牦牛乳清粉的功能特性

高瑞平，梁 琪*，白莉莉，石永祺

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

目前，全球乳制品加工排放的乳清液總產(chǎn)量約為（180～190）×106t/年，僅有約50%的乳清液被處理和使用，其中，被處理的乳清液中僅有30%用于生產(chǎn)乳清粉[1]。根據(jù)生產(chǎn)工藝[2]，乳清液通常分為甜乳清液、酸乳清液、咸乳清液和原乳清液。原乳清液是調(diào)節(jié)牛乳pH值至4.6，分離酪蛋白沉淀后剩余的液體部分；然而，乳品工業(yè)中最普遍的是甜乳清液，它來源于酶凝型干酪生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物，是國際上乳清液產(chǎn)量最大的一種。將乳清液濃縮、干燥制成的粉末狀產(chǎn)品稱之為乳清粉（whey powder，WP）。牦牛乳原乳清液和甜乳清液干燥之后的產(chǎn)品分別稱為牦牛原乳清粉（native yak whey powder，NYW）和牦牛甜乳清粉（sweet yak whey powder，SYW）。乳清粉總蛋白含量一般為11%～24%，乳糖含量小于60%，乳清粉中的乳清蛋白占牛乳總蛋白質(zhì)的0.7%，含有20 種氨基酸，在營養(yǎng)學(xué)上被稱為“蛋白之王”[3]。

牦牛乳作為我國青藏高原地區(qū)特有的優(yōu)質(zhì)乳源，蛋白質(zhì)含量（4.0%～5.9%）高于荷斯坦牛乳蛋白含量（2.3%～4.4%）[4]。近年來，牦牛乳產(chǎn)量已增加至4 000 萬t[5]，約25%通過現(xiàn)代加工業(yè)生產(chǎn)[6]。國際上，荷斯坦牛乳加工干酪、酸乳、酪蛋白及乳粉等產(chǎn)品是形成乳清廢液的來源，隨著牦牛乳品企業(yè)的建立和加工量的增大，對牦牛乳清液的回收利用有利于降低生產(chǎn)成本，提高牦牛乳品企業(yè)的經(jīng)濟效益。目前，國內(nèi)外市場銷售的乳清產(chǎn)品主要是來源于荷斯坦牛乳的乳清粉，牦牛乳清產(chǎn)品在國內(nèi)外市場較為缺乏。學(xué)者們通過對荷斯坦乳清粉的化學(xué)組成和形態(tài)等理化指標的研究確定乳清粉的質(zhì)量特性[7]。Banavara等[8]研究甜乳清粉的pH值、蛋白質(zhì)含量、濁度、顏色和粒度分布等物理特性及溶解性、起泡特性等功能特性，發(fā)現(xiàn)起泡性能受甜乳清粉粒徑、亮度值影響較大，蛋白質(zhì)含量影響溶解性。

本研究采用酸沉淀和酶凝方式分別制取SYW和NYW，通過對總蛋白質(zhì)、乳糖、灰分含量和pH值等指標進行分析，同時對溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)進行研究，以期系統(tǒng)揭示牦牛乳清粉的功能性質(zhì)，為牦牛乳清粉加工產(chǎn)業(yè)和市場化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳采自甘肅天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)牧民家中；NYW為新鮮牦牛乳脫脂、酸沉淀分離酪蛋白制取的乳清液真空冷凍干燥之后得到；SYW為甘肅省功能乳品工程實驗室牦牛乳硬質(zhì)干酪制作過程中收集的甜乳清液直接真空冷凍干燥制?。贿M口荷斯坦乳清粉（Holstein whey powder，HW）為市售；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SP-723紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SH220N石墨消解儀 濟南海能儀器有限公司；SKD-200凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機、XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；QL-866旋渦混合器 江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L500醫(yī)用離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

NYW的制備：牦牛酸乳清液由鮮牦牛乳10 000 r/min離心30 min脫脂，調(diào)節(jié)pH值至4.6進行等電點沉淀，3 500 r/min離心20 min，收集上清液，真空冷凍干燥制得。

SYW的制備：實驗室硬質(zhì)干酪制作過程中收集乳清廢液，真空冷凍干燥制得。

1.3.2 牦牛乳清粉主要組成測定

蛋白質(zhì)總量測定：參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法；乳糖含量測定：參考SNT 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定方法》中的分光光度計法；灰分含量測定：參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；乳清粉溶液酸度采用pH計法進行測定。

