不同氮水平下水稻鉀吸收及全基因組關(guān)聯(lián)分析

鄒偉偉 路雪麗 王 麗 薛大偉 曾大力,* 李志新,*

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不同氮水平下水稻鉀吸收及全基因組關(guān)聯(lián)分析

鄒偉偉1路雪麗2王 麗1薛大偉3曾大力2,*李志新1,*

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 湖北荊州 434025;2中國水稻研究所, 浙江杭州 310006;3杭州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 浙江杭州 311121

以業(yè)已完成深度重測序的134份水稻地方種質(zhì)資源為材料, 在大田栽培條件下按不施氮(N0), 施96 kg hm–2純氮(N1)和施192 kg hm–2純氮(N2) 3種氮肥水平, 檢測了分蘗盛期植株的鉀含量、植株干重和鉀積累。結(jié)果表明, 水稻鉀含量、植株干重和鉀積累在N0、N1、N2三種氮肥處理下均呈正態(tài)分布, 表型變異豐富。植株干重和鉀積累與施氮量呈極顯著正相關(guān), 鉀含量與施氮量相關(guān)性不顯著; 鉀含量與植株干重呈負相關(guān), 鉀含量與鉀積累相關(guān)性不顯著, 而植株干重與鉀積累呈極顯著正相關(guān)。在3個施氮水平下, 秈稻的鉀含量極顯著低于粳稻, 秈稻的干重和鉀積累都極顯著高于粳稻。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn), 在3個氮肥水平下檢測到12個顯著相關(guān)位點, 其中鉀積累、鉀含量和植株干重的顯著相關(guān)位點分別有2、5和5個。在N1水平下, 位于第6染色體上與鉀含量相關(guān)的SNP (Chr6_1,524,776)的顯著性峰候選區(qū)包含與鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白互作的基因。根據(jù)鉀含量的差異, 鑒定出3個鉀含量與低氮響應(yīng)有關(guān)的SNP位點, 1個位點與高氮響應(yīng)有關(guān), 而位于第10染色體上的顯著性位點Chr10_2,822,026對低氮和高氮均有響應(yīng), 該區(qū)域的4個候選基因的表達在不同氮水平間存在差異。

全基因組關(guān)聯(lián)分析; 鉀含量; 干重; 鉀積累; 水稻

水稻的正常生長離不開氮、鉀等營養(yǎng)元素, 氮、鉀的養(yǎng)分平衡及交互作用對水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成起著重要的調(diào)控效應(yīng)[1]。雖然目前關(guān)于施肥對水稻產(chǎn)量及肥料利用率影響的研究很多, 但是大部分以研究單一肥料的效應(yīng)為主[2-3]。有研究表明, 增施鉀肥可以提高大麥的氮肥農(nóng)學(xué)利用率和生理利用率, 氮、鉀肥平衡施用能顯著提高谷子的產(chǎn)量和肥效, 但卻并未對肥料間的交互作用進行詳細分析[4]。我國約有三分之一的可耕作土壤中鉀含量不足[5]。土壤中鉀肥的缺乏使得作物產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重的影響[7]。因而了解氮鉀之間的協(xié)同吸收, 選育出鉀高效吸收和利用的水稻品種, 對提高水稻品質(zhì)減少鉀肥施用量具有重要意義。

研究顯示, 氮主要從3個方面影響鉀吸收及利用。首先, 在田間土壤條件下, NH+通過土壤對NH+、K+之間吸附固定存在的競爭來影響水稻對鉀的吸收; 其次, NH4+通過對水稻根系鉀高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和低親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的影響來抑制水稻根系對鉀離子的吸收; 第三, 由于NO3–與K+具有相反的電荷, NO3–通過離子補償來促進鉀離子的吸收; 另外植物體內(nèi)的鉀與許多營養(yǎng)元素存在互作關(guān)系, 鉀通過影響作物的氮代謝和碳代謝, 來加快植物體內(nèi)氮化合物向蛋白質(zhì)合成場所運輸, 以及氨基酸合成蛋白質(zhì)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu), 有利于植物體內(nèi)有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化及累積, 提高氮和磷養(yǎng)分的利用率[8-14]。

目前認為植物體內(nèi)存在兩種不同類型的鉀吸收系統(tǒng), 即高親和與低親和兩種機制。在低鉀濃度小于0.2 mmol L–1條件下, 由鉀載體蛋白(carrier protein)組成的高親和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)起作用; 在高濃度(1~10 mmol L–1)條件下由通道蛋白(channel protein)組成的低親和吸收系統(tǒng)(1ow-affinity K channe1)起作用[15-17]。許多研究發(fā)現(xiàn), 不同基因型水稻之間的鉀吸收利用效率顯著不同, 說明植物鉀營養(yǎng)性狀是受遺傳控制的。為獲取水稻的全部(High Affinity K transporter, 高親和鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白)基因, Amrutha等[18]以擬南芥轉(zhuǎn)運蛋白作為檢索序列, 利用Blastp搜索TIGR水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫, 水稻基因組計劃(Rice Genome Project, RGP)數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫, 在水稻基因組中鑒定出27個基因。Li等[19]發(fā)現(xiàn)的RNAi轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出鉀離子缺失性狀, 與突變體在低鉀離子濃度環(huán)境下表型相同。Yu等[20]通過T-DNA插入基因的第2外顯子得到突變體; Chen等[21]和Zhao等[22]對基因研究發(fā)現(xiàn),基因是不定根生長發(fā)育關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 增強植株根部生長和發(fā)育, 增加低鉀土壤條件下植株的鉀吸收效率。另外研究者利用各種群體定位了許多與鉀素相關(guān)QTL, 這些QTL在水稻的12條染色體上都有分布[23-26]。如Wu等[23]用秈稻IR64與粳稻Azucena雜交的水稻HD群體(共123個株系)為試驗材料, 共檢測到20個與低鉀脅迫相關(guān)性狀的QTL, 主要位于第3、第5、第8染色體; Shimizu等[25]共檢測到20個與低鉀脅迫相關(guān)性狀的QTL, 主要位于第1、第2、第4、第6、第8、第9、第10、第12染色體。近年來, 全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)成功地應(yīng)用在一些模式生物研究和農(nóng)作物的育種當中[27-30]。

