熒光探針法檢測(cè)活性羰基化合物甲醛的研究進(jìn)展

吳少平, 阮淞淞, 宋歡歡

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/糖生物學(xué)及藥物化學(xué)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

活性羰基物種(reactive carbonyl species, RCS)包括大量的含有一個(gè)或多個(gè)羰基的生物化合物,這些化合物在從細(xì)菌到人類的各種有機(jī)體中不斷產(chǎn)生。RCS是一種廣泛存在于生物生命中的化合物,可以是內(nèi)源性化合物,也可以是外源性化合物。外源性來源包括一些RCS,如丙烯醛、巴豆醛、乙二醛、丙酮和甲醛等,它們是普遍存在的工業(yè)污染物,很容易從環(huán)境中進(jìn)入細(xì)胞[1-3],其他外源性RCS包括有機(jī)藥物,香煙煙霧,食品添加劑和褐變食物的產(chǎn)物[4-9];內(nèi)源性來源主要由細(xì)胞內(nèi)多種不穩(wěn)定的RCS很容易通過脂質(zhì)過氧化、氨基酸氧化和糖基化等非酶過程產(chǎn)生[10-17]。

RCS主要包括甲醛(FA)、甲基乙二醛(MGO)、丙二醛(MDA)、丙烯醛、丙醛、乙二醛、乙醛、4-羥基壬烯醛、草酰乙酸、丙酮酸等[18]。正常情況下,RCS的穩(wěn)態(tài)濃度保持在一定范圍內(nèi),當(dāng)RCS水平發(fā)生變化,會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病理變化。如活性羰基化合物穩(wěn)態(tài)水平的增加是導(dǎo)致羰基應(yīng)激、衰老、代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制、與糖尿病和腎功能衰竭相關(guān)的慢性并發(fā)癥、神經(jīng)退行性疾病和其他疾病的關(guān)鍵原因[10-11,19,25]。因此,羰基應(yīng)激在許多慢性和退行性疾病中具有臨床意義,包括糖尿病、肥胖、腎臟和心臟疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病。另一方面,細(xì)胞中持續(xù)存在低濃度的RCS,可以認(rèn)為是RCS作為免疫應(yīng)答,基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要組成部分的出現(xiàn)[10,12,25]。目前,已在生物樣本中確定了20多種RCS[12]。圖1顯示了在生物中檢測(cè)到的最常見的飽和RCS和不飽和RCS。因活性羰基物種對(duì)人類健康與環(huán)境的影響巨大,所以開發(fā)一種用于高效檢測(cè)活性羰基物種的技術(shù)手段極其重要。

甲醛(formaldehyde, FA)作為一種簡(jiǎn)單的醛基化合物,因其含有活性極高的羰基,化學(xué)性質(zhì)活潑,已被認(rèn)為是從人類的自然毒物和致癌物,其主要釋放途徑包括生物質(zhì)燃燒、腐殖質(zhì)的日曬降解、植被和微生物的分解排放以及植被和微生物的產(chǎn)生;以及其他人為來源,如甲醛工業(yè)生產(chǎn)、汽車尾氣排放等[26]。根據(jù)IARC[27]定義,甲醛屬于第一類人類和動(dòng)物致癌物,也是世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)的第三大室內(nèi)污染物,它不僅是各種材料和化學(xué)物質(zhì)中所含的室內(nèi)污染物,而且是一種天然化合物和人為產(chǎn)物[28-29]。甲醛廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,如材料、涂料、農(nóng)藥、化妝品、藥品等行業(yè)。同時(shí),由于甲醛具有出眾的DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)特性,這也使得其成為一種性能出眾的組織固定劑和防腐劑[26,30-31]。與此同時(shí),甲醛卻也是一種常見的內(nèi)源性生化反應(yīng)產(chǎn)物,體內(nèi)正常穩(wěn)定的甲醛含量對(duì)于人體的健康有著非常重要的意義。外源性的甲醛可通過呼吸作用、皮膚滲透或其他渠道進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)人體的健康造成損害,引起多種疾病[32],如心臟疾病[33]、阿爾茨海默病[33]、癌癥[34]。若過量攝入會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害導(dǎo)致記憶力和認(rèn)知能力下降[33,35],甚至可能危及生命[36,38]。內(nèi)源性醛是一類活性很強(qiáng)的分子,因?yàn)樗鼈儠?huì)導(dǎo)致醛-DNA加合物的形成,從而導(dǎo)致許多疾病,如酒精相關(guān)疾病、阿爾茨海默病、痛覺過敏和腎病[37]。甲醛可以通過中性粒細(xì)胞酶髓過氧化物酶,氧化酶和去甲基化的作用內(nèi)源性地產(chǎn)生,這是一種常見的生化過程[38]。

