基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)左金丸治療胃潰瘍的機(jī)制

卜雕雕， 蘇 卓， 張 丹， 柏?；?， 王昌利

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712046）

左金丸源自《丹溪心法》，由吳茱萸、黃連（6 ∶1） 組成，前者功效散寒止痛、降逆止嘔，屬于熱性藥；后者功效清熱瀉火解毒，屬于寒性藥。臨床常將兩者配伍使用，兩藥一辛一苦、一熱一寒、一升一降，相輔相成共同發(fā)揮藥效，組成左金丸后具有清熱瀉火解毒、降逆止嘔、散寒止痛功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究對(duì)左金丸的研究較少，主要集中在 慢 性 胃 炎［2］、 胃 腸 疾 ?。?］、 消 化 道 潰瘍［4］等，以抗?jié)優(yōu)橹鳌Ｆ渲?，胃潰瘍屬于消化性潰瘍，是指在胃角、賁門(mén)、胃竇和裂孔疝等部位發(fā)生的潰瘍，其致病因素包括胃酸增多、黏膜破壞、遺傳、飲食、藥物、吸煙、全身性疾病、精神疾病等。

中藥普遍有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，導(dǎo)致研究其治病機(jī)制時(shí)存在困難。2007 年，英國(guó)藥理學(xué)家Hopkins 首次提出“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)” 的概念［5］，它對(duì)藥物-藥物、藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，不局限于單一成分、單一靶標(biāo)、單一疾病，可闡明中藥“多組分-多成分-多靶點(diǎn)-多環(huán)節(jié)” 的特點(diǎn)，對(duì)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展產(chǎn)生積極推動(dòng)作用［6］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)左金丸治療胃潰瘍的機(jī)制進(jìn)行研究，為其發(fā)揮臨床療效提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 成分收集 在中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)［7］（TCMSP，http： ／／lsp. nwu. edu. cn／tcmsp.php） 輸入“吳茱萸” “黃連” 收集兩者成分，選擇口服生物利用度（OB） ≥30%和藥物相似性（DL） ≥0.18 者作為篩選出的活性成分［8］。在ChemDraw Pro 16.0 中畫(huà)出活性成分結(jié)構(gòu)式，保存為MDL Molfile（. mol） 格式，利用OpenBabel軟件中的convert 功能將上述格式轉(zhuǎn)化為Sdf-MDL MOL format 備用［9］。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 進(jìn)入Swiss Target Prediction （http： ／／www. swisstargetprediction. ch／） 數(shù)據(jù)庫(kù)，在繪圖區(qū)粘貼上述Sdf-MDL MOL format 格式文件，點(diǎn)擊Import-Predict the target 即可輸出化合物靶點(diǎn)信息［10］。在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的藥物靶點(diǎn)命名存在不規(guī)范問(wèn)題，故把所有靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt（https： ／／www.uniprot.org／） 數(shù)據(jù)庫(kù)中，輸入靶點(diǎn)蛋白名稱限定物種為“Homo sapiens”，將所有蛋白名稱均校正為其官方名稱（official symbol）。將所得吳茱萸、黃連主要活性成分的靶點(diǎn)與pharm GKB（https： ／／www. pharmgkb. org／）、CTD（http： ／／ctdbase. org／）、 GeneCards （https： ／／www.genecards.org／） 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到的與胃潰瘍有關(guān)的靶點(diǎn)比對(duì)分析，篩選左金丸治療胃潰瘍可能潛在的靶點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)類型歸屬 DisGeNET （http： ／／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／search） 是一個(gè)包含與人類疾病相關(guān)的基因和變體集合的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，將“1.2” 項(xiàng)下潛在靶點(diǎn)輸入DisGeNET，得到靶點(diǎn)類型（Protein Class）。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將所得左金丸作用靶點(diǎn)導(dǎo)入string 數(shù)據(jù)庫(kù) （https： ／／string-db.org／）［11］，選擇Multiple protein， 限定物種為人，得到蛋白相互作用，導(dǎo)出node1、node2、Combined score 值導(dǎo)入cytoscape 軟件，并設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小及顏色反應(yīng)degree 值、score 值，最終得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 將30 個(gè)左金丸治療胃潰瘍的潛在靶點(diǎn)通過(guò)cytoscape 的ClueGO 插件進(jìn)行GO 生物學(xué)功能分析，將靶點(diǎn)輸入DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery） 進(jìn)行KEGG 通路分析。以P＜0.05 為篩選條件，得到相關(guān)分析結(jié)果。

