非授權(quán)轉(zhuǎn)基因作物檢測方法

李夏瑩 劉鵬程 梁晉剛

摘要：目前的轉(zhuǎn)基因生物（GMOs）檢測流程在檢測非授權(quán)轉(zhuǎn)基因生物方面存在很大的局限?；谙乱淮鷾y序（NGS）技術(shù)提出了一個新的工作程序，來克服存在的問題。利用下一代測序技術(shù)高通量獲取DNA的序列信息，可以區(qū)分授權(quán)和非授權(quán)的GMOs?？紤]新檢測流程在官方實驗室的可操作性，還討論了這一創(chuàng)新流程的局限性及其隨時間推移的可持續(xù)性。

關(guān)鍵詞：非授權(quán)轉(zhuǎn)基因生物;創(chuàng)新方法;下一代測序技術(shù);全基因組測序;DNA步移法;NGS誘捕方法

中圖分類號： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0082-04

為了保證食品和飼料鏈安全、可追溯以及消費者的選擇自由，世界上的一些國家已開始為轉(zhuǎn)基因生物立法。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因的法律框架，目的是規(guī)范食品和飼料鏈中轉(zhuǎn)基因生物（GMOs）的引入。為了獲得官方轉(zhuǎn)基因授權(quán)，申請者必須對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行一對一的環(huán)境風(fēng)險分析，提供準(zhǔn)確的使用、保存、標(biāo)識信息。然而，有些立法要求在不同的國家是有差異的，如標(biāo)識閾值（0.9%～5%）。未經(jīng)授權(quán)的GMOs指的是GMOs釋放到某一國家的市場，但沒有經(jīng)過事先的授權(quán)。

市場上可能發(fā)現(xiàn)2種主要的未經(jīng)授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物。第一種情況是非同步審批，轉(zhuǎn)基因生物在一些國家已經(jīng)得到批準(zhǔn)（如美國、加拿大、日本），但在其他國家（如歐盟）還沒有被批準(zhǔn)，或者批準(zhǔn)時限已經(jīng)過期，沒有繼續(xù)申請[1]。這類GMOs被認(rèn)為是安全的，因為利用官方實驗室發(fā)布的轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法可以對其進(jìn)行監(jiān)測的。相比之下，另一種情況更應(yīng)該引起關(guān)注，即偶然或故意導(dǎo)致未經(jīng)許可的GMOs在市場上出現(xiàn)。比如從實驗室或現(xiàn)場試驗釋放出來的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（例如BT10玉米、601水稻、Bt63水稻、PRSV木瓜、mon71800小麥等）[2]。這一類型的非授權(quán)GMOs通常在任何國家都沒有得到任何監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，所以它們可以被認(rèn)為是不安全的和未知的。此外，這一類GMOs通常沒有建立特異性的檢測方法來確保它們在食品和飼料中的可追溯性。本研究所討論的未經(jīng)授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物特指第2類未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生物。

許多國家對非授權(quán)GMOs管理實行零容忍政策（比如歐盟和日本）或閾值管理政策（比如俄羅斯、韓國和瑞士）。不同于授權(quán)的GMOs轉(zhuǎn)基因作物，一個未經(jīng)授權(quán)批準(zhǔn)的GMOs的主要問題是主管機(jī)關(guān)，如歐盟的歐洲食品安全局（EFSA）沒有評估GMOs及其衍生產(chǎn)品的生物安全性。此外，官方實驗室很少制定針對此類GMOs的檢測方法（比如T35S pCAMBIA、gat-tpinll、RVYK木瓜和黃金大米2）[3-16]。因此，檢測非授權(quán)GMOs的高通量方法是保證GMOs在食品和飼料鏈安全可追溯性的關(guān)鍵。

