真菌聯(lián)合稀堿預處理杜仲葉提取杜仲膠的工藝研究

劉佩巖 王思瑩 郭紫婧 趙修華

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

杜仲(EucommiaulmoidesOlive.)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)多年落葉喬木，又名扯絲皮、絲聯(lián)木，是我國特有的經濟樹種，同時也是國家珍貴的二類保護物種，其樹皮是我國名貴的滋補中藥，具有補肝腎、強筋骨、降血壓、利尿、安胎等藥用功效[1]，現(xiàn)代科學研究表明，杜仲除了具有藥理作用的成分外，其中的皮、葉、根和種子中都富含白色絲狀杜仲膠(Eucommiaulmoidesgum，EUG)，杜仲膠是一種天然高分子物質，其成分與東南亞的古塔波膠(gutta percha)和南美的巴拉塔膠(balata)一樣，均為反式-聚異戊二烯，但是天然的三葉橡膠為順式-聚異戊二烯[2]。杜仲膠存在于杜仲的樹葉、皮和種子中，成熟的杜仲籽中含有的杜仲膠最高，為10%～17%。據文獻報道，杜仲葉膠含量相對于杜仲皮和杜仲籽含量較低，理論上僅占杜仲葉干質量的1.55%～3.23%[3]。

在此之前，工藝不成熟的時候，杜仲皮的獲取需要伐木取皮，即便現(xiàn)在研究出“杜仲剝皮再生技術”，可是畢竟受到了杜仲樹資源的限制。但是杜仲樹是落葉樹，每年秋季會掉落大量的落葉，屬于可再生資源，我國杜仲林現(xiàn)已有20余萬hm2，1 hm2杜仲林葉產膠量約為150 kg[4]，因此杜仲葉不僅可以加工成保健茶，還可以利用其作為提取杜仲膠的主要原料，這很大程度上提高了杜仲的生態(tài)環(huán)境利用價值，使其成為一種具有潛力的天然資源[5～6]。

目前從杜仲植物組織中提取杜仲膠的一般方法主要有機溶劑浸提法如:苯、甲苯、石油醚、正己烷，還有植物細胞壁破除法如:纖維素酶處理、堿處理、機械力處理這兩類[7]。魏錦錦等[8]應用蒸汽爆破預處理杜仲皮來提取其中的杜仲膠與其他活性成分；周鵬等[9]在鹽酸作為催化劑的條件下運用乙酸預處理杜仲果殼從而提取杜仲膠；劉貴華等[10]直接應用纖維素酶進行預處理，進而從杜仲粕殼提取杜仲膠；謝曉婷等[11]用堿水解和酶解預處理杜仲葉渣，之后用石油醚作為溶劑提取杜仲膠。對于從杜仲植物組織中提取杜仲膠的研究還有很多，但是都存在應用有機溶劑用量大、用料成本高、實驗安全低，等諸多不足之處，所以在杜仲膠的提取工藝上還是要進行一些改進，本研究從原料的來源、工藝的安全、工藝流程綠色環(huán)保等各個方面，研究探索一種利用從杜仲葉中提取杜仲膠的方法，對杜仲葉的綜合開發(fā)利用有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

杜仲葉:產自安徽亳州，曬干后保存。綠色木霉:購自北京百歐博偉生物技術有限公司；超純水(實驗室自制)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 杜仲葉烘干

將已購的杜仲葉放置于50～60℃的烘箱中鼓風干燥12 h左右。

1.2.2 杜仲葉面角質層的去除

根據實驗與文獻報道[12]，NaOH的稀溶液能較好溶解角質層，同時NaOH的稀溶液對杜仲葉纖維素無作用，所以選用NaOH的稀溶液預處理杜仲葉的角質層。選用在75℃下、0.45%的NaOH、料液比1∶14、時間為120 min條件下可以對杜仲葉的角質層有很好的去除效果。而且蘇丹Ⅲ染色劑對植物的角質層有很好的染色效果，因此可以以此作為判定杜仲葉角質層是否去除完全的判定依據。