在水稻中, 利用GWAS分析了包括產(chǎn)量、品質(zhì)、抽穗期、株型等多種重要的農(nóng)藝性狀, 同時也對病蟲害抗性等生物脅迫和鹽堿耐受性等非生物脅迫性狀進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析, 并鑒定了許多重要的SNP位點[28,31-33]。但是, 與鉀吸收及氮響應(yīng)相關(guān)的GWAS研究尚未見報道。本研究選取134份來自不同地區(qū)的水稻品種作為關(guān)聯(lián)分析的群體, 利用在不同氮肥條件下鉀吸收的變化, 從氮、鉀吸收互作角度來解釋水稻的鉀吸收及品種間鉀利用差異; 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選鉀吸收和利用的基因, 為進一步的功能研究和育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

134個地方品種來自中國水稻研究所(CNRRI)、國際水稻研究所(IRRI)種質(zhì)資源庫及多個國家和地區(qū)。包括各省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的地方品種41份, 其他國家36份, 國內(nèi)大面積推廣種植品種57份。其中秈稻71份, 即寶大粒、七桂B(yǎng)、窄葉青8號、潮安柑園、七語冷禾、浙733、澄海白殼矮、齊眉1號、浙場3號、川大粒、青種、浙輻、大粒紅、秋布了、制4、二九青、仁化九工幾、中白花、贛早秈37、三朝齊、中156、廣陸矮4號、勝利秈、舟903、桂朝2號、蜀恢527、湖南早、蘇御糯、花占、泰國香稻、黃黏5號、天豐、火燒禾、萬利秈、加拿大1號、湘矮早9號、嘉育948、湘早秈、粳秈89、湘早秈3號、墾稻8號、湘早秈7號、況絲佳帝、小白芒、柳條子、小毛香、陸財號、揚輻秈5號、羅大穗、揚尖糯、羅長大粒、一紅嘴、密陽46、英德大葉拍、埝口黃、原豐早、488、Albolia-P、Arborio、C8CU80-S、C91 C-S、CEYSVONI-S、DR32、ECIA 66、Ichsannde、IFON、IR36、MEDIO 18、PANAMA1537、RD25、SELECCION;粳稻63份, 即阿爾巴尼亞、農(nóng)虎6號、矮子黃殼糯、秋光、奧羽326、熱研、北陸129、軟烏稻、邊別、三粒寸、楚粳26、沈長粳、粗粳23、臺中65、大粒瓜糯、太湖青、稻花香2號、特大粘、東農(nóng)416、晚百歌、鄂晚5號、武育粳3號、鄂宜105、武運粳7號、蜂子糯、祥湖84、鳳尾6號、新長粳、高粱稻、新竹4號、哥羅27、秀水8號、合江23、秀水9號、黑豬尿、秀水63、黃絲糯2號、徐稻3號、空育131、粵T2567、蘭稻、早豐9號、老龍須、早熟剛糯2號、木邦谷、長白9號、南洋占、中242、Acc.14725、Baldo、Chabli-c-G、Barah、Gamilunan、IRAT104、Taihuqing IRAT243、Tedazhan ITA233、Hrborio-c、Kasinkan、Kenteng、Kutube-n、Labelle、Radi-P和SLG-1[34]。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2015年在中國水稻研究所實驗基地(浙江富陽)完成, 試驗田土壤為水稻土(土壤含有機質(zhì)36.9 g kg–1、全氮2.73 g kg–1、速效鉀104 mg kg–1、速效磷52 mg kg–1、堿解氮156 mg kg–1, pH 6.24)。設(shè)不施氮(N0), 施96 kg hm–2純氮(N1)和施192 kg hm–2純氮(N2) 3種氮水平; 以施氮量為主區(qū), 品種為裂區(qū), 3次重復(fù)。每個品種種植4行, 每行種6株, 株行距為20 cm × 20 cm。采用尼龍塑料薄膜覆蓋田埂, 防止漏水漏肥, 保證單獨排灌。以尿素為氮肥, 按基肥∶分蘗肥 = 5∶3分2次施入, 其中播種前1 d施基肥、播種后25 d施分蘗肥。分蘗肥施用期間(6月中旬至7月中旬)保持畦面濕潤并無水層, 且僅保證溝中有水以防止水分串流導(dǎo)致的串肥。磷、鉀施用量為P2O575 kg hm–2、K2O 150 kg hm–2, 其中磷肥為底肥一次施入, 鈣、鎂、鉀肥按基、蘗肥各50%分2次施入。其他栽培管理措施同一般大田。于水稻移栽后32 d (分蘗盛期)地上部鉀含量、干重和鉀積累調(diào)查。

