 20 digital Ika攪拌器，德國IKA集團(tuán)；HPAEC-PAD配有脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜，美國Thermo Scientific有限公司；Viscograph-PT100型布拉班德黏度儀，德國Brabender公司；低場核磁共振成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；RVA快速旋轉(zhuǎn)黏度儀，澳大利亞Newport Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Bst-MFA酶酶活的測定

Bst-MFA酶酶活的測定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[13]。以C6H8O7-Na2HPO4緩沖液(10 mmol/L，pH 5.0)配制的1%可溶性淀粉溶液作為底物，在0.90 mL底物中加入100 μL稀釋后的酶液，60 ℃下反應(yīng)15 min，加入1.0 mL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴中顯色5 min后立即冰浴冷卻，于540 nm下測定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出體系中還原糖含量。以每分鐘生成1 μmol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.2 玉米淀粉的酶解

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉200 g，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，按底物干基加入Bst-MFA酶 20 U/g，以2.0 ℃/min的速率從60 ℃升溫至90 ℃，保溫30 min，然后以10 ℃/min的速率將溫度降為65 ℃，并開始計(jì)時(shí)，定時(shí)取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 Bst-MFA酶酶解玉米淀粉產(chǎn)物分析

取一定質(zhì)量酶解后的樣品，沸水浴30 min滅酶[14]、定容、離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過0.22 μm水系濾膜，稀釋一定倍數(shù)后用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(high performance anion-exchange chramatograph-amperemetric detection, HPAEC-PAD)分析產(chǎn)物組成[15]。

HPAEC-PAD的分析條件為：超純水、0.25 mol/L NaOH、1 mol/L NaAc溶液三元梯度淋洗，色譜柱CarboPac PA 200，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。分析指標(biāo)為直鏈麥芽低聚糖含量、產(chǎn)率和G1～G7(G1和G2分別表示葡萄糖和麥芽糖)中各糖組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(其他組分由于缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，未做定量分析)，按公式(1)、(2)和(3)計(jì)算：

(1)

式中：G，酶解液中目的產(chǎn)物的含量，mg/g；ρ1，酶解液中目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，mg/mL；ω(淀粉)，淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m，取樣質(zhì)量，g。

(2)

式中：Y，酶解液中目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，%；m1，取樣質(zhì)量，mg。

(3)

式中：ω，酶解液中目的產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；c，酶解液中G1～G7的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 液化過程黏度的測定

參考劉文靜[16]的實(shí)驗(yàn)方法，并做部分修改。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉300 g，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，加入Bst-MFA酶 20 U/g干基玉米淀粉，攪拌均勻后倒入布拉班德黏度儀的測量杯中，測定程序?yàn)椋阂?.0 ℃/min的速率從60 ℃升溫至90 ℃，保溫30 min，再以3.5 ℃/min的速率降溫至65 ℃，保溫30 min，轉(zhuǎn)速為75 r/min，得到一條玉米淀粉液化過程黏度曲線。

1.3.5 碘藍(lán)值的測定

碘藍(lán)值的測定參考BIJTTEBIER[17]的方法并做部分修改。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉200 g，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，按底物干基加入Bst-MFA酶 20 U/g，開始反應(yīng)計(jì)時(shí)，以2.0 ℃/min的速率從60 ℃升溫至90 ℃，取酶解不同時(shí)間的樣品，沸水浴30 min滅酶，用去離子水定容至100 mL。

取適量定容后的樣品于離心管中，用去離子水補(bǔ)足4.75 mL，加入0.25 mL碘液(0.2%KI和0.02%I2)充分混勻后避光穩(wěn)定15 min，于620 nm下測定吸光度，以糊化后原淀粉的吸光度(單位質(zhì)量)為100%計(jì)算樣品的相對碘藍(lán)值。

1.3.6 玉米淀粉水分子運(yùn)動(dòng)性分析

用低場核磁共振技術(shù)[18]測定不同濃度玉米淀粉糊化過程中不同結(jié)合狀態(tài)水分子的運(yùn)動(dòng)特性。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉，取一定體積移入玻璃樣品瓶內(nèi)，攪拌均勻后放入恒溫水浴鍋，以2 ℃/min的速率升溫至90 ℃，并保溫30 min，將制備好的樣品用低場核磁共振成像分析儀中的硬脈沖回波序列CPMG(carr-purcell-meiboom-gillsequence)測定不同結(jié)合狀態(tài)水分子的運(yùn)動(dòng)特性。