1.3.3 牦牛乳清粉功能指標測定

1.3.3.1 溶解性的測定

配制質(zhì)量濃度5 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液，25 ℃恒溫振蕩1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液。用凱氏定氮法測上清液的蛋白質(zhì)含量，每個樣品重復(fù)實驗3 次，溶解性按照公式（1）計算[9]。

式中：C1為上清液中蛋白質(zhì)含量/（g/100 g）；C為樣品中蛋白質(zhì)含量/（g/100 g）。

1.3.3.2 持水性和持油性的測定[10]

持水性：用預(yù)先稱質(zhì)量后的離心管準確稱取2.0 g樣品，緩慢加水，每加幾滴水，就用旋渦混合器混合幾分鐘，直至樣品呈漿狀且無水析出時為止；于10 000 r/min離心3 min，倒去上層清液，稱質(zhì)量；離心后若無上清液，再加水攪勻離心，直至離心后有少量上清液為止。持水率按照公式（2）計算。

式中：m1為空試管的質(zhì)量/g；m2為試管加樣品的質(zhì)量/g；m3為沉淀物加試管的質(zhì)量/g。

持油性：將1 g（精確到0.001 g）樣品溶于含25 mL大豆色拉油的離心管，用旋渦混合器混合30 s；油混合物在4 200 r/min的條件下離心分離30 min，測定分離出的油體積。持油率以每克蛋白質(zhì)樣品吸收油的毫升數(shù)表示，按照公式（3）計算。

式中：V0為25 mL；V1為離心分離出油的體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3.3 起泡性的測定

取40 mL 2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液，用內(nèi)切式高速分散器10 000 r/min攪打1 min，快速將泡沫轉(zhuǎn)移至量筒中，測量攪打后的泡沫體積和靜止10 min時的泡沫體積。起泡能力用經(jīng)攪打后蛋白質(zhì)分散物的體積增加量表示，起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別按照公式（4）～（5）計算[11]。

式中：V0為攪打后泡沫的體積/mL；V10為放置10 min后的泡沫體積/mL；V為攪打前樣品溶液的體積/mL。

1.3.3.4 乳化性的測定

取2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液21 mL，邊攪拌邊加入純大豆色拉油9 mL，然后以10 000 r/min的速度高速勻漿1 min制成乳狀液；乳狀液放置10 min時小心地從玻璃容器底部取100 μL乳化液加入到5 mL、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，混勻，利用紫外-可見分光光度計于500 nm波長處測量其吸光度，用0.1%的SDS溶液為空白調(diào)零。采用乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）來表示乳化特性。EAI是指在乳化體系中每克蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的界面面積的大小，ESI是指蛋白質(zhì)持油水混合不分離的乳化特性對外界條件的抗應(yīng)變能力。EAI和ESI分別按照公式（6）～（7）計算[12]。

式中：ρ為樣品溶液質(zhì)量濃度（2 g/100 mL）；φ為油相所占的體積分數(shù)（2%）；A500nm為500 nm波長處的吸光度；n為樣品稀釋倍數(shù)；A0為0時刻的吸光度；A10為10 min后的吸光度。

1.3.3.5 熱穩(wěn)定性的測定

測定依據(jù)是熱處理時蛋白質(zhì)在溶液中的溶解程度。將2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液分別在60、65、70、75、80、85、90、95 ℃水浴中加熱30 min；取出后立即冰浴2 min，恢復(fù)至室溫；然后稱取熱處理后的溶液于2 500 r/min離心10 min，倒出上層溶液，稱取下層沉淀物質(zhì)量，按照公式（8）計算沉淀率[13]。沉淀率越大，穩(wěn)定性越差。

式中：m1為下層沉淀物質(zhì)量/g；m為溶液中總蛋白量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件統(tǒng)計，Origin 2018軟件作圖，最終實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳清粉主要成分分析