1.3 植株樣品采集及分析

分蘗盛期取每品種中間的6株無邊際效應(yīng)植株的地上部位, 裝于紙袋中105℃下殺青30 min, 80℃烘干至恒重后稱重, 即得出地上部位干重量, 由M (g plant–1)表示。將地上部位經(jīng)磨碎過0.5 mm篩后, 采用H2SO4H2O2消煮, 火焰光度計法測定植物全鉀含量, 由KC (mg g–1)表示。地上部鉀素積累由KA (mg plant–1)表示, 即干重M與鉀含量KC的乘積。鉀含量在N0處理下的相對變化用KCN1-N0表示,即N1與N0水平下的鉀含量差值, 鉀含量在N2處理下的相對變化用KCN2-N1表示, 即N2與N1水平下的鉀含量差值; 類似地, 鉀積累在N0和N2處理下的相對變化則分別用KAN1-N0和KAN2-N1表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 性狀相關(guān)性分析 使用Microsoft Excel 2010整理和分析數(shù)據(jù), 并計算其平均值和標準差; 使用DPS9.50進行相關(guān)性分析和顯著水平檢驗。

1.4.2 基因型測定 采用CTAB法提取134份品種的DNA[35], 樣品檢測合格后高通量測序。每品種測序的reads數(shù)據(jù)量保證在5 Gb以上。之前的研究中, 已利用BWA和GATK軟件對SNP提取, 使用最小等位基因頻率大于0.03 (MAF>0.03)過濾SNP, 并使用ANNOVAR 軟件注釋SNP數(shù)據(jù)[34]。

1.4.3 群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析 之前的研究中, 已利用提取到的3,356,591個SNP位點開展親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化分析[34]。

1.4.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析 采用混合線性模型(mixed linear model, MLM)的EMMAX (Efficient Mixed-Model Association eXpedited)軟件包對SNP標記與目標性狀進行關(guān)聯(lián)分析, 將EMMAX軟件計算的親緣關(guān)系K矩陣及基于EIGENSOFT軟件計算的群體結(jié)構(gòu)Q值納入分析模型中, 設(shè)定關(guān)聯(lián)分析參數(shù)為emmax -v, -t, -k, -p, -d 10, -c, -o。關(guān)于關(guān)聯(lián)分析的顯著性, 采取<10–6作為寬松閾值, 進一步的嚴格閾值采取Bonferroni校驗閾值[34-36]。

1.5 RNA的提取和RT-PCR

在3個氮水平下, 分別取分蘗盛期TN1 (臺中本地1號)中間的6株無邊際效應(yīng)植株的全展葉。用Total RNA Kit (AXYGEN)試劑盒提取植株總RNA, 并且反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)試劑盒配成每孔10mL體系, 在ABI 7900進行RT-PCR, 水稻泛素5基因作為內(nèi)參。引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種氮水平下鉀含量、干重和鉀積累的分布

鉀含量在3個氮水平上的變幅分別為22.2~35.1 mg g–1、20.0~37.0 mg g–1和19.2~38.9 mg g–1(表2), 表明該群體的鉀含量、干重和鉀積累變異非常豐富。

表1 RT-PCR引物

表2 3個氮水平下鉀含量、干重和鉀積累變化

數(shù)據(jù)格式為平均值±誤差; N0: 0 kg N hm–2; N1: 96 kg N hm–2; N2: 192 kg N hm–2。

The data are the mean ± SE.

在不同氮水平下, 鉀含量、植株干重和鉀積累在134份品種組成的自然群體中呈正態(tài)分布。其中, 鉀含量在N0水平下主要集中在27~33 mg g–1, 而N1、N2水平下主要集中在25~31 mg g–1(圖1-a); 鉀積累在N0、N1、N2水平上分別集中分布在16.5~ 33.0、27.5~44.0和33.0~49.5 mg plant–1(圖1-e)。在反應(yīng)氮響應(yīng)變化中, 只在N0水平下對鉀含量的影響比較大, 表現(xiàn)為鉀含量增加(圖1-b); 并且從圖1-b、d和f可以看出, 鉀含量整體上受氮水平的影響不明顯, 而干重和鉀積累明顯隨著氮水平的增加而增加, 說明高氮條件下引起的生物量增加是導(dǎo)致鉀積累增加的關(guān)鍵。

2.2 鉀含量和鉀積累在不同氮處理下的相對變化

在不同的氮處理下, 將鉀含量和鉀積累的相對變化分為4種響應(yīng)模式。在鉀含量相對變化中, 14.1%品種表現(xiàn)為在N0條件下鉀含量相對降低和在N2條件下相對增加, 35.4%品種表現(xiàn)為在N0和N2條件下鉀含量都相對增加, 27.4%品種表現(xiàn)為在N0條件下鉀含量相對增加而在N2條件下相對降低, 23%品種表現(xiàn)為在N0和N2條件下鉀含量都相對降低(圖2-a); 在鉀積累相對變化中, 78.8%品種表現(xiàn)為在N0條件下鉀積累相對降低和在N2條件下相對增加, 11.5%品種表現(xiàn)為在N0和N2條件下鉀積累都相對增加, 0.9%品種表現(xiàn)為在N0條件下鉀積累相對增加而在N2條件下相對降低, 8.9%品種表現(xiàn)為在N0和N2條件下鉀積累都相對降低(圖 2-b)。由此可知,該關(guān)聯(lián)群體在不同氮處理下鉀含量和鉀積累相對變化均呈現(xiàn)豐富的變異, 預(yù)示著鉀響應(yīng)氮變化的相關(guān)基因位點在不同品種中存在豐富的變異。

