基于UHPLC-QTOF-MS／MS 法分析玳玳花化學(xué)成分

饒 穎， 黃文平， 馮育林，3， 歐陽(yáng) 輝，3， 楊世林，，3?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌330006；3.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330006）

玳玳花為蕓香科植物玳玳花Citrus aurantium L. var.amara Engl 的花蕾，亦叫枳殼花、酸橙花；大多數(shù)分布于長(zhǎng)江以南如江蘇、浙江、廣東等地區(qū)，曾收載于1977版《中國(guó)藥典》 及 《福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》［1-2］。 據(jù)文獻(xiàn)記載，玳玳花有調(diào)氣疏肝、 理氣寬胸、 開(kāi)胃止嘔等功效，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、改善免疫及抗肝損傷等作用［3-5］，亦有江蘇、浙江等地民間多于立夏前后，摘取含苞待放的花朵， 用微火烘干， 代茶飲，有藥食同源之功效［6-8］。而目前，對(duì)玳玳花的化學(xué)成分開(kāi)發(fā)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，為明確其化學(xué)成分，為闡釋該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)， 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UPLC-QTOF-MS／MS 技術(shù)，對(duì)玳玳花的化學(xué)成分進(jìn)行定性研究。該方法簡(jiǎn)單快捷， 避免粗提、 純化的繁瑣過(guò)程，可用于玳玳花的質(zhì)量控制。

1 材料

島津LC-30 A 超高效液相色譜儀，包含在線脫氣機(jī)、高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱 （日本島津公司）；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀，配備ESI 離子源及Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、Peak View 數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB Sciex 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博公司），KQ-400DB 型超聲清洗機(jī)（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）， AL204 型電子分析天平［Mettler Toledo 儀器（上海） 有限公司］。

對(duì)照品秦皮乙素（批號(hào)110741-201708）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703）、異葒草素（批號(hào)140926-201109）、槲皮苷（批號(hào)111538-201606）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)112007-201602）、蕓香柚皮苷（批號(hào)110722-201714）、柚皮苷（批號(hào)110722-201714）、3，5-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)111782-201706）、4，5-二咖啡?？鼘幩?（批號(hào)111894-201102）、新橙皮苷（批號(hào)110721-201617）、橙皮苷（批號(hào)110721-201617）、 山 柰 酚 （110861-201611）、 槲 皮 素（批號(hào)100081-201610）、芹菜素（批號(hào)111901-201603）、大黃酸（批號(hào)110757-201607）、銀杏內(nèi)酯A（批號(hào)110862-201612），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。奎寧酸（批號(hào)BCTG-170303）、白蠟樹(shù)苷（批號(hào)BCTG-160512）、二氫咖啡酸 （批號(hào)BCTG-160402）、隱綠原酸 （批號(hào)BCTG-170407）、3，4-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)BCTG-150201）、4-羥基肉桂酸 （批號(hào)BCTG-150803）、異夏佛托苷 （批號(hào)BCTG-160702）、木 犀 草 素-7-O-葡 萄 糖 苷 （批 號(hào)BCTG-160723）、蝶豆寧 （批號(hào)BCTG-150323）、圣草酚 （批號(hào)BCTG-160213），均購(gòu)于江西本草天工科技責(zé)任有限公司。玳玳花（浙江嘉興，批號(hào)170329）。乙腈、甲酸色為譜純，水為超純水，其余均為分析純。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 采用Shim-Pack XR C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0.01 ～4 min，2%B；4 ～6 min，2%～5%B；6～10 min，5%～10%B；10～20 min，10%～20%B；20～30 min，20%～28%B；30 ～45 min，28%～70%B；45 ～50 min，70%B；50～52 min，70%～2%B；52 ～60 min，2%B）；體積流量0.25 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍為m／z 100～1 200；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度600 ℃；氣簾氣172.36 kPa；霧化氣和輔助氣344.74 kPa；去簇電壓 （DP）120 V；采用TOF-MS-IDAMS／MS 方法采集數(shù)據(jù)，TOF／MS 一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描TOF／MS／MS 離子累積時(shí)間分別為500、200 ms；CE碰撞能量為-38 eV。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密取各對(duì)照品適量，分別加甲醇配制成0.2 mg／mL 的溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備 取玳玳花粉末（過(guò)4 號(hào)篩）0.3 g，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流30 min，放冷，過(guò)濾，濾液置8 000 r／min離心機(jī)中離心，過(guò)0.22 μm 濾微孔濾膜，即得。