1.2.3 綠色木霉菌種活化與菌懸液的制備

按照菌種培養(yǎng)說明書，配置綜合馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基，經高壓蒸汽滅菌后，制成平板培養(yǎng)基，在無菌工作臺接種，在28℃下培養(yǎng)5～7 d，培養(yǎng)出菌絲綠色、生長健壯、濃密、無污染的菌種，放置于2～8℃環(huán)境中保存，為之后制備菌懸液做準備。斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基組成為:CMC-Na(7.5 g)，蛋白胨(5 g)吐溫-80(2 mL)，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2(0.3 g)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0.005 g)，MnSO4·H2O(0.001 6 g)，ZnSO4·7H2O(0.001 4 g)，CoCl2(0.002 g)，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃，滅菌20 min[12]。合成培養(yǎng)液?；|溶液成分為:NaCl(0.5 g·L-1)，MgSO4(0.5 g·L-1)，(NH4)2SO4(13 g·L-1)，KH2PO4(10.5 g·L-1)，CaCl2(0.3 g·L-1)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0.01 g·L-1)，MnSO4·7H2O(0.015 g·L-1)，ZnSO4·7H2O(0.015 g·L-1)，CoCl2(0.01 g·L-1)[13～17]。

菌懸液的制備。種子搖瓶培養(yǎng)。在250 mL三角瓶中加入100 mL種子培養(yǎng)基，取已活化的綠色木霉菌種一環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，150 r·min-1，振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.4 綠色木霉培養(yǎng)條件的優(yōu)化

表1 綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)正交試驗因素及水平

Table 1 Orthogonal test factors and levels of green trichoderma fermentation culture

水平LevelpH(A)固液比(B)Solid-liquid ratio接種量(C)Quantity of inoculation(%)時間(D)Time141∶10203251∶20255361∶50307

1.2.5 纖維素酶活力的測定與計算

用移液管準確吸取0.2 mL粗酶液于試管中，再加入已用pH=5.0的NaAC-HA緩沖液配置好的CMC-Na溶液1.8 mL，55℃水浴30 min，然后加2 mL DNS試劑，混勻并在沸水浴中水浴5 min，放置至室溫，定容到25 mL后于540 nm下測定其吸光值。最后按照DNS法測定還原糖量，再根據葡萄糖標準曲線計算纖維素酶的活力，單位酶活的計算如下:

(1)

式中：OD為酶液的吸光值；K為曲線斜率；n為稀釋倍數(shù)；T為反應時間(min)；1 000為mg換算成μg。

1.2.6 杜仲膠得率與含量及純度的計算

取的杜仲葉樣品5 g，置于250 mL燒杯中。加入100 mL石油醚，在85℃下攪拌提取1次(測定杜仲葉中杜仲膠的含量時提取次數(shù)為3～5次)，趁熱過濾，將燒杯放入-20℃環(huán)境中冷凍，待2 h左右后有白色沉淀析出，進行過濾，獲得杜仲粗膠，最后將杜仲膠粗品中加入丙酮溶液加熱回流2 h即可得到杜仲膠純品。過濾取沉淀在50～60℃鼓風干燥，獲得杜仲膠精膠。將濾液裝入500 mL圓底燒瓶中在55℃下減壓蒸餾，進行溶劑回收。提取完成之后，回收得到的石油醚可以重復利用于杜仲膠的提取。提取得率與含量的計算方法如下：

(2)

式中：η為杜仲葉樣品中杜仲膠提取得率(%);W1為最后得到杜仲葉樣品中杜仲膠的質量(g);W0為杜仲葉樣品的總質量(g)。

參照GB/T8086-2008《天然生膠雜質含量的測定》[18]測定。將所得杜仲膠分析天平準確稱取m0，用干凈干燥的三角燒瓶承裝備用，向三角燒瓶中加入適量含有2-硫醇基苯并噻唑的橡膠溶劑，通過加熱溶解樣品。然后用干燥后已知恒m1的孔徑為45 μm的濾篩過濾。最后，將裝有雜質的濾篩用石油醚浸泡15～20 min后取出瀝干，放置烘箱中烘干稱重m2。雜質含量的計算公式如下：

(3)

式中：m0為杜仲膠樣品的質量(g)；m1為空篩的質量(g)；m2為空篩和雜質的總質量(g)。

1.2.7 杜仲葉表面SEM觀測

選取適量的樣品，在50～60℃鼓風干燥備用。將上述烘干后的杜仲葉樣品通過導電膠粘到掃描電鏡樣品臺上。將附有樣品的樣品臺放置于BC-Ⅱ離子濺射儀中進行真空噴鍍，噴鍍時金靶材處于陰極，調整靶材和樣品臺合適的距離。電鏡觀察前處理完成后，放入場發(fā)射掃描電子顯微鏡中(型號為SU-8000 Hitachi)；嚴格按照掃描電鏡的觀測步驟調節(jié)燈絲飽和點、光闌對中、光闌合軸、消象散調節(jié)和聚焦觀測等步驟，選擇合適的倍數(shù)觀察，可獲得清晰的杜仲葉微觀表面形貌圖像。