表1 牦牛乳清粉的主要成分Table 1 Main components of yak whey powder

由表1可知，NYW和SYW的總蛋白質(zhì)含量存在顯著差異（P＜0.05），SYW的總蛋白質(zhì)含量為17.323%，比NYW高出3.433%，Alsaed等[14]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦原乳清液總蛋白質(zhì)含量和甜乳清液總蛋白質(zhì)含量存在類似差異。甜乳清液是酶凝型硬質(zhì)干酪的副產(chǎn)物，在干酪生產(chǎn)中添加凝乳酶促進酪蛋白凝乳，凝乳期間凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，產(chǎn)生p-κ-酪蛋白和糖巨肽（glyco macro peptide，GMP），p-κ-酪蛋白附著在酪蛋白膠束的表面進入干酪中，而GMP則保留在乳清液中，使甜乳清液總蛋白含量升高。HW的總蛋白質(zhì)含量最低，為11.620%，與NYW、SYW均差異顯著（P＜0.05）。NYW和SYW灰分含量差異顯著（P＜0.05），NYW比SYW高出3.156%，Alsaed等[14]也發(fā)現(xiàn)，荷斯坦原乳清液和甜乳清液灰分含量差異顯著（P＜0.05）。有研究指出，pH值影響荷斯坦乳清液中的礦物質(zhì)含量，主要是由于pH值對磷酸鈣鹽平衡產(chǎn)生不同程度的影響，溶液pH值為7.2時，乳清液中H2PO4-的含量最高，達到75%，當pH值降至5.0～6.2，導(dǎo)致H2PO4-含量增加，破壞了磷酸鈣鹽平衡，導(dǎo)致大量的磷酸鹽和鈣鹽溶解在乳清液中，當pH值小于5.0時，這種變化趨勢更明顯[15]。HW灰分含量最低，為4.766%，顯著低于NYW和SYW（P＜0.05），LI Haimei等[5]測定表明，牦牛原料乳礦物質(zhì)總量高于荷斯坦原料乳。

2.2 牦牛乳清粉溶解性分析

圖1 牦牛乳清粉的溶解性Fig. 1 Solubility of yak whey powder

溶解性是物質(zhì)的固有特性，乳清粉的溶解性影響其在乳化和起泡等方面的應(yīng)用[16]。由圖1可知，NYW和SYW溶解性有顯著差異（P＜0.05），SYW的溶解性比NYW高出7.128%。溶解性受到乳清粉pH值對β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）聚合形式的影響，Cheison等[17]研究指出，牛乳pH值對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)起決定性作用，尤其是對β-Lg的結(jié)構(gòu)影響較大，β-Lg占乳清蛋白的50%以上，其聚合物形式?jīng)Q定溶解性大小，當溶液pH值在5.1～7.0時，β-Lg主要以二聚體形式存在，此形式下β-Lg的溶解性高，而pH值在3.7～5.1時，β-Lg生成八聚體聚合物，溶解性較低。

2.3 牦牛乳清粉持水性及持油性分析

由圖2可知，N Y W的持水率顯著高于S Y W（P＜0.05），最高值達到45.2%，持油率顯著低于SYW（P＜0.05），SYW的持油率為4.073 mL/g。生產(chǎn)干酪的原料乳要經(jīng)過巴氏殺菌的熱處理，甜乳清液中β-Lg和κ-酪蛋白相互作用產(chǎn)生影響；一些學(xué)者指出，熱處理使荷斯坦乳清粉中β-Lg部分變性，變性的乳清蛋白與酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白通過巰基-二硫鍵交聯(lián)形成聚合物，蛋白質(zhì)分子疏水基團暴露出來并重新排列，疏水相互作用增強，蛋白質(zhì)和水結(jié)合能力下降，從而改善SYW的持油能力，但同時降低SYW的持水能力[18-19]。本研究中市售HW的持水率和持油率最低，分別為15.5%和2.223 mL/g。

圖2 牦牛乳清粉的持水性及持油性Fig. 2 Water-holding capacity and oil-holding capacity of yak whey powder

2.4 牦牛乳清粉起泡性及泡沫穩(wěn)定性分析

圖3 牦牛乳清粉的起泡能力及泡沫穩(wěn)定性Fig. 3 Foaming ability and foam stability of yak whey powder

由圖3可知，NYW和SYW的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均存在顯著性差異（P＞0.05），差值分別為2.33 mL和6.946%，HW由于起泡量太少不進行對比。造成起泡能力差異性的主要原因有2 個，其一是NYW和SYW的總蛋白質(zhì)含量存在顯著差異（P＜0.05），Martinez-Padilla等[20]發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質(zhì)含量的荷斯坦乳清蛋白起泡能力不同，起泡能力隨著乳清蛋白含量的增加而提高，這是由于隨著蛋白質(zhì)含量增加，空氣-水界面的蛋白質(zhì)吸附能力增強，乳清蛋白中的β-Lg競爭性分布在空氣-水界面，起泡能力增強。Kamath等[21]也指出，蛋白質(zhì)含量較高時，空氣-水界面吸附的蛋白質(zhì)含量較高，形成較厚的黏彈性膜，泡沫不易發(fā)生破裂，泡沫穩(wěn)定性增強。其二是乳清液來源不同造成SYW泡沫穩(wěn)定性的差異性，Kamath等[21]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理過程中，變性乳清蛋白和κ-酪蛋白形成膠束物質(zhì)，改善荷斯坦乳清蛋白的泡沫穩(wěn)定性，這是由于形成的膠束物質(zhì)分散在泡沫空氣-水界面，界面黏性增強，形成的黏彈性膜穩(wěn)定性較好，不易受外界條件影響。