低場核磁共振技術(shù)分析條件參考XU[19]的方法，并做適當(dāng)修改，具體為：25 mm直徑射頻線圈，磁場強(qiáng)度0.28 T，共振頻率21 MHz，信號強(qiáng)度2，重復(fù)采樣等待時(shí)間3 500 ms，重復(fù)采樣次數(shù)2，回波個(gè)數(shù)9 000，回波時(shí)間1.000 ms，通過反演可得出樣品中不同結(jié)合狀態(tài)水分的橫向弛豫時(shí)間T21和T22。

1.3.7 糖化過程黏度的測定

取一定量酶解不同時(shí)間的樣品于RVA鋁盒中，按設(shè)定程序立刻測定樣品的黏度，得到糖化過程中樣品的黏度變化曲線。

測定程序：鋁盒溫度65 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，測定時(shí)間3 min。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin Pro軟件分析數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS軟件(單因素方差分析、Student-Newman-Keuls程序)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對直鏈麥芽低聚糖含量和產(chǎn)率的影響

本研究所用Bst-MFA酶是一種可以水解淀粉生成以G5和G6為主產(chǎn)物的直鏈麥芽低聚糖生成酶。本實(shí)驗(yàn)以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%～50%)的玉米淀粉為底物，研究底物濃度對酶解的影響，而酶解產(chǎn)物中直鏈麥芽低聚糖含量和產(chǎn)率是衡量酶解作用的重要指標(biāo)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉酶解過程中G1～G7含量的變化如圖1所示。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，反應(yīng)過程中G1～G7的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(圖1-a)。對于不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的反應(yīng)體系，酶解24 h時(shí)，G1～G7的含量達(dá)到最高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，G1～G7的含量為91.25 mg/g；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～45%時(shí)，G1～G7的含量依次增加，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，體系中G1～G7的含量達(dá)到最大，為344.47 mg/g，相當(dāng)于10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)的3.7倍，這說明提高玉米淀粉的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以增加反應(yīng)體系中直鏈麥芽低聚糖的固形物含量，達(dá)到降低能耗的目的。然而，繼續(xù)增加底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)至50%時(shí)，反應(yīng)體系中直鏈麥芽低聚糖的含量不再繼續(xù)增加。

Bst-MFA酶酶解不同濃度玉米淀粉時(shí)主產(chǎn)物G5和G6的含量變化趨勢(圖1-b)與G1～G7相同，酶解24 h時(shí)G5和G6的含量已達(dá)到最大，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，體系中G5和G6的含量為45.02 mg/g；增加底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)至30%時(shí)，體系中G5和G6的含量明顯高于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系；繼續(xù)提高玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)至45%時(shí)，G5和G6的含量達(dá)到最大，為192.33 mg/g，相當(dāng)于10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)G5和G6含量的4.27倍，高于相同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下G1～G7含量的增加程度，可見提高玉米淀粉的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以明顯增加反應(yīng)體系中主產(chǎn)物G5和G6的含量。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉反應(yīng)過程中直鏈麥芽低聚糖含量的變化曲線Fig.1 Changes of malt oligosaccharide content during the reaction at different concentrations of corn starch

Bst-MFA酶酶解不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉24 h時(shí)的直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)率如圖2所示。

圖2 不同濃度玉米淀粉反應(yīng)24 h時(shí)的直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)率Fig.2 Malt oligosaccharide yield produced by different concentrations corn starch at 24 h

隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，G1～G7的產(chǎn)率和主產(chǎn)物G5和G6的產(chǎn)率均逐漸降低。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，G1～G7的產(chǎn)率為91.25%，說明體系中玉米淀粉幾乎全部轉(zhuǎn)化為G1～G7，主產(chǎn)物G5和G6的產(chǎn)率也高達(dá)54.95%；隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，G1～G7的產(chǎn)率逐漸降低，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至45%及以上時(shí)，G1～G7的產(chǎn)率明顯降低，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，G1～G7的產(chǎn)率只有68.47%，主產(chǎn)物G5和G6的產(chǎn)率也僅為36.56%，相比10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)降低了33.47%。