1.2.8 杜仲膠的紅外光譜測定

對最終得到的杜仲膠進行紅外光譜的測定:由于制得的杜仲膠呈固體狀態(tài)，故把得到的杜仲膠精膠粉碎，準確稱取1 mg杜仲精膠，研磨成細粉采用壓片法與200 mg KBr混合壓片。通過傅里葉紅外光譜儀在波長為全波，掃描次數(shù)為35次，分辨率為2.0 cm-1，測定方式為Interferogram、條件下對所得的杜仲膠做紅外光譜的分析。

2 結果與分析

2.1 葉面角質層去除效果

以未經預處理的杜仲葉制備培養(yǎng)基時，發(fā)現(xiàn)綠色木霉菌絲生長緩慢甚至不生長，對杜仲葉進行烘干后稱重對比處理前重量也沒有明顯差異。間接說明綠色木霉直接與杜仲葉作用時，杜仲葉細胞壁未被破壞;用蘇丹Ⅲ對杜仲葉進行顯色表征，發(fā)現(xiàn)表面被染成紅色(圖1:A)，說明杜仲葉表面覆蓋有一層角質層，角質層阻礙了綠色木霉對杜仲葉細胞結構的作用。說明此條件提高了角質層的溶解效果，并且在應用稀堿溶液預處理的過程中，不僅溶解掉杜仲葉的角質層和表面的蠟質，也一定程度上除去了杜仲葉中的一些雜質，間接提高了杜仲膠在杜仲葉中的含量，為之后的提取做準備。同時，用蘇丹Ⅲ對優(yōu)化條件下稀NaOH溶液作用后的杜仲葉進行顯色反應，在100倍顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與未經處理的杜仲葉相比，稀堿處理后的杜仲葉經蘇丹Ⅲ染色(圖1:B)，沒有染成紅色，可以說明角質層去除比較完全。

圖1 蘇丹Ⅲ染色100倍顯微鏡下觀察杜仲葉表面Fig.1 Sudan Ⅲ staining observed the surface of E.ulmoides leaves under a microscope at 100 times

圖2 杜仲葉原葉、稀堿處理、綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)的SEM結果Fig.2 SEM results of primary leaves of E.ulmoides,dilute alkali treatment and green trichoderma fermentation culture

2.2 杜仲葉表面SEM觀測

通過對稀堿與綠色木霉聯(lián)合處理后的杜仲葉進行SEM觀察可以很清楚的發(fā)現(xiàn)，杜仲葉的表面由比較平整、雜質較多的狀態(tài)(圖2:A)，變成粗糙(圖2:B)、疏松多孔(圖2:C)的狀態(tài)，可以證明稀堿聯(lián)合綠色木霉預處理杜仲葉是一種比較有效的方法。

2.3 綠色木霉發(fā)酵培養(yǎng)及條件優(yōu)化

2.3.1 綠色木霉培養(yǎng)

由圖3可知，圖3A為搖床震蕩液體培養(yǎng)之前的狀態(tài)，圖3B為經過搖床震蕩培養(yǎng)之后的狀態(tài)，可以清楚的看到培養(yǎng)基中有明顯的菌團出現(xiàn)。可以證明在此培養(yǎng)基下綠色木霉可以旺盛的生長。為了在此驗證綠色木霉在此培養(yǎng)基條件下生長情況，與液體培養(yǎng)同樣培養(yǎng)基比例條件下，進行綠色木霉的平板培養(yǎng)，如圖4所示，可以菌落生長極其旺盛，且呈現(xiàn)綠色木霉的特征菌落，進而證明此培養(yǎng)基利于綠色木霉的生長。

2.3.2 綠色木霉培養(yǎng)條件優(yōu)化

由表2可知，4個因素對綠色木霉發(fā)酵效果的影響順序為pH>固液比>接種量>時間。最優(yōu)的水解水平為A3B1C1D2，即培養(yǎng)基pH=6，固液比1:10，接種量為20%，酶作用時間為5 d。最優(yōu)條件下，測得綠色木霉的酶活性為19.883 U·mL-1，失重率達到27.5%，杜仲膠含量提升到4.36%，高于正交試驗中任何一個條件結果，說明該優(yōu)化組合得出了一個綠色木霉發(fā)酵最佳條件。