歐盟官方實驗室目前使用的檢測方法是針對歐盟授權(quán)GMOs的實時定量PCR（qPCR）。首先，轉(zhuǎn)基因生物構(gòu)建時常用的元件p35S和tNOS可以覆蓋大多數(shù)的GMOs。篩選步驟針對的是特異性的標(biāo)記物，能夠鑒別不同的GMOs，篩選標(biāo)記物的組合在官方實驗室中各不相同。鑒于大多數(shù)篩選元件來自于自然界，檢測結(jié)果只能表明測試樣本中GMOs的潛在存在。在許多國家如歐盟列出授權(quán)GMOs清單，根據(jù)轉(zhuǎn)化體特異性的檢測方法明確是否存在GMOs。但是，目前定量篩查的工作程序中不包含轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法[3-5，9，11，16-18]。此外，由于非授權(quán)GMOs和授權(quán)GMOs含有相同的轉(zhuǎn)化元件，通過qPCR篩查檢測確定GMOs可以會遺漏可能存在的非授權(quán)的GMOs。例如，含有p35S和tNOS的GTS-40-3-2大豆，這2個元件是GMOs中最常見的，如果篩查這2個元件很難鑒別出授權(quán)和非授權(quán)的GMOs。因此，目前的轉(zhuǎn)基因檢測系統(tǒng)在檢測非授權(quán)的轉(zhuǎn)基因作物方面存在很高的錯誤率。

為了克服以上問題，借助下一代測序（NGS）技術(shù)可以嘗試新的GMOs檢測工作程序（圖1、圖2、圖3）[3，19-20]。

1 下一代測序（NGS）

NGS允許大量樣本的并行DNA測序，這和后續(xù)的生物信息學(xué)分析是不同的，生物信息學(xué)分析依賴于DNA文庫[21]。此外，NGS也不同于傳統(tǒng)的Sanger技術(shù)，NGS可以實現(xiàn)高通量的檢測，同時會減少基因克隆技術(shù)的使用[22]。目前，有2種主要的NGS策略可用于GMOs的檢測。

1.1 全基因組測序（WGS）

WGS適用于序列信息未知的樣本，因此稱為無目標(biāo)NGS。WGS最近有很多在GMOs分子特征描述方面取代Southern blot的成功案例，比如轉(zhuǎn)基因大豆MON17903和MON87704，轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62、TT51-1和 T1c-19[21，23-26]。

1.2 針對目標(biāo)片段的NGS

該方法適用于對目的片段有一定了解的樣本，因此，被稱為有目標(biāo)NGS。目的片段的分離可以通過PCR擴(kuò)增或者借助特異性探針的雜交（磁性小球或芯片），分離的目的片段用于確認(rèn)是否是授權(quán)的GMOs[3，21]。

根據(jù)NGS平臺的不同，后續(xù)使用的生物信息學(xué)分析方法不同。在Illumina平臺，隨機(jī)剪切特定大小的DNA片段用于建立DNA文庫（200～500 bp），用于篩選特定片段的DNA（100、125、150、300 bp）。為明確外源插入的元件和目的基因旁側(cè)序列，以證明檢測樣本中GMOs的存在。對產(chǎn)生短片段從頭測序之后，與篩選片段進(jìn)行比較，找到重疊區(qū)域。利用Pacic Biosciences或Oxford Nanopore，不需要從頭測序，因為這項技術(shù)可以處理基因庫（不同大小的DNA片段），也可以處理長的DNA片段（60 kbp或200 kbp），不需要從DNA文庫中分離NGS的目標(biāo)片段[3，21-27]。

2 非授權(quán)GMOs檢測方法

為了更廣譜地檢測GMOs是否是歐盟授權(quán)，qPCR篩選分析只能作為一個最初的步驟。針對轉(zhuǎn)基因篩選元件的分析存在很大的局限，因為篩選可能同時存在授權(quán)和非授權(quán)的GMOs中，比如p35S、tNOS、t35S pCAMBIA。檢測t35S pCAMBIA可以在一定范圍內(nèi)檢測出樣本中歐盟非授權(quán)GMOs的存在，因為這個元件在授權(quán)GMOs中不存在，但在非授權(quán)GMOs中的存在概率是30%。使用特異性標(biāo)記物檢測非授權(quán)GMOs是非常有必要的，遺憾的是，沒有發(fā)現(xiàn)任何篩選元件可以完全覆蓋非授權(quán)GMOs。檢測p35S、tNOS等通用元件很難判斷非授權(quán)GMOs的存在，因為這些元件在GMOs中是普遍存在的，與是否授權(quán)無關(guān)[28]。