2.2 底物濃度對直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)物組成的影響

不同濃度玉米淀粉酶解24 h時(shí)產(chǎn)物中直鏈麥芽低聚糖組成如表1所示。玉米淀粉經(jīng)Bst-MFA酶酶解后，產(chǎn)物以G5和G6為主，體系中還存在部分G2和G3，以及少量的G1、G4和G7。玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由10%增加到45%的過程中，G1～G4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性差異，主產(chǎn)物G5和G6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而G7的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加；當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大至50%時(shí)，G1～G7中各小分子糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與45%質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系無顯著性差異，但G1～G7和主產(chǎn)物G5、G6的產(chǎn)率明顯降低。可見，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，Bst-MFA酶對玉米淀粉的酶解程度降低，導(dǎo)致主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降以及聚合度較大的線性低聚糖的增多。一方面，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，體系黏度增大導(dǎo)致Bst-MFA酶對淀粉酶解不充分；另一方面，Bst-MFA酶的作用方式在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)底物下可能存在差異，因此，有必要進(jìn)一步探究主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低的原因。

表1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)物組成的影響Table 1 Effect of the substrate concentration on product composition of malt oligosaccharide

注：表中同一列中不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水分子運(yùn)動(dòng)性的影響

氫核(1H)多為低場核磁共振技術(shù)的研究對象，根據(jù)1H在磁場中所具備的自旋特性，其將以非輻射的方式從高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，弛豫時(shí)間的測量多用氫質(zhì)子的橫向弛豫時(shí)間T2來表示，由于體系中氫質(zhì)子主要來源于水分子，故可以通過弛豫時(shí)間的變化來分析不同體系中水分子的運(yùn)動(dòng)特性[20]。在不同的反應(yīng)體系中T2弛豫時(shí)間的長短不同，證明質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境不同，即水分子的自由度不同。T2弛豫時(shí)間越短，表明水分的自由度越低，水分子與物質(zhì)結(jié)合越緊密；T2弛豫時(shí)間越長表明水分子的自由度越高，故可以通過測定不同體系的T2弛豫時(shí)間來間接表明體系中水分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[21]。習(xí)慣上將弛豫時(shí)間較短的水分子稱為結(jié)合水，這部分水一般通過氫鍵作用力與其他物質(zhì)結(jié)合在一起，結(jié)合水幾乎沒有流動(dòng)性；將弛豫時(shí)間較長的水分子稱為自由水，這部分水的流動(dòng)性較強(qiáng)，可以充當(dāng)反應(yīng)的介質(zhì)。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉在90 ℃下加熱30 min，用低場核磁共振儀的硬脈沖回波序列CPMG分析不同體系樣品中水分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，通過反演擬合發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉均表現(xiàn)出兩個(gè)不同的自旋-自旋弛豫時(shí)間，說明體系中存在兩種流動(dòng)性不同的水分，T21表示與玉米淀粉分子緊密結(jié)合的水分的橫向弛豫時(shí)間，即結(jié)合水的自旋-自旋弛豫時(shí)間，結(jié)合越緊密弛豫時(shí)間越短，水分子的流動(dòng)性越差；T22表示體系中流動(dòng)性較強(qiáng)的自由水的自旋-自旋弛豫時(shí)間[22]。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉在90 ℃下保溫30 min后質(zhì)子的弛豫時(shí)間如圖3所示。結(jié)合水的橫向弛豫時(shí)間T21隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸下降(圖3-a)，表明隨著底物濃度的提高，玉米淀粉對水分子的束縛能力逐漸增強(qiáng)，水分子的流動(dòng)性逐漸降低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～40%時(shí)，T21高于25 ms，玉米淀粉對水分子的束縛作用較小，對Bst-MFA酶酶解玉米淀粉幾乎沒有影響；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于40%時(shí)，體系T21繼續(xù)降低，玉米淀粉對水分子的束縛作用明顯增強(qiáng)，嚴(yán)重阻礙了水分子的流行性，使得直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率明顯下降。

隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，自由水的橫向弛豫時(shí)間T22明顯下降(圖3-b)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)低于30%時(shí)，T22高于1 500 ms，Bst-MFA酶作用于玉米淀粉時(shí)有充足的自由水可以利用，自由水對Bst-MFA酶酶解反應(yīng)幾乎沒有影響，因此直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率較高，產(chǎn)物中主產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～40%時(shí)，反應(yīng)體系T22低于1 000 ms，自由水含量的減少使得Bst-MFA酶對玉米淀的酶解作用不夠充分，導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率降低；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于40%時(shí)，T22進(jìn)一步下降，說明體系中的自由水進(jìn)一步減少，不足以提供酶促反應(yīng)所需水分，導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率明顯下降，產(chǎn)物中主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉結(jié)合水T21和自由水T22的弛豫時(shí)間Fig.3 The bound water T21 and free water T22 relaxation time of corn starch milk with different concentrations

