大薊止血片HPLC 指紋圖譜研究

沈丹萍， 詹常森， 姜 鵬

（上海和黃藥業(yè)有限公司，上海中藥固體制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，上海201401）

大薊止血片由大薊和干姜2 味藥材組成，主要功效為涼血、止血，臨床應(yīng)用于婦女功能性子宮出血、子宮復(fù)舊不全等。處方大薊4 880 g、干姜120 g，大薊水提醇沉濃縮，干姜醇提濃縮， 兩者混合干燥， 加輔料壓制成1 000片。

大薊，為菊科植物薊Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分，有涼血止血、散瘀解毒消癰之功效［1］。大薊因抗出血被廣泛應(yīng)用于外傷性出血、高血壓和炎癥的治療［2］。大薊止血的主要藥效成分為黃酮類［3］，其中柳穿魚葉苷和蒙花苷促凝血、止血作用被較多報道［4-5］。干姜，為姜科植物姜Zingiber offcinale Rosc.的干燥根莖，有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲之功效，常用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微、寒飲喘咳［1］。干姜主要的有效成分為姜辣素［6-8］。

大薊止血片現(xiàn)檢測標準采用中藥部頒標準（WS3-B-2468-97-1），標準中質(zhì)量控制只有針對大薊的薄層鑒別。為了更加全面的控制大薊止血片質(zhì)量，以保障臨床用藥安全性，需進一步建立大薊止血片的質(zhì)量控制方法。

文獻已有大薊與干姜的指紋圖譜、含有量測定和化學成分分析方法的相關(guān)報道［1，9-14］，在此基礎(chǔ)上，本實驗結(jié)合大薊和干姜的主要藥效物質(zhì)，建立了大薊止血片指紋圖譜，較為全面控制大薊和干姜2 味藥材，同時解決了干姜量少檢測難問題，以期為進一步嚴格藥材和成品質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100（配有DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；AL204 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。乙腈、磷酸（色譜純，美國Tedia 公司）；Milli-Q純水儀（美國Millipore 公司）；其余所用試劑均為分析純。柳 穿 魚 葉 苷 對 照 品 （111728-201502）、 蘆 丁 對 照 品（100080-201409），均購自中國食品藥品檢定研究院；蒙花苷對 照 品 （I-009-140730）、 6-姜 辣 素 對 照 品 （J-019-140703），均購自上海遠慕生物科技有限公司；8-姜酚對照品（141015）、10-姜酚對照品（141127），均購自上海古朵生物科技有限公司。

1.2 樣品 本實驗收集了10 批大薊止血片（0.4 g／片，36 片／瓶）， 批 號 分 別 為 150522、 150527、 150610、150703、 150707、 150709、 150805、 150807、 150825、150827。以上樣品均由上海和黃藥業(yè)有限公司提供。大薊藥材購自江西樟樹天齊中藥飲片有限公司；干姜藥材購自上海封浜中藥飲片有限公司。

1.3 陰性樣品 缺大薊陰性樣品，取干姜36 g，精密稱定，按生產(chǎn)工藝要求提取濃縮干燥，加一定比例的輔料使?jié)M足大薊止血片要求質(zhì)量。缺干姜陰性樣品，取大薊1 464 g，精密稱定，按生產(chǎn)工藝要求提取濃縮干燥，加一定比例的輔料使?jié)M足大薊止血片要求質(zhì)量。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL／min；檢測波長0～65 min（330 nm）、65～125 min（240 nm）；進樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別取柳穿魚葉苷、蘆丁和蒙花苷對照品約10 mg，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚對照品約20 mg，精密稱定，用90%乙醇溶于25 mL 量瓶中，定容，作為貯備液置4 ℃冰箱避光保存。分別取對照品貯備液適量稀釋，制成混合對照品溶液，柳穿魚葉苷、蘆丁和蒙花苷質(zhì)量濃度均為50 μg／mL，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚質(zhì)量濃度均為100 μg／mL。

2.2.2 供試品溶液制備 取大薊止血片粉末20 g，放入50 mL 離心管中，精密稱定，加入10%乙醇30 mL，超聲30 min，3 000 r／min，離心20 min，去上清，處理2 次；殘渣加入30%乙醇30 mL，超聲30 min，3 000 r／min，離心20 min，去上清， 處理2 次； 殘渣繼續(xù)加入無水乙醇30 mL，超聲30 min，3 000 r／min，離心20 min，取上清，處理2 次，合并2 次無水乙醇提取液的上清，蒸干，用90%乙醇定容至5 mL，用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 陰性樣品溶液制備 取陰性樣品粉末各20 g，精密稱定，按“2.2.2” 項下方法制備陰性供試品溶液。