2.5 牦牛乳清粉乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析

圖4 牦牛乳清粉的乳化活性及乳化穩(wěn)定性Fig. 4 Emulsifying activity and emulsion stability of yak whey powder

乳化性是蛋白產(chǎn)品的重要功能特性之一，對產(chǎn)品最終形成穩(wěn)定的乳液體系發(fā)揮重要作用[22]。由圖4可知：NYW和SYW的EAI和ESI均有顯著性差異（P＜0.05），SYW的EAI為2.399 m2/g，ESI達45.87%，與NYW的差值分別為0.338 m2/g和12.534%；HW的ESI比牦牛乳清粉低，為30.137%。Ye Aiqian[23]研究荷斯坦乳清蛋白乳化特性后指出，蛋白質(zhì)含量決定乳液穩(wěn)定性大小，含量越高，EAI和ESI越高。此外，熱處理會改善乳液穩(wěn)定性，熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，聚集體可能會限制表面蛋白的有效擴散和重排，從而提高乳液穩(wěn)定性。這同時闡述了SYW的乳化活性和乳化穩(wěn)定性較好的原因。

2.6 牦牛乳清粉熱穩(wěn)定性分析

圖5 牦牛乳清粉的熱穩(wěn)定性Fig. 5 Thermal stability of yak whey powder

熱處理廣泛應(yīng)用于牛乳加工過程，以延長乳制品的貨架期，乳清蛋白是一種熱不穩(wěn)定性物質(zhì)，在熱處理過程中極易發(fā)生變性[24]，本研究探究牦牛乳清蛋白在60～90 ℃的熱穩(wěn)定性。由圖5可知：NYW和SYW在60 ℃條件下的沉淀率分別為0.055%和0.077%，說明牦牛乳清粉60 ℃時開始發(fā)生變性；NYW和SYW在75 ℃以后沉淀率均顯著增高，85 ℃時達到最大值，分別為0.151%和0.175%，隨后沉淀率均變化不顯著（P＞0.05），表明NYW和SYW在85 ℃最不穩(wěn)定，易產(chǎn)生沉淀。不同的處理溫度會不同程度影響產(chǎn)品的功能性質(zhì)，Corredig等[25]研究70～90 ℃熱處理溫度下荷斯坦乳清蛋白和酪蛋白間的熱誘導(dǎo)機制后指出，熱處理溫度在75～90 ℃時，隨著熱處理溫度的升高，發(fā)生變性的荷斯坦乳β-Lg含量增加，變性的β-Lg和κ-酪蛋白膠束相互作用增強，當溫度達到90 ℃時，α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）開始變性，變性的α-LA和β-Lg不僅和κ-CN發(fā)生相互作用，它們之間也存在相互作用，這說明熱處理影響乳清蛋白結(jié)構(gòu)，從而改變?nèi)榍宓鞍椎墓δ苄再|(zhì)。Laleye等[26]研究表明，熱處理降低了荷斯坦乳清蛋白的熱穩(wěn)定性。HW在80 ℃時沉淀率最大，說明來源于荷斯坦牛乳的HW在80 ℃最不穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

NYW和SYW的總蛋白質(zhì)含量均顯著高于HW（P＜0.05），可以作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源應(yīng)用和開發(fā)。NYW和SYW的熱變性溫度為85 ℃，明顯高于HW的熱變性溫度（80 ℃）。SYW是回收利用干酪加工排放的乳清廢液，該乳清液經(jīng)歷了干酪加工前原料乳的巴氏殺菌熱處理，該處理有效提高了SYW的溶解性、持油性、起泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性。本研究表明，牦牛乳清粉營養(yǎng)價值高，功能特性突出，具有極好的應(yīng)用前景，研究結(jié)果為牦牛乳清粉的應(yīng)用和發(fā)展提供了重要理論依據(jù)。