2.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對液化過程中體系黏度的影響

Bst-MFA酶不能作用于生淀粉，故玉米淀粉必須經(jīng)過糊化才能被水解，隨著底物濃度的提高，糊化過程中體系黏度逐漸變大導(dǎo)致不能攪拌均勻，因此必須加入Bst-MFA酶進(jìn)行液化以降低體系的黏度。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉糊化、液化過程中體系黏度變化如圖4所示，隨著玉米淀粉初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其峰值黏度也逐漸升高，高黏度持續(xù)時(shí)間逐漸延長。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%和20%時(shí)，液化過程中體系黏度增幅較小，黏度對Bst-MFA酶作用的影響不顯著，這是因?yàn)榉磻?yīng)體系中水分子的橫向弛豫時(shí)間較長(圖3)，可為Bst-MFA酶酶解淀粉提供充足的水分；質(zhì)量分?jǐn)?shù)由20%逐漸增加到40%的過程中，液化液的峰值黏度增長迅速且高黏度持續(xù)時(shí)間明顯增長，黏度的增加使酶解體系不易攪拌和混合均勻，這可能是Bst-MFA酶酶解高質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉時(shí)酶解效率和產(chǎn)物產(chǎn)率降低的主要原因之一。與40%玉米淀粉相比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)玉米淀粉在糊化和液化過程中的黏度增加并不顯著，但高黏度持續(xù)時(shí)間明顯加長，且最終液化液的黏度高于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系。同時(shí)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，在淀粉糊化、液化過程中的黏度曲線(峰值黏度附近)會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象，這可能與高黏度下反應(yīng)體系未攪拌均勻有關(guān)。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至50%時(shí)，60 ℃時(shí)已較難攪拌與混合均勻，在糊化、液化過程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象導(dǎo)致黏度曲線無法測定，這可能是因?yàn)?0%的玉米淀粉由于水分含量過低，在糊化、液化過程中淀粉顆粒的天然半結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞程度較小，抗酶解性能增加[23]，從而導(dǎo)致Bst-MFA酶的酶解效率顯著降低。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉液化過程中黏度變化曲線Fig.4 Viscosity curves of corn starch milk at different concentrations during liquification注：曲線1,2,3,4,5,6分別表示玉米淀粉濃度為10%，20%，30%，35%，40%，45%。

2.5 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對液化產(chǎn)物相對碘藍(lán)值的影響

直鏈淀粉和支鏈淀粉均可以和I2形成絡(luò)合物[24]而顯色，因此淀粉酶解產(chǎn)物的碘藍(lán)值可以用來反映其與碘形成絡(luò)合物能力的強(qiáng)弱。通常，當(dāng)寡糖鏈的聚合度大于12時(shí)才可以和I2形成絡(luò)合物并顯色，且顯色強(qiáng)度與聚合度有關(guān)，因此，通過測定淀粉反應(yīng)過程中酶解產(chǎn)物的碘藍(lán)值，可以推斷淀粉水解產(chǎn)物的鏈段聚合度和分子量大小[25]，從而判斷玉米淀粉水解程度。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉酶解反應(yīng)過程中的相對碘藍(lán)值變化如圖5所示。通常，在玉米淀粉水解過程中，體系的相對碘藍(lán)值會(huì)迅速降低。BAILEY等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥芽糊精聚合度小于12時(shí)不能與I2結(jié)合顯色。由圖5可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，反應(yīng)過程中酶解產(chǎn)物的相對碘藍(lán)值迅速降低，反應(yīng)50 min后幾乎不能檢測樣品碘藍(lán)值，說明體系中水解產(chǎn)物的分子量較小、鏈長較短，淀粉分子已被充分水解。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，相同反應(yīng)時(shí)間樣品的相對碘藍(lán)值逐漸增加，當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～45%時(shí)，相同反應(yīng)時(shí)間各樣品相對碘藍(lán)值逐漸增加，但增幅相對較??；當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至50%時(shí)，淀粉酶解產(chǎn)物相對碘藍(lán)值明顯高于其他反應(yīng)體系，反應(yīng)120 min后水解產(chǎn)物相對碘藍(lán)值仍有11.08%。KONG等[26]用耐高溫α-淀粉酶液化不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，酶水解底物的模式表現(xiàn)出接近TAKA淀粉酶(嚴(yán)格內(nèi)切)的內(nèi)切作用模式，淀粉分子的內(nèi)鏈被攻擊，淀粉水解產(chǎn)物的相對碘藍(lán)值下降較快；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至45%時(shí)，酶對底物的作用模式更傾向于多重攻擊，即在反應(yīng)前期，酶更多地作用于淀粉分子的外鏈，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的相對碘藍(lán)值降低不明顯。由表1可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高時(shí)，最終產(chǎn)物中G7的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他低質(zhì)量分?jǐn)?shù)反應(yīng)體系，結(jié)合圖5相對碘藍(lán)值隨玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢，推測Bst-MFA酶作用于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的玉米淀粉時(shí)可能表現(xiàn)出與耐高溫α-淀粉酶相同的作用模式，其詳細(xì)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步分析。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉反應(yīng)過程中相對碘藍(lán)值的變化Fig.5 The relative blue value of corn starch milk at different concentrations during reaction