3 結(jié)果與分析

3.1 化學(xué)成分鑒定 UHPLC-QTOF-MS／MS 法對(duì)玳玳花成分進(jìn)行定性分析，質(zhì)譜總離子流圖見(jiàn)圖1。結(jié)合樣品中各色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)、分子式及碎片峰信息，推測(cè)了各色譜峰可能的結(jié)構(gòu)。主要色譜峰的保留時(shí)間，質(zhì)譜信息，推測(cè)的分子式，化合物及其碎片離子歸屬等見(jiàn)表1。

圖1 負(fù)離子模式總離子流圖

表1 化學(xué)成分分析

續(xù)表1

續(xù)表1

3.2 成分分析

3.2.1 酚酸類 峰9 的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，表明［M-H］離子為m／z179.034 7，Peakview1.2 軟件給出其元素組成（預(yù)測(cè)分子式） 為C9H8O4，誤差為-1.4；二級(jí)碎片離子峰m／z 為161.029 0，135.045 2，107.049 7，79.056 5；根據(jù)對(duì)照品信息比對(duì)可以鑒定峰9 為咖啡酸見(jiàn)圖2。在二級(jí)質(zhì)譜中，峰9 產(chǎn)生的碎片離子主要為135.045 2，進(jìn)一步證明峰12 物質(zhì)母核結(jié)構(gòu)上羥基縮合脫水，得到m／z 161.029 0碎片離子，同時(shí)側(cè)鏈上失去CO2和苯環(huán)上失去CO，而產(chǎn)生碎片離子135.045 2 和107.049 7。同理［9-12］鑒定了峰4、11 等。

3.2.2 香豆素類 峰8 的主要產(chǎn)生m／z 為177.019 3 的［M-H］離子，二級(jí)質(zhì)譜有161.031 5，149.022 5，133.030 3，105.043 0 的碎片離子，主要裂解見(jiàn)圖3；通過(guò)對(duì)照品信息，推測(cè)可能為秦皮乙素。根據(jù)上述裂解途徑，通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)［13-15］，同理鑒定了峰23。

3.2.3 黃酮類 峰35 的母離子m／z 609.1854，發(fā)現(xiàn)二級(jí)489.142 8，343.082 5，301.071 3，主要裂解見(jiàn)圖4；根據(jù)ChemSpider 數(shù)據(jù)庫(kù)及對(duì)照品信息，成分鑒定為橙皮苷。根據(jù)上述裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)［16］，同理鑒定了峰27、29、33、36 等。

3.2.4 其他成分 峰57 的母離子m／z 293.212 2，發(fā)現(xiàn)二級(jí)235.169 6，211.133 4，191.180 2，155.106 9，127.119 0，121.101 6，109.064 4，133.058 4，81.037 2，根據(jù)ChemSpider 數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)可能成分為13-HoTrE（r），根據(jù)上述裂解途徑及相關(guān)文獻(xiàn)［17］，同理鑒定了峰55、58。

圖2 咖啡酸裂解途徑

圖3 秦皮乙素裂解途徑

圖4 hesperidin 裂解途徑

4 討論

玳玳花自古以來(lái)都是重要的既能治療疾病又能當(dāng)日常涼茶飲用的藥材，具有多種藥理活性，但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚缺少研究。本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-QTOF-MS／MS 聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)玳玳花中的58 種化學(xué)成分，其分析時(shí)間短，溶劑消耗少，分離效果及分析效率大幅度提升；可以提高保留時(shí)間重現(xiàn)性及色譜分辨率，有著超高分離度、超高靈敏度的特點(diǎn)。能夠快速對(duì)復(fù)雜的化學(xué)成分體系進(jìn)行分析［20-22］，是目前研究、推測(cè)中藥成分的有效手段。

本研究運(yùn)用UHPLC-QTOF-MS／MS 技術(shù)對(duì)玳玳花進(jìn)行化學(xué)成分分析鑒定尚屬首次，其化學(xué)成分主要為黃酮和酚酸類，多是既能治療疾病又是能提高人體免疫力的基礎(chǔ)物質(zhì)，例如黃酮類的柚皮苷，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌及抑制眼醛糖還原酶的等作用，在臨床上能用于降低血膽固醇、減少血栓的形成，改善局部微循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)供給，亦防治心腦血管等疾病［23］。山柰酚具有良好的抗菌活性，能有效地抗感染及抑制炎癥因子，臨床上多用來(lái)防治糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，均有良好的療效［24］，這些成分都為玳玳花在抗炎、抗氧化、改善免疫及抗肝損傷等作用提供較好的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為玳玳花的質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇及藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，并為后續(xù)玳玳花藥理作用研究及其機(jī)制研究提供了詳實(shí)的數(shù)據(jù)支撐，對(duì)其保健開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。