1.6 左金丸活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用cytoscape3.6.1 軟件中的Merge 功能，構(gòu)建藥材-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。其中，節(jié)點(diǎn)（node） 代表藥材、活性成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路，邊（edge）用來(lái)連接單味藥、活性成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇上述網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前5 的靶點(diǎn)，查找其PDB ID，輸入systems Dock Web Site（http： ／／systemsdock.unit.oist.jp／iddp／home／index） 中與左金丸治療胃潰瘍的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，保存結(jié)果，用其Docking Score 評(píng)價(jià)化合物和靶點(diǎn)的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 左金丸活性成分篩選 通過(guò)TCMSP 搜索到吳茱萸176 種活性成分，其中OB≥30、DL≥0.18 的共30 種； 黃連48 種活性成分， 其中OB ≥30、DL≥0.18 者共14 種。去除重復(fù)成分，最終得到41 種，具體見(jiàn)表1。

2.2 左金丸活性成分靶點(diǎn)信息、 靶點(diǎn)類型歸屬 將潛在活性成分的Sdf-MDL MOL format 格式文件上傳到Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)吳茱萸和黃連活性成分的靶點(diǎn)，41 種活性成分對(duì)應(yīng)615 個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)的靶點(diǎn)后還剩余228 個(gè)。再應(yīng)用pharm GKB、CTD、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與胃潰瘍（Gastric ulcer） 相關(guān)的靶點(diǎn)，與上述228個(gè)靶點(diǎn)比對(duì)分析后，得到30 個(gè)治療胃潰瘍的潛在作用靶點(diǎn)，見(jiàn)表2，可知一個(gè)靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)多種化學(xué)成分，如TDP1 （14 個(gè)）、 CDK1 （8 個(gè)）、 CDK2（8 個(gè)）、CYP2D6（7 個(gè)）、ADRA2A（6 個(gè)） 等頻數(shù)較高。然后，將30 個(gè)靶點(diǎn)輸入DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶點(diǎn)類型的信息（表2），包括酶（水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、連接酶、激酶、蛋白酶等）、轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)錄因子、受體、核酸結(jié)合等，表明左金丸能通過(guò)不同靶點(diǎn)類型發(fā)揮藥效。

2.3 左金丸潛在靶點(diǎn)之間作用分析 利用string數(shù)據(jù)庫(kù)和cytoscape 軟件得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。由圖可知，該網(wǎng)絡(luò)圖中只用24 個(gè)靶點(diǎn)，其余靶點(diǎn)之間無(wú)相互作用，故網(wǎng)絡(luò)圖中未顯示；包含24 個(gè)節(jié)點(diǎn)、55 條邊，degree 值越大，節(jié)點(diǎn)越大，而Combine score 值越大，邊越粗，其中具有較大度 值 （degree ≥7） 的 蛋 白 質(zhì) 為 HSP90AA1、PTGS2、NOS3、MMP9，表明左金丸治療胃潰瘍可能通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)聯(lián)合共同發(fā)揮作用。

2.4 靶點(diǎn)生物學(xué)功能注釋 通過(guò)cytoscape3.6.1的ClueGo 插件對(duì)左金丸治療胃潰瘍潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物學(xué)功能分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，可知左金丸治療胃潰瘍的藥效機(jī)制可能與神經(jīng)遞質(zhì)代謝過(guò)程、四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)等有關(guān)。GO 屬于基因功能分類體系，有3 個(gè)分支， 即生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分，而左金丸治療胃潰瘍的靶點(diǎn)在生物過(guò)程中主要富集到氧化還原過(guò)程、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)調(diào)控、精氨酸分解過(guò)程等；細(xì)胞組成中富集到細(xì)胞器膜、細(xì)胞質(zhì)膜、管基底等離子體膜等；分子功能中富集到血紅素結(jié)合、一氧化氮合酶活性、鐵離子結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程，即涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。

表1 左金丸活性成分Tab.1 Active components of Zuojin Pills

表2 左金丸活性成分潛在靶點(diǎn)Tab.2 Potential targets for active components of Zuojin Pills

圖1 左金丸潛在靶點(diǎn)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of interactions among potential targets for Zuojin Pills