2.6 底物濃度對糖化過程中體系黏度的影響

Bst-MFA酶可以依次完成對玉米淀粉的液化和糖化過程來制備直鏈麥芽低聚糖[10]。不同濃度玉米淀粉糖化過程中體系黏度變化如圖6所示。在玉米淀粉糖化過程中，體系黏度逐漸降低，且隨玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，糖化過程中反應(yīng)體系的黏度下降速率逐漸加快。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～40%時(shí)，體系黏度一直處于較低水平，黏度對Bst-MFA酶水解玉米淀粉的影響并不明顯；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至45%時(shí)，糖化反應(yīng)前期體系黏度較大，反應(yīng)8 h后體系黏度明顯下降并趨于穩(wěn)定，黏度的降低使得Bst-MFA酶酶解玉米淀粉分子的速度加快，體系中直鏈麥芽低聚糖的含量逐漸增多；當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至50%時(shí)，糖化起始階段體系黏度高達(dá)1 925 mPa·s，為45%質(zhì)量分?jǐn)?shù)起始黏度的3.58倍，反應(yīng)12 h后體系黏度雖降為起始時(shí)的37.51%(722 mPa·s)并趨于穩(wěn)定，但穩(wěn)定后黏度仍明顯高于其他反應(yīng)體系。隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，糖化過程中黏度升高帶來的負(fù)面影響嚴(yán)重抑制了Bst-MFA酶對玉米淀粉的催化水解，導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率明顯降低。

圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉糖化過程中黏度曲線變化Fig.6 Viscosity curve of maltodextrin with different concentration during saccharification

3 結(jié)論

在Bst-MFA酶酶解玉米淀粉生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的過程中，玉米淀粉的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解反應(yīng)有重要影響，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉為底物的酶解反應(yīng)規(guī)律存在差異。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，玉米淀粉經(jīng)Bst-MFA酶水解24 h后產(chǎn)生的直鏈麥芽低聚糖和主產(chǎn)物G5、G6的含量均呈逐漸增加的趨勢，而直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率逐漸降低。玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由10%提高至45%時(shí)，產(chǎn)物中G1～G7的含量由91.25 mg/g增加至344.47 mg/g，提高了2.78倍，繼續(xù)提高質(zhì)量分?jǐn)?shù)至50%時(shí)，G1～G7的含量不再繼續(xù)增加；而玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由10%提高至50%過程中，酶解24 h后產(chǎn)物中G1～G7的產(chǎn)率由91.25%逐漸減少至68.74%，降低了24.67%。另外，隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，反應(yīng)24 h后產(chǎn)物中G5和G6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降，而G7等大分子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加。其主要機(jī)理是：隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，體系中淀粉分子密度變大，Bst-MFA酶與淀粉分子碰撞幾率增加，直鏈麥芽低聚糖含量逐漸升高，但底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加伴隨著液化和糖化過程中體系黏度的增大，水分子運(yùn)動(dòng)性降低，體系中的自由水明顯減少，導(dǎo)致Bst-MFA酶對玉米淀粉分子的水解不夠充分，直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率逐漸降低。另外，Bst-MFA酶在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉中的酶解作用模式可能存在差異，這也是導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)率降低的原因之一，還有待于進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。