2.2.4 藥材溶液制備 分別取大薊、干姜粉末各0.5 g，精密稱定，按“2.2.2” 項下方法制備藥材供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取150522 樣品1 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，連續(xù)進樣6 次，以9 號峰（柳穿魚葉苷） 為參照峰，結(jié)果21 個共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.3%，相對峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取150522 樣品6 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，以9 號峰（柳穿魚葉苷） 為參照峰，結(jié)果21 個共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.2%，相對峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取150522 樣品1 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，分別于0、4、8、12、16、24 h 測定，以9 號峰（柳穿魚葉苷）為參照峰，結(jié)果21 個共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.3%，相對峰面積RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 共有峰標定 將10 批大薊止血片色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2009 版），以S1 為參照圖譜，平均數(shù)法生成對照圖譜見圖1，疊加圖譜見圖2。結(jié)果，共標定出21 個共有峰，以9 號峰為參照峰（S），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2。不同樣品相對保留時間的RSD 均小于0.3%；相對峰面積RSD在4%～25%之間。

表2 10 批樣品共有峰相對保留時間和相對峰面積

圖1 樣品對照指紋圖譜

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.4.2 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2009 版），對10 批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行分析，樣品與對照指紋圖譜的相似度結(jié)果見表3。由表可知，10 批樣品相似度在0.95 以上，表明該指紋圖譜具有代表性。

表3 10 樣品相似度

2.5 共有峰來源分析 大薊止血片只有2 味藥組成，通過大薊止血片樣品、缺樣陰性樣品和藥材三者色譜圖對比，分析共有峰來源見圖3～4。大薊止血片樣品與缺大薊樣品色譜圖對比，發(fā)現(xiàn)缺大薊樣品中未見峰1 ～11、峰13 ～14、峰16，表明14 個共有峰來源于大薊；再與大薊藥材色譜圖比較后，發(fā)現(xiàn)峰1～2、峰5、峰7～11，峰16 等9 個共有峰直接來源于大薊藥材，而峰3 ～4、峰6、峰13 ～14 等5 個共有峰來源于大薊生產(chǎn)過程產(chǎn)生。同理可知，峰12、峰17～21 等6 個共有峰直接來源于干姜藥材。峰15 來源于大薊與干姜。同時通過與對照品色譜圖對比后見圖5，發(fā)現(xiàn)峰8 為蒙花苷、峰9 為柳穿魚葉苷、峰12 為6-姜辣素、峰17 為10～姜酚。

3 討論

3.1 檢測波長選擇 根據(jù)文獻報道大薊主要紫外吸收為330 nm［9］，干姜240 nm［12-13］。因而在同一條件下，對比330、240 nm 波長下檢測到的液相圖譜，發(fā)現(xiàn)330 nm 波長下檢測不到干姜的成分，而在240 nm 波長下基線不穩(wěn)，且色譜峰雜，峰形不好。根據(jù)大薊和干姜各自色譜峰的出峰情況， 較合適的檢測為前65 min， 檢測波長330 nm，65 min至檢測結(jié)束，檢測波長240 nm。

3.2 提取條件選擇 根據(jù)工藝及檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大薊中的化學成分極性較大，而干姜中的化學成分極性較小，兩者極性差異較大；另外兩者含有量在大薊止血片中差異很大，大薊為主要藥材，大薊止血片中達到95%以上，干姜可以忽略不計?；诖耍捎煤唵蔚臉悠诽幚矸椒ú荒軝z測到干姜的成分，因此經(jīng)過多次試驗后發(fā)現(xiàn)，先用10%乙醇提取，中間用30%乙醇提取，最后采用無水乙醇提取，這樣2 種藥材中的成分均可檢測到。

本研究發(fā)現(xiàn)，10 批樣品21 個共有峰相對保留時間差異較小，表明色譜峰出峰穩(wěn)定；從峰面積變化程度來看，各批次21 個共有峰中有多個色譜峰相對峰面積變化較大，表明不同批次各成分個體的相對量上有差異性。但指紋圖譜的建立是基于整體上辨認樣品的真實性，樣品間的差異并沒有影響到大薊止血片指紋圖譜整體面貌的“共性特征”，不影響真實性判斷。這些個體成分量上的差異對指紋圖譜整體相似度影響不大。

圖3 大薊止血片共有峰歸屬分析圖

圖4 大薊止血片共有峰歸屬分析圖

圖5 對照品色譜圖

本實驗利用HPLC-UV 對大薊止血片進行分析，建立了大薊止血片指紋圖譜，既反應(yīng)了大薊成分，也反應(yīng)了干姜成分，較全面的控制大薊止血片質(zhì)量，還可通過指紋圖譜反應(yīng)不同批次間量的差異，對其質(zhì)量控制具有一定意義。