2.5 靶點(diǎn)通路注釋分析 圖3 顯示，13 個(gè)通路被富集，其中新陳代謝、氨基酸代謝通路2 條，包括Arginine biosynthesis、 Arginine and proline metabolism；新陳代謝、脂質(zhì)代謝通路1 條，包括Arachidonic acid metabolism；新陳代謝、外源性物質(zhì)生物降解和代謝通路1 條，包括Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450；人類疾病、癌癥通路4 條，包括Pathways in cancer、Chemical carcinogenesis、Small cell lung cancer、Prostate cancer；有機(jī)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)通路2 條，包括Ovarian steroidogenesis、 Progesterone-mediated oocyte maturation；有機(jī)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)通路1 條，包括Serotonergic synapse；環(huán)境信息處理、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路1 條，包括Calcium signaling pathway，表明左金丸治療胃潰瘍活性成分的靶點(diǎn)分布在多個(gè)通路中，從而協(xié)調(diào)發(fā)揮治療作用。

圖2 GO 生物學(xué)功能分析Fig.2 GO biological function analysis

圖3 KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 藥材-成分-靶點(diǎn)-通路圖 采用cytoscape 軟件的merge 功能構(gòu)建藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。由圖可知，該網(wǎng)絡(luò)有67 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括2 味中藥、32 種成分、20 個(gè)靶點(diǎn)、13 條通路） 和149條邊，節(jié)點(diǎn)越大，度越大，與其相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，其中吳茱萸次堿、β-谷甾醇、谷甾醇、槲皮素、廣 玉 蘭 內(nèi) 酯、 1-（5， 7， 8-trimethoxy-2， 2-dimethylchromen-6-yl） ethanone、icosa-11，14，17-trienoicacidmethylester、31-去甲基-9（11） -羊毛甾烯醇等度值較大，表明其作用靶點(diǎn)多。另外，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)越大，靶點(diǎn)度越大，與其相連的成分越多，而圖4 中PTGS2、CDK1、CDK2、NOS3、SLC6A4 等靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)較大，可能為藥物作用的靶點(diǎn)。

圖4 藥材-成分-靶點(diǎn)-通路圖Fig.4 Medicinal material-component-target-pathway diagram

2.7 分子對(duì)接 將圖4 中度值排名前5 的靶點(diǎn)CDK2 （PDB ID： 2R3I）、 PTGS2 （PDB ID：1Q4G）、CDK1（PDB ID：1X8B）、CYP2D6（PDB ID：1Z10）、HSD11B1（PDB ID：1XU9） 與41 種成分進(jìn)行分子對(duì)接， 結(jié)果見(jiàn)表3。 由表可知，docking score＞7 的有28 種（13.7%），介于5～7 的有129 種 （62.9%）， 介于4.25 ～5 的有24 種（11.7%），小于4.25 的有24 種（11.7%），由于大于4.25 時(shí)表示藥物分子與靶蛋白間存在結(jié)合能力，大于5.0 時(shí)表示結(jié)合活性較強(qiáng)，大于7.0 時(shí)表示結(jié)合能力極強(qiáng)［12］，而本研究中大于4.25 者占總數(shù)88.3%，即大部分靶點(diǎn)與成分的結(jié)合活性較好。

3 討論

左金丸常用于肝火犯胃證，臨床用于治療胃潰瘍、慢性胃炎等。方中黃連、吳茱萸含多種藥效成分，例如小檗堿對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)作用具有促進(jìn)作用，對(duì)胃腸黏膜具有較好的保護(hù)作用［13］；吳茱萸次堿具有濃度依賴性的肌肉松弛作用［14］，并且吳茱萸次堿能降低乙酰水楊酸誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的胃潰瘍指數(shù)，對(duì)于血漿中CGRP（降鈣素基因的相關(guān)肽） 濃度具有明顯的強(qiáng)作用，并能被辣椒素受體阻斷劑capsazepine（一種競(jìng)爭(zhēng)性辣椒素受體拮抗劑） 阻斷，表明該成分對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用可能是通過(guò)激動(dòng)辣椒素受體，從而對(duì)內(nèi)源性CGRP 釋放起到促進(jìn)作用［15］。楊炳友等［16］證實(shí)，吳茱萸多糖、吳茱萸內(nèi)酯對(duì)胃潰瘍有較好的治療效果，隨著劑量加大其抗?jié)冏饔靡搽S之增強(qiáng)，而且兩者可協(xié)同降低胃蛋白酶活性；黃連素抗菌譜廣，能殺滅幽門(mén)螺旋桿菌，同時(shí)可抑制胃酸分泌，對(duì)胃潰瘍有一定的治療效果［17］；李備［18］證實(shí)，黃連及其所含的生物堿可抑制胃酸分泌，改善胃黏膜血流供應(yīng)，提高胃黏膜屏障功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)體液，抑制致炎因子產(chǎn)生，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，從而保護(hù)胃黏膜，可作為治療消化性潰瘍的藥物。另外，黃連、吳茱萸按不同比例配伍后的藥效均比單味藥強(qiáng)，可抑制胃酸與胃蛋白酶活性，從而使胃黏液分泌增加，減輕攻擊因子對(duì)胃黏膜的損傷，從而增強(qiáng)“胃-黏液-碳酸氨鹽” 的屏障作用［19］。