通過qPCR篩選，如果關(guān)鍵的轉(zhuǎn)基因元件出現(xiàn)陽性信號，就要獲取篩選元件旁側(cè)序列信息。這些序列信息會與歐盟已經(jīng)授權(quán)的GMOs進(jìn)行對比，以確認(rèn)樣本中是否含有非授權(quán)的GMOs，目前有2種NGS策略可以實現(xiàn)該目標(biāo)。

2.1 DNA步移法

錨定在檢測轉(zhuǎn)基因元件的DNA步移法，通過NGS方法對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行測序，錨定在p35S、tNOS、t35S pCAMBIA和VIP3A上的DNA步移法，已經(jīng)成功應(yīng)用于GMOs檢測中。包括痕量水平的GMOs、GMOs加工品等[13]。在NGS平臺中，可考慮2種NGS方法。一是Illumina系統(tǒng)，可以產(chǎn)生數(shù)以百萬計的小片段（例如100～300 bp）;二是利用Pacic Biosciences或Oxford Nanopore，這項技術(shù)可以處理基因庫（不同大小的DNA片段），可以處理長的DNA片段（60 kbp或200 kbp），應(yīng)用這種方法，生物信息學(xué)分析的復(fù)雜度會顯著降低，因為整個序列的信息會被直接獲取，而不需要重新將小片段重組為長片段。第2種NGS的特點對于混合有多個含有相同元件的GMOs的樣品很有優(yōu)勢。此外，最近有試驗數(shù)據(jù)表明，DNA步移法結(jié)合Pacic Biosciences在食品和飼料市場被廣泛應(yīng)用[29]。但是，考慮到成本的問題，更為經(jīng)濟(jì)的NGS Illumina平臺將會是一個好的選擇[30]。然而，在常規(guī)轉(zhuǎn)基因分析中使用不同的轉(zhuǎn)基因樣品需要額外的支持實驗數(shù)據(jù)。更重要的是，成功地應(yīng)用該項技術(shù)依賴于數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫應(yīng)包含歐盟授權(quán)的GMOs的轉(zhuǎn)化元件以及旁側(cè)序列，但是目前還沒有這樣的數(shù)據(jù)庫。因此，開發(fā)一個盡可能完整的數(shù)據(jù)庫是最重要的。然而，某些GMOs序列的機(jī)密性可能會使數(shù)據(jù)庫的可訪問性變得更加復(fù)雜。

2.2 NGS誘捕方法

NGS誘捕方法通過特定的雜交探針來捕獲GMOs中常見的元件[31-34]。然而，據(jù)筆者所知，該方法除了在比利時主管當(dāng)局資助的一項研究項目內(nèi)進(jìn)行了初步的試驗外還未被廣泛應(yīng)用。然而，無論是否有一些令人鼓舞的結(jié)果，試驗和數(shù)據(jù)分析仍然需要通過官方實驗室進(jìn)行優(yōu)化。

雜交探針用于未經(jīng)授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物的篩選，必須考慮2個重要方面。首先，使用針對未獲授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物的雜交探針依賴于探針序列的可用性，必須保證捕獲的DNA片段足夠長（至少>500 bp），才便于了解目的片段的旁側(cè)序列[35]。即使NGS捕獲方法可以單獨執(zhí)行，仍建議使用qPCR篩選以提高其有效性，保證快速而廉價地檢測到GMOs。然而，考慮到qPCR篩選的限制，qPCR標(biāo)記物應(yīng)是在GMOs中廣泛存在的（如p35S和tNOS）。對于后續(xù)的NGS誘捕分析，雜交探針的設(shè)置應(yīng)至少包括qPCR篩選為陽性的元件。