圖3 綠色木霉液體培養(yǎng)狀態(tài)Fig.3 Liquid culture status of green trichoderma

圖4 綠色木霉平板培養(yǎng)狀態(tài)Fig.4 Status of green trichoderma in plate culture

表2 綠色木霉正交試驗與結果

2.4 有機溶劑對杜仲膠的提取

據相關文獻顯示[19]，石油醚可以很好的溶解杜仲膠，實驗結果發(fā)現(xiàn)，在溫度為85℃、料液比為1∶20、提取次數(shù)為1次、每次提取時間為60 min、石油醚作為提取溶劑的條件下，對杜仲葉中的杜仲膠直接提取，杜仲膠的提取率僅為0.73%的杜仲膠。而經過稀堿溶液與真菌聯(lián)合預處理后，杜仲膠的提取率可以達到2.85%，這是可能是因為通過稀堿聯(lián)合綠色木霉預處理杜仲葉，不僅可以破壞其本身的纖維結構，也使得杜仲葉的纖維結構變得疏松、多孔有利于溶劑的滲透、增大提取效率，而且因為杜仲葉的質量的缺少，間接的提高了杜仲膠的含量，并且通過計算可以得出提取單位質量下的杜仲膠所需要的溶劑的量，為杜仲原葉的2.74 mL·mg-1，而預處理后僅為0.70 mL·mg-1，減少了石油醚的用量，以此達到既能獲得高純度的杜仲膠，又能使提取過程安全、環(huán)保的目的。

表3 預處理前后杜仲膠提取的對比

2.5 杜仲葉中的杜仲膠紅外光譜的測定結果

對用丙酮純化后得到的白色杜仲膠進行傅里葉紅外光譜(FT-IR)的測定，獲得光譜圖如圖5所示，將其與文獻[20]進行對比可知，實驗所得杜仲膠譜圖與文獻中所描述的值近乎相同，呈現(xiàn)為反式1，4-聚異戊二烯圖譜，在2 854和2 918 cm-1處為甲基的伸縮振動，2 848 cm-1處為亞甲基的伸縮振動，1 669 cm-1處表示存在碳碳雙鍵的伸縮振動，在800～1 500 cm-1范圍內還有較多吸收峰，表示碳氫鍵、碳碳單鍵及甲基和亞甲基的振動及振動之間的耦合[20]。

圖5 所得杜仲膠的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of gutta-percha obtained

3 討論

結果表明，最佳的提取條件為：干燥的杜仲葉經過0.45% NaOH去除角質層并且同時溶出杜仲葉中的一些可溶解性的雜質，之后在pH=6、溫度為28℃搖床培養(yǎng)下利用綠色木霉破壞細胞壁纖維素，發(fā)酵5天后，剩余物質干燥箱中鼓風干燥，再通過石油醚在溫度為85℃、料液比為1∶20、提取次數(shù)為1次、提取時間為60 min提取出杜仲膠，最后，與有機溶劑直接提取杜仲膠相比，經過稀堿與綠色木霉聯(lián)合處理后，首先，除去了杜仲葉表面的角質層，使綠色木霉可以更好的作用于杜仲葉本身，其次經稀堿預處理后的杜仲葉中的可溶性雜質更少，可以使得出的杜仲膠的純度更高，最后經過稀堿與綠色木霉預處理后的杜仲葉，其結構更加的疏松，這樣可以使石油醚更好的滲透進杜仲葉的內部，增大了溶劑于杜仲膠的接觸面積，可以更好的提取出杜仲膠。此外，完整的杜仲葉經過稀堿與綠色木霉處理后，其中的木質素含量幾乎無變化，其中的纖維素與半纖維素變化最為明顯，由預處理前25.65%、18.36%，變化為13.81%、8.35%，脫除率均達到50%，再結合SEM的觀察結果可以證明預處理是很有效的。最后將直接石油醚浸提杜仲葉中的杜仲膠與真菌聯(lián)合稀堿預處理的再由石油醚總得率由0.73%，提升到2.85%，其杜仲膠含量由1.78%，增加到4.36%。但是在實際工業(yè)生產中利用微生物進行預處理的工藝還是不夠成熟會有有很多的弊端，因此，實際生產中可根據適合的情況選擇提取條件。