本研究在GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，左金丸治療胃潰瘍的基因在生物學(xué)過(guò)程中主要富集到氧化還原過(guò)程、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)調(diào)控、精氨酸分解過(guò)程等；細(xì)胞組成富集到細(xì)胞器膜、細(xì)胞質(zhì)膜、管基底等離子體膜等；分子功能包括血紅素結(jié)合、一氧化氮合酶活性、鐵離子結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。前期報(bào)道，左金丸可通過(guò)抑制乙酰膽堿來(lái)引起Ca2+濃度的升高，從而進(jìn)一步抑制牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞分泌兒茶酚胺，后者過(guò)量時(shí)會(huì)引起胃黏膜血管萎縮，使黏膜血液流動(dòng)緩慢，誘發(fā)黏膜缺血和缺氧，最終導(dǎo)致潰瘍產(chǎn)生［20］；還可提高胃液pH 值，對(duì)胃黏膜攻擊因素具有降低作用，使其防御功能增強(qiáng)，促進(jìn)胃潰瘍愈合，最終有效預(yù)防大鼠胃潰瘍［21-22］。另外，NO 屬于神經(jīng)遞質(zhì)和信使分子，可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，在正常生理狀態(tài)下，少量NO 對(duì)胃黏膜微循環(huán)和黏液分泌具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而保護(hù)胃黏膜；在病理狀態(tài)下， 過(guò)量NO 會(huì)引起正?；虬l(fā)生突變［23］，與本研究結(jié)果吻合。

表3 分子對(duì)接結(jié)果Tab.3 Results of molecular docking

KEGG 通路富集分析時(shí)，富集到13 條P＜0.05者，其中5-羥色胺突觸、花生四烯酸代謝、癌癥途徑等通路與胃潰瘍相關(guān)。林科名等［24］證實(shí)，左金丸可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)，降低應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的腦、腎上腺組織中去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA） 等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度，其發(fā)揮抗應(yīng)激性胃潰瘍的作用機(jī)制是通過(guò)神經(jīng)體液途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的；花生四烯酸主要代謝產(chǎn)物是前列腺素 （PGs），具有保護(hù)胃黏膜的作用， 其中PGE2具有多種生物學(xué)功能，是局部保護(hù)胃黏膜的保護(hù)因素，一方面PGE2能使胃黏膜血流量、血管通透性、腺體黏液分泌增加，進(jìn)而使局部黏膜屏障功能增強(qiáng)［25］；另一方面能促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞再生，誘導(dǎo)黏膜基底細(xì)胞向表面移行，進(jìn)而對(duì)潰瘍面自身修復(fù)起到促進(jìn)作用［26］，與本研究結(jié)果吻合。

綜上所述，本研究構(gòu)建左金丸“藥材-成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路” 網(wǎng)絡(luò)圖，其中包括2 味中藥、32 種成分、20 個(gè)靶點(diǎn)、13 條信號(hào)通路，其中吳茱萸次堿、icosa-11，14，17-trienoic acid methyl ester、槲皮素、廣玉蘭內(nèi)酯等均有較大度值，可能是抗胃潰瘍的關(guān)鍵成分； 重組人周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、周期素依賴性激酶1 （CDK1）、細(xì)胞色素P450 2D6（CYP2D6）、人皮質(zhì)類固醇11β 脫氫酶同工酶1（HSD11B1） 在眾多靶點(diǎn)中擁有較高度值；5-羥色胺突觸、花生四烯酸代謝、癌癥途徑等通路是發(fā)揮抗胃潰瘍作用的主要潛在信號(hào)通路。由此可知，左金丸主要活性成分通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗胃潰瘍的作用，即有著“多成分-多靶點(diǎn)-多通路” 的特點(diǎn)，可為今后驗(yàn)證該制劑具體作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路提供依據(jù)。