2.3 鉀含量、植株干重和鉀積累的秈粳差異比較

由圖3所示, 在不同氮水平下, 參試材料的鉀含量、干重和鉀積累的變異范圍和平均值在秈粳亞種間存在較大差異。3個氮水平中秈稻的鉀含量均極顯著低于粳稻, 例如在N0水平下秈和粳稻中鉀含量分別為27.82 mg g–1和30.26 mg g–1, 表明不同的種質(zhì)資源對鉀的吸收能力存在差異; 在3個氮水平中, 秈稻的干重顯著高于粳稻的干重, 秈稻的鉀積累也顯著高于粳稻, 說明在3個氮水平下, 秈稻的生物量增加是導(dǎo)致鉀積累增加的主要原因。其中秈粳的干重和鉀積累隨著施氮用量的增加, 其指標也隨之增加, 但是秈粳的鉀含量并沒有隨著施氮水平的變化而出現(xiàn)明顯的變化。

圖1 3種氮水平下水稻鉀含量、干重和鉀積累的分布

a、c和e分別為N0、N1和N2條件下的鉀含量、干重和鉀積累分布; b、d、f 為N0、N1和N2條件下鉀含量、干重和鉀積累分布的氣泡圖, 氣泡寬度代表株系數(shù), 紅色虛線為3 種氮條件下各性狀的平均值。

a, c, and e are the distribution of K content, dry weight, and K accumulation under three nitrogen levels, respectively; b, d, and f are the distribution of K content, dry weight, and K accumulation in bubble chart under three nitrogen levels, respectively; the width of bubble represents the number of lines, and the red dotted line is the average value of every character.

圖2 不同氮處理下鉀含量和鉀積累相對變化的分布

a和b是分別相對N0N1-N0和N2N2-N1鉀含量和鉀積累相對變化分布。KC: 鉀含量; KA: 鉀積累。

a and b are the distributions of relative changes of K content and K accumulation under N0N1-N0and N2N2-N1; KC: K content; KA: K accumulation.

圖3 鉀含量、干重和鉀積累在3種氮水平處理下秈粳亞種間的比較

a、b、c是鉀含量、干重和鉀積累在3種氮水平處理下秈粳亞種間的比較。C0i、C1i、C2i分別表示秈稻在N0、N1、N2下的鉀含量, C0j、C1j、C2j分別表示梗稻在N0、N1、N2下的鉀含量; W0i、W1i、W2i分別表示秈稻在N0、N1、N2下的植株干重, W0j、W1j、W2j分別表示粳稻在N0、N1、N2下的植株干重;A0i、A1i、A2i分別表示秈稻在N0、N1、N2下的鉀積累, A0j、A1j、A2j分別表示粳稻在N0、N1、N2下的鉀積累。

a, b, and c are comparisons of K content, dry weight and K accumulation betweenandunder three nitrogen levels.C0i, C1i, and C2i are the K content ofunder N0, N1, and N2 nitrogen levels respectively; C0j, C1j, and C2j are the K content ofunder N0, N1, and N2 nitrogen levels respectively; W0i, W1i, and W2i are the dry weight ofunder N0, N1, and N2 nitrogen levels respectively; W0j, W1j, and W2j are the dry weight ofunder N0, N1, and N2 nitrogen levels respectively; A0i, A1i, and A2i are the K accumulation ofunder N0, N1, and N2 nitrogen levels respectively; A0j, A1j, and A2j are the K accumulation ofunder N0, N1, and N2 nitrogen levels, respectively.

2.4 鉀含量、植株干重和鉀積累的相關(guān)性分析

鉀含量隨著施氮量的增加變化不明顯, 植株干重和鉀積累都隨著施氮量的增加而增加(表3)。鉀含量與干重在3個氮水平上均呈現(xiàn)出極顯著的負相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別為?0.33、?0.38和?0.30, 說明水稻植株干重越大, 鉀含量就越低; 鉀含量與鉀積累在3個氮水平上均無顯著相關(guān)性, 而干重與鉀積累在3個氮水平中均呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別達0.92、0.88和0.89, 表明水稻鉀積累主要受水稻干重影響, 即水稻干重越大, 水稻鉀積累水平就越高(表4)。這說明施用高氮引起的生物量增加是導(dǎo)致鉀積累增加的關(guān)鍵。

2.5 不同氮水平鉀含量、植株干重和鉀積累的全基因組關(guān)聯(lián)分析

對134份水稻鉀含量、鉀積累和干重, 在3個氮處理條件下, 以?lg大于6為閾值, 共檢測到12 個與目標性狀顯著相關(guān)的SNP位點, 包括鉀含量和干重的5個顯著位點, 鉀積累的顯著位點2個; 在N0和N2水平, 共檢測到3個與目標性狀相關(guān)的SNP位點, 但在N1水平下, 檢測到的與目標性狀相關(guān)的顯著位點最多, 為9個; 在2個氮水平上均檢測到的與鉀積累、鉀含量和干重顯著關(guān)聯(lián)的位點一共有3個, 說明此類與目標相關(guān)的3個位點受施氮量影響較小(表5和圖4-a~c)。

表3 參試水稻材料鉀含量、干重和鉀積累與氮水平的相關(guān)系數(shù)

*< 0.05;**< 0.01; N0: 0 kg N hm–2; N1: 96 kg N hm–2; N2: 192 kg N hm–2.

表4 3個氮水平下參試水稻材料3個目標性狀間的相關(guān)系數(shù)

*< 0.05;**< 0.01; N0: 0 kg N hm–2; N1: 96 kg N hm–2; N2: 192 kg N hm–2.

表5 3種氮處理下鉀含量、干重和鉀積累的顯著性關(guān)聯(lián)位點

N0: 0 kg N hm–2; N1: 96 kg N hm–2; N2: 192 kg N hm–2.

圖4 3個氮水平下水稻鉀含量、干重和鉀積累的全基因組關(guān)聯(lián)分析

a、b和c分別是3個氮水平下水稻鉀含量、干重和鉀積累的全基因組關(guān)聯(lián)分析。

a, b, and c are genome-wide association studies of K content, dry weight, and K accumulation under three nitrogen levels, respectively.