考慮到歐盟非授權(quán)的GMOs可能含有qPCR篩選不到的轉(zhuǎn)化元件，NGS全基因組測序可能更方便，因為前期不需要任何信息[20，36-38]。然而，盡管這種方法可以用于樣本中GMOs含量為100%和10%，但是對于痕量的GMOs或者GMOs的混合物還是不適用[36]。例如，有研究數(shù)據(jù)表明，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因大豆含量為0.1%的樣本，從理論上說，須要產(chǎn)生450億的配對讀數(shù)，對應(yīng)的是使用Illumina Hiseq系統(tǒng)運(yùn)行大約20次。此外，生物信息學(xué)分析對專業(yè)知識的要求也很高[20，36]。因此，須要開發(fā)便于官方實驗室使用的分析工具。在這些不方便的情況下，WGS方法代表了一種很有前途的策略，可以在市場上監(jiān)控轉(zhuǎn)基因生物，包括在GMOs常規(guī)分析中所遇到的大多數(shù)樣品，是沒有任何關(guān)于目標(biāo)序列的背景信息的。

3 結(jié)束語和展望

新的工作流程有望改進(jìn)目前針對非授權(quán)GMOs的檢測流程，工作流程有2個主要的優(yōu)點：一是該檢測流程有助于官方實驗室更好地檢測非授權(quán)GMOs。序列信息被確認(rèn)的歐盟非授權(quán)GMOs可以在前期的qPCR篩選中被覆蓋。另一方面，NGS技術(shù)的高通量性能可以大幅度增加每次測試的樣本數(shù)量。通過這種方式，檢測市場產(chǎn)品中非授權(quán)GMOs是可以負(fù)擔(dān)得起的，這與目前的轉(zhuǎn)基因檢測系統(tǒng)不一樣。

目前，生物技術(shù)作物可以通過基因編輯技術(shù)研發(fā)，但歐盟主管部門還未確定這些生物的監(jiān)管方法，美國、澳大利亞、新西蘭、阿根廷等國提出使用新的工作程序來監(jiān)控此類生物?？煽紤]通過WGS去檢測qPCR篩選不到的歐盟非授權(quán)GMOs，如基因組發(fā)生了很小的修飾（比如改變1個或幾個堿基對）的GMOs。最近通過使用CRISPR/Cas9方法獲得了抗褐變白蘑菇、耐除草劑玉米以及抗豬繁殖和呼吸綜合征病毒的豬;2016年初，美國主管部門裁定，通過該技術(shù)獲得的菌菇不受美國農(nóng)業(yè)部法規(guī)的約束[39-44]。

因此，由于新檢測程序的眾多優(yōu)點，它可以靈活應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物和新技術(shù)研發(fā)的生物。在歐盟，常規(guī)的轉(zhuǎn)基因檢測主要用于評估食品鏈和飼用鏈中歐盟授權(quán)的轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識的正確性。然而，考慮到公眾健康和消費者的自由選擇權(quán)，檢測非授權(quán)的GMOs應(yīng)具有更高的優(yōu)先權(quán)，因為非授權(quán)GMOs沒有經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)的生物安全評估，對人、動物的健康以及環(huán)境存在潛在的風(fēng)險。因此，應(yīng)該盡更大的精力研究非授權(quán)GMOs，在歐盟當(dāng)局和世界范圍內(nèi)認(rèn)真討論這個問題是很重要的。歐盟的主管部門已將非授權(quán)GMOs的檢測作為重點工作，已經(jīng)發(fā)布的“Decision 2013/287/EU”建立了檢測食用鏈和飼用鏈中非授權(quán)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法。此外，允許食用鏈和飼用鏈中非授權(quán)GMOs檢測信息快速交流的食品和飼料快速警報系統(tǒng)（RASFF）也在歐盟被廣泛應(yīng)用[5，19]。

這些創(chuàng)新的工作程序很有可能在未來的幾年變成現(xiàn)實。然而，在官方實驗室推廣使用這項技術(shù)存在難度。因為大多數(shù)官方實驗室都是使用qPCR的方法，一些新技術(shù)比如NGS須要投入專業(yè)的人才和計算機(jī)設(shè)備[19-20，45]，預(yù)計創(chuàng)新的檢測程序只能在少數(shù)具有代表性的官方實驗室執(zhí)行。

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