基因的多效性是生物學(xué)上的普遍現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)第6染色體上的Chr6_21,337,192位點在干重和鉀積累兩個性狀中均被檢測到, 表明該位點既控制干重也影響鉀積累, 從遺傳上也進一步說明了鉀積累與干重緊密相聯(lián)。此外, 第6染色體上檢測到的顯著位點最多, 一共有7個, 均位于21.3~26.0 Mb區(qū)間(表5)。

另外檢測到在N1水平上干重的1個顯著關(guān)聯(lián)位點MAF (Minor Allele Frequency)為0.049, 小于0.05, 表明此位點為1個稀有的突變位點; 而其他的顯著位點MAF均大于0.05, 表明此類SNP在關(guān)聯(lián)群體中分布較為廣泛(表5)。

進一步對不同的氮處理下鉀含量和鉀積累相對變化進行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共檢測到了4個鉀含量相對變化的顯著關(guān)聯(lián)位點, 而沒有檢測到鉀積累的相對變化; 其中有3個位點處于第10染色體上, 而且在相對N0和N2處理下均檢測到位于第10染色體同一位點Chr10_2,822,026, 表明此位點相對于N0和N2都表現(xiàn)出了響應(yīng), 是后續(xù)進行候選基因分析的重要依據(jù)(表6和圖5-a, b)。

表6 鉀含量在N0和N2處理下的相對變化的顯著關(guān)聯(lián)位點

KCN1-N0表示鉀含量在N0處理下的相對變化, KCN2-N1表示在N2處理下的相對變化。

KCN1-N0represents the K content relative change under N0 level, and KCN2-N1represents the K content relative change under N2 level.

圖5 鉀含量和鉀積累在N0和N2相對變化的全基因組關(guān)聯(lián)分析

a和b分別為鉀含量和鉀積累在N0和N2相對變化的全基因組關(guān)聯(lián)分析。KC: 鉀含量; KA: 鉀積累。

a and b are Genome-wide association analysis of K content and K accumulation relative changes under N0 and N2 levels. KC: K content; KA: K accumulation.

2.6 候選基因分析

在N1水平下, 第6染色體上顯著性SNP (chr6_ 1,524,776)位點的值(?lg)為7.64, 屬于最高值; 對此位點進行候選基因分析, 在該位點±200 kb的候選區(qū)間內(nèi), 找到, 即為基因,與3個鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白互作, 與互作最強, 調(diào)控K+穩(wěn)態(tài)[37]。另外, 在N0和N2處理下鉀含量的相對變化, 均檢測到了位點Chr10_2,822,026 (表6); 對該位點上下游200 kb區(qū)間在水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫進行候選基因搜索, 發(fā)現(xiàn)共有62個候選基因。通過生物信息學(xué)分析, 確定18個可能的候選基因。通過對該位點不同品種的鉀含量分析, 選取1個在N0、N1、N2鉀含量差異較明顯的TN1品種, 進行分蘗期的定量表達分析, 對候選基因進行驗證。與N1相比, 大部分候選基因在N0和N2下的表達量顯著降低(圖6)。其中在N0的表達量是N1的0.413倍, 而N2是N1的0.0626倍;在N0和N2的表達量分別是N1的0.209倍和0.214倍;在N0的表達量是N1的0.154倍, 在N2下降為0.00451倍;在N0和N2的表達量分別是N1的0.146倍和0.112倍(圖5); 通過對候選基因在N0和N2相對N1的表達分析, 進一步縮小鉀含量響應(yīng)基因的范圍, 為后續(xù)的基因克隆及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6 在3個氮水平下4個候選基因相對表達水平

在3個氮水平中, 雷達圖以N1水平基因的表達量為1。

Radar chart is based on expression level of 1 under N1 level among three nitrogen levels.

3 討論

氮和鉀都是水稻生長和發(fā)育的大量必須營養(yǎng)元素, 兩者之間存在著一定的互作效應(yīng)。但目前大部分以研究單一肥料的效應(yīng)為主, 有關(guān)氮肥對鉀吸收的影響鮮有報道[1]。本研究對134份水稻品種在不同氮水平下的鉀含量、植株干重和鉀積累分析表明, 水稻植株鉀積累隨著施氮水平的提高和植株生物量的增加而增加, 而鉀含量則沒有明顯的變化。梁健等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)隨著氮肥群體生產(chǎn)力等級的提高, 鉀總積累量顯著增多; 在N1水平下, 位于第6染色體上與鉀積累顯著相關(guān)的Chr6_21,336,732位點和植株干重顯著相關(guān)的Chr6_21,337,192位點相鄰, 而在此位點附近并未檢測到與鉀含量顯著相關(guān)的SNP位點, 這也解釋了鉀積累與植株干重之間存在相關(guān)的內(nèi)在原因。劉國棟等[38]用水培方法對86種不同基因型秈稻篩選比較發(fā)現(xiàn), 不同基因型間吸鉀效率差異十分顯著; 李華等[39]對在不同氮源和鉀水平下雜交稻及其父母本和常規(guī)稻的鉀吸收和積累的研究認為不同類型水稻對鉀素的吸收可能存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)在不同的氮水平下粳稻品種的鉀含量均普遍高于秈稻品種; 另外, 在秈型和粳型品種中均存在鉀積累和鉀吸收顯著差異的種質(zhì)資源, 這種不同水稻基因型在吸鉀能力和鉀素利用效率上的差異將為培育鉀高效利用率水稻提供有益的種質(zhì)資源。

不同的研究者采用不同的群體在不同的環(huán)境下定位了一些與水稻鉀吸收性狀相關(guān)的QTL, 目前在水稻12條染色體上均檢測到了與鉀素吸收相關(guān)的QTL[23-26]; Shimizu等[25]通過低鉀脅迫共檢測到分布于8條染色體上20個與鉀吸收性狀相關(guān)的QTL; Pandit等[26]利用重組自交系在第1、第8和第12染色體都檢測到與鉀吸收相關(guān)的QTL。本研究在第1、第2、第3、第6、第9和第10染色體均找到了與鉀吸收相關(guān)的顯著位點, 并且這些位點在第6染色體上分布最多; 其中一些已克隆的與鉀素相關(guān)基因位于本研究關(guān)聯(lián)到的顯著性位點區(qū)間內(nèi), 如在N1下,基因與3個鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白互作調(diào)控K+穩(wěn)態(tài), 位于顯著位點Chr6_1,524,776區(qū)間內(nèi)[37]。同時, 鉀素營養(yǎng)與水稻的根系生長也具有密切的關(guān)系, 顯著位點Chr2_7,907,735附近的基因參與水稻不定根的發(fā)育[40]; 在N0處理下鉀含量相對變化中, 在Chr9_6,934,774位點附近檢測到1個與最大根長度相關(guān)的QTL[41]; 該結(jié)果進一步驗證了全基因組關(guān)聯(lián)分析對遺傳變異檢測的有效性和可靠性。

本研究在2個氮水平下都檢測到的顯著性位點有3個, 并且鉀含量在N0和N2處理下的相對變化中均檢測到了同一位點Chr10_2,822,026, 表明這些位點附近的候選基因能在不同氮水平下穩(wěn)定表達, 附近可能存在效應(yīng)較大的候選基因, 利用這些穩(wěn)定表達的位點進行聚合育種, 提高群體內(nèi)優(yōu)勢等位基因頻率, 可能取得較好的育種效果。另外本文找到了4個在不同氮水平下具有較大表達量差異的候選基因, 對后期候選基因鑒定、分析、克隆、表達水平變化、基因敲除及功能驗證十分重要, 將有助于揭示水稻鉀素吸收的遺傳機制。

4 結(jié)論

本研究群體在3種氮水平下表型豐富。施氮量對鉀含量影響不明顯, 而施氮量的增加引起植株干重的增加導(dǎo)致了鉀積累的增加; 另外, 在相同氮水平下秈稻的鉀含量顯著低于粳稻, 而秈稻的干重和鉀積累極顯著高于粳稻。GWAS分析檢測到16個顯著關(guān)聯(lián)位點, 其中2、5和5個分別與鉀積累、鉀含量和植株干重顯著關(guān)聯(lián), 另外4個是鉀含量相對變化的關(guān)聯(lián)位點; 并且在兩種氮響應(yīng)下均檢測到的同一顯著關(guān)聯(lián)位點附近找到了4個表達量差異較大的候選基因。

[1] 燕金香, 李福明, 徐春梅, 陳松, 褚光, 章秀福, 王丹英. 水稻氮鉀吸收的交互作用研究. 中國稻米, 2017, 23(2): 1–4. Yan J X, Li F M, Xu C M, Chen S, Chu G, Zhang X F, Wang D Y. Study on interactions between N and K absorption in rice., 2017, 23 (2): 1–4 (in Chinese with English abstract).

[2] 侯云鵬, 韓立國, 孔麗麗, 尹彩霞, 秦裕波, 李前, 謝佳貴. 不同施氮水平下水稻的養(yǎng)分吸收、轉(zhuǎn)運及土壤氮素平衡. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2015, 21: 836–845. Hou Y P, Han L G, Kong L L, Yin C X, Qin Y B, Li Q, Xie J G. Nutrient absorption, translocation in rice and soil nitrogen equilibrium under different nitrogen application doses., 2015, 21: 836–845 (in Chinese with English abstract).

[3] 潘圣剛, 聞祥成, 莫釗文, 段美洋, 董浩然, 黃貴興, 田華, 唐湘如. 施氮量和遮蔭對不同基因型水稻產(chǎn)量及一些生理特性的影響. 中國水稻科學(xué), 2015, 29: 141–149. Pan S G, Wen X C, Mo Z W, Duan M Y, Dong H R, Huang G X, Tian H, Tang X R. Effects of nitrogen application and shading on yields and some physiological characteristics in different rice genotypes., 2015, 29: 141–149 (in Chinese with English abstract).

[4] Rutkowska A, Piku?a D, Stepien W. Nitrogen use efficiency of maize and spring barley under potassium fertilization in long- term field experiment., 2014, 60: 550–554.

[5] 王毅, 武維華. 植物鉀營養(yǎng)高效分子遺傳機制. 植物學(xué)報, 2009, 44: 27–36. Wang Y, Wu W H. Molecular genetic mechanism of high efficient potassium uptake in plants., 2009, 44: 27–36 (in Chinese with English abstract).

[6] 孫愛文, 張衛(wèi)峰, 杜芬, 高利偉, 張福鎖, 陳新平. 中國鉀資源及鉀肥發(fā)展戰(zhàn)略. 現(xiàn)代化工, 2009, 29(9): 10–14. Sun A W, Zhang W F, Du F, Gao L W, Zhang F S, Chen X P. China's development strategy on potash resources and fertilizer., 2009, 29(9): 10–14 (in Chinese with English abstract).

[7] 梁健, 任紅茹, 夏敏, 李曉峰, 陳夢云, 李軍, 張洪程, 霍中洋. 淮北地區(qū)氮肥群體最高生產(chǎn)力水稻鉀素吸收利用特征. 作物學(xué)報, 2017, 43: 558–570. Liang J, Ren H R, Xia M, Li X F, Chen M Y, Li J, Zhang H C, Huo Z Y. Potassium absorption and utilization characteristics of rice varieties with the highest population productivity under corresponding nitrogen fertilization in Huaibei area., 2017, 43: 558–570 (in Chinese with English abstract).

[8] 曾文龍. 土壤對銨、鉀及磷酸離子吸附固定的研究. 中國煙草科學(xué), 2001, 22(1): 28–32. Zeng W L. Research of soil adsorption and fixation to ammonium, potassium and phosphorate ion., 2001, 22(1): 28–32 (in Chinese with English abstract).

[9] Szczerba M W, Britto D T, Kronzucker H J. K+transport in plants: physiology and molecular biology., 2009, 166: 447–466.

[10] Spalding E P, Hirsch R E, Lewis D R, Qi Z, Sussman M R, Lewis B D. Potassium uptake supporting plant growth in the absence ofchannel activity., 1999, 113: 909–918.

[11] Véry A A, Sentenac H. Molecular mechanisms and regulation of K+transport in higher plants., 2003, 54: 575–603.

[12] Davenport R J, Tester M. A weakly voltage-dependent, nonselective cation channel mediates toxic sodium influx in wheat., 2000, 122: 823–834.

[13] Macleod L B. Effects of N, P, and K and their interactions on the yield and kernel weight of barley in hydroponic culture., 1969, 61: 26–29.

[14] 胡泓, 王光火. 施鉀條件下雜交水稻氮磷養(yǎng)分吸收利用特點. 土壤通報, 2003, 34: 202–204. Hu H, Wang G H. Natune of nitrogen and phosphorus uptake by a hybrid rice under the potassium fertilizer treatment., 2003, 34: 202–204.

[15] Schachtman D P, Schroeder J I. Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants., 1994, 370: 655–658.

[16] Ko C H, Buckley A M, Gaber R F.is required for low affinity K+transport in saccharomyces cerevisiae., 1990, 125: 305–312.

[17] 寥紅, 嚴小龍. 高級植物營養(yǎng)學(xué). 北京: 科學(xué)出版社, 2003.pp 242–250. Liao H, Yan X L. Advanced Plant Nutrition. Beijing: Science Press, 2003. pp 242–250 (in Chinese).

[18] Amrutha R N, Sekhar P N, Varshney R K, Kishor P B K. Genome-wide analysis and identification of genes related to potassium transporter families in rice (L.)., 2007, 172: 708–721.

[19] Yang W, Kong Z, Omoikerodah E, Xu W, Li Q, Xue Y. Calcineurin B-like interacting protein kinasefunctions in pollination and drought stress responses in rice (L.)., 2008, 35: 531–543.

[20] Yu Z, Hu Y F, Dai M Q, Huang L M, Zhou D X. TheWUSCHEL-related Homeobox geneis required to activate shoot-borne crown root development in rice., 2009, 21: 736–748.

[21] Chen G, Feng H, Hu Q, Qu H, Chen A, Yu L, Xu G. Improving rice tolerance to potassium deficiency by enhancing:-controlled root development., 2015, 13: 833–848.

[22] Zhao Y, Cheng S, Song Y, Huang Y, Zhou S L, Liu X Y, Zhou D X. The interaction between riceandpromotes crown root development by regulating gene expression involved in cytokinin signaling., 2015, 27: 2469–2483.

[23] Wu P, Ni J J, Luo A C. QTLs underlying rice tolerance to low-potassium stress in rice seedlings., 1998, 38: 1458–1462.

[24] Lin H X, Zhu M Z, Yano M, Gao J P, Liang Z W, Su W A, Hu X H, Ren Z H, Chao D Y. QTLs for Na+and K+uptake of the shoots and roots controlling rice salt tolerance., 2004, 108: 253–260.

[25] Shimizu A, Guerta C Q, Gregorio G B, Kawasaki S, Ikehashi H. QTLs for nutritional contents of rice seedlings (L.) in solution cultures and its implication to tolerance to iron-toxicity., 2005, 275: 57–66.

[26] Pandit A, Rai V, Bal S, Sinha S, Kumar V, Chauhan M, Gautam R K, Singh R, Sharma P C, Singh A K, Gaikwad K, Sharma T R, Mohapatra T, Singh N K. Combining QTL mapping and transcriptome profiling of bulked RILs for identification of functional polymorphism for salt tolerance genes in rice (L.)., 2010, 284: 121–136.

[27] Atwell S, Huang Y S, Vilhjálmsson B J, Willems G, Horton M, Li Y, Meng D, Platt A, Tarone A M, Hu T T, Jiang R, Muliyati N W, Zhang X, Amer M A, Baxter I, Brachi B, Chory J, Dean C, Debieu M, Meaux J, Ecker J R, Faure N, Kniskern J M, Jones J D, Michael T, Nemri A, Roux F, Salt D E, Tang C, Todesco M, Traw M B, Weigel D, Marjoram P, Borevitz J O, Bergelson J, Nordborg M. Genome-wide association study of 107 phenotypes ininbred lines., 2010, 465: 627–631.

[28] Zhao K, Tung C W, Eizenga G C, Wright M H, Ali M L, Price A H, Norton G J, Islam M R, Reynolds A, Mezey J, McClung A M, Bustamante C D, McCouch S R. Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in., 2011, 2: 467.

[29] Wen W, Li D, Li X, Xiang L, Gao Y Q, Li W Q, Li H H, Liu J, Liu H J, Chen W, Luo J, Yan J B. Metabolome-based genome-wide association study of maize kernel leads to novel biochemical insights., 2015, 5: 32–32.

[30] Zhou Z, Jiang Y, Wang Z, Gou Z, Lu J, Li W, Yu Y, Shu L, Zhao Y, Ma Y, Fang C, Shen Y, Liu T, Li C, Li Q, Wu M, Wang M, Wu Y, Dong Y, Wan W, Wang X, Ding Z, Gao Y, Xiang H, Zhu B, Lee S H, Wang W, Tian Z. Resequencing 302 wild and cultivated accessions identifies genes related to domestication and improvement in soybean., 2015, 33: 408–414.

[31] Kumar V, Singh A, Mithra S V A, Krishnamurthy S L, Parida S K, Jain S, Tiwari K K, Kumar P, Rao A R, Sharma S K, Khurana J, Singh N K, Mohapatra T. Genome-wide association mapping of salinity tolerance in rice (L.)., 2015, 22: 133–145.

[32] Wang C, Yang Y, Yuan X, Xu Q, Feng Y, Yu H Y, Wang Y P, Wei X H. Genome-wide association study of blast resistance inrice., 2014, 14: 1–11.

[33] Dan Z, Kang H, Li Z, Liu M H, Zhu X L, Wang Y, Wang D, Wang Z L, Liu W D, Wang G L. A genome-wide association study of field resistance toin rice., 2016, 9: 44.

[34] 高易宏, 燕金香, 涂政軍, 冷語佳, 陳龍, 黃李超, 代麗萍, 張光恒, 朱麗, 胡江, 任德勇, 郭龍彪, 錢前, 王丹英, 曾大力. 不同氮處理下水稻劍葉葉寬的全基因組關(guān)聯(lián)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50: 2635–2646. Gao Y H, Yan J X, Tu Z J, Leng Y J, Chen L, Huang L C, Dai L P, Zhang G H, Zhu L, Hu J, Ren D Y, Guo L B, Qian Q, Wang D Y, Zeng D L. Genome-wide association analysis on flag leaf width under different nitrogen levels in rice., 2017, 50: 2635–2646 (in Chinese with English abstract).

[35] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA., 1980, 8: 4321–4325.

[36] Dudbridge F, Gusnanto A. Estimation of significance thresholds for genomewide association scans., 2008, 32: 227–234.

[37] Liu L, Zheng C, Kuang B, Wei L, Yan L, Wang T. Receptor-like kinaseinteracts with potassium transporters to regulate pollen tube growth and integrity in rice., 2016, 12: e1006085.

[38] 劉國棟, 劉更另. 秈稻耐低鉀基因型的篩選. 作物學(xué)報, 2002, 28: 161–166. Liu G D, Liu G L. Screeningrice for K-efficient genotypes., 2002, 28: 161–166 (in Chinese with English abstract).

[39] 李華, 楊肖娥, 羅安程. 不同氮鉀條件下水稻基因型氮、鉀積累利用差異. 中國水稻科學(xué), 2002, 16: 86–88. Li H, Yang X E, Luo A C. Genotypic difference in N and K accumulation under different N sources and K levels in rice (L.)., 2002, 16: 86–88 (in Chinese with English abstract).

[40] Kitomi Y, Ito H, Hobo T, Aya K, Kitano H, Inukai Y. The auxin responsivetranscription factoris involved in crown root initiation in rice through the induction of, a type-A response regulator of cytokinin signaling., 2011, 67: 472–484.

[41] Xu J C, Li J Z, Zheng X W, Zou L X, Zhu L H. QTL mapping of the root traits in rice seedling., 2001, 28: 433–438.

Potassium uptake and genome-wide association analysis of rice under different nitrogen levels

ZOU Wei-Wei1, LU Xue-Li2, WANG Li1, XUE Da-Wei3, ZENG Da-Li2,*, and LI Zhi-Xin1,*

1Agronomy Department, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;2China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, Zhejiang, China;3School of Life Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, Zhejiang, China

A total of 134 resequenced rice landraces were used for assessing the potassium content, plant dry weight and potassium accumulation at three different nitrogen levels including no nitrogen fertilizer (N0), 96 kg ha–1(N1), and 192 kg ha–1(N2) under normal field cultivation, respectively. All the three traits displayed normal distribution with abundant variations under N0, N1, and N2 nitrogen levels, respectively. K accumulation and plant dry weight showed positive correlation with nitrogen levels. Meanwhile, the negative correlation was detected between K content and dry weight, and there was positive correlation between dry weight and K accumulation. In addition, the K content showed significantly lower inthan in, while the dry weight and K accumulation inwere significantly higher than those in. A total of 12 SNPs presented significant association with the potassium content, plant dry weight and potassium accumulation under three diferent nitrogen levels, including two SNPs for K accumulation, five SNPs for K content and five SNPs for dry weight. A SNP (Chr6_1,524,776) associated with potassium content on chromosome 6 was detected at N1 level. Its flank contained a receptor-like kinase,, which interacts with potassium transporters in rice. According to the difference of potassium content, one SNP and three SNPs were identified with high nitrogen and low nitrogen response, respectively. While four candidate genes closed to the SNP (Chr10_2,822,026) were associated to K content relatively changed under both high nitrogen and low nitrogen levels, showing different expression levels under different nitrogen levels.

genome-wide association study; potassium content; dry weight; potassium accumulation;

2018-11-22;

2019-01-19;

2019-03-11.

10.3724/SP.J.1006.2019.82058

曾大力, E-mail: dalizeng@126.com; 李志新, E-mail: lizhixin09@163.com

E-mail: 1058510926@qq.com

本研究由主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(MS2015004)資助。

The study was supported by the Hubei Collaborative Innovation Center for Industrialization of Major Grain Crops (MS2015004).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190308.1011.004.html