圖1 常見的生物活性羰基物種的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of common biological reactive carbonyl species

研究表明,在健康的人體大腦中,甲醛含量在0.2～0.4 mmol/L的范圍內(nèi),同時(shí)大腦中的甲醛通過參與DNA脫甲基化,可以起到存儲(chǔ)、保護(hù)、檢索以及恢復(fù)長(zhǎng)期記憶的作用[39]。人血中甲醛的正常水平為0.06～0.08 mmol/L[40]。而在細(xì)胞當(dāng)中,在甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase)、S-硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitro-soglutathione reductase)以及乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2)等酶的作用下,甲醛在細(xì)胞內(nèi)濃度為400 μM[41,44]。已知較高水平的甲醛可導(dǎo)致各種疾病,如呼吸系統(tǒng)疾病[45]、畸形胚胎[46]、慢性肝臟及心臟疾病[47]、糖尿病[48]、阿爾茨海默病[47,49]和癌癥[37,50-51]。所以,對(duì)環(huán)境及生物體內(nèi)甲醛的準(zhǔn)確定量檢測(cè)有著非常重要意義,這也使得近年來對(duì)甲醛的檢測(cè)與研究逐漸成為研究熱點(diǎn)。甲醛普遍存在于空氣、水和工業(yè)產(chǎn)品中。因此,大氣中痕量甲醛的定量測(cè)定可能是環(huán)境污染中最具挑戰(zhàn)性的問題,也是最常見的問題。上述問題不僅在公共衛(wèi)生方面發(fā)揮著雙重作用,而且在工業(yè)發(fā)展中也起著雙重作用。因此，開發(fā)高效、高靈敏度、高選擇性的化學(xué)傳感器等簡(jiǎn)便、選擇性、可靠的甲醛檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

目前常見的檢測(cè)甲醛方法主要有放射性試驗(yàn)法(radiometric assays)[52],高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[53],選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜法(selected ion flow tube mass spectrometry,SIFT-MS)[54]以及化學(xué)衍生氣相色譜法(GC analyses following chemical derivatization)[55]等。然而，上述這些方法的不足是顯而易見的,它們的選擇性及靈敏度仍有待提高且會(huì)對(duì)活體細(xì)胞及組織造成無法修復(fù)的損害。而熒光探針具有實(shí)時(shí)性、較高的靈敏度和選擇性,低生理學(xué)毒性且具有單一選擇性及強(qiáng)抗干擾性等優(yōu)點(diǎn)使得其在甲醛的檢測(cè)上有著無可比擬的優(yōu)勢(shì),是生物小分子檢測(cè)和酶活性檢測(cè)的首選分析工具[56,62]。因此,發(fā)展利用熒光探針對(duì)甲醛進(jìn)行檢測(cè)的熒光光譜法得到了廣泛的重視和越來越多的研究。

近年來關(guān)于檢測(cè)甲醛的熒光探針越來越受到研究人員的重視并得到了越來越廣泛的研究與應(yīng)用。同時(shí),關(guān)于甲醛探針的報(bào)道越來越多,本文基于甲醛與探針分子間的反應(yīng)類型,總結(jié)了常見的用于檢測(cè)甲醛的熒光探針小分子,并對(duì)探針分子的識(shí)別機(jī)理及應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)與歸納。

1 基于Aza-cope重排反應(yīng)的探針

Aza-cope重排反應(yīng)是有機(jī)化學(xué)中的重要合成方法。1,5-二烯類化合物在受熱條件下發(fā)生[3,3]-σ遷移的反應(yīng)稱為Cope重排。而氮雜的1,5-二烯在加熱條件下通過[3,3]-σ重排異構(gòu)化的反應(yīng)被稱為aza-Cope重排反應(yīng)。Aza-cope重排反應(yīng)機(jī)理見圖2。

圖2 Aza-cope重排的機(jī)理Fig.2 Mechanism of aza-cope reaction

2015年Chang[63]課題組設(shè)計(jì)利用甲醛誘導(dǎo)的2-aza-Cope重排反應(yīng)的“Turn-on”型探針1(如圖3所示),這是第一代基于aza-Cope重排反應(yīng)的熒光探針,可用于檢測(cè)活細(xì)胞中的甲醛。探針1以氨基甲基硅羅丹明染料為骨架,連有一個(gè)高烯丙基胺基和一個(gè)閉合的五元環(huán)。探針1在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液的水溶性良好,并且有微弱熒光,其熒光量子產(chǎn)率(Φ)為0.36。加入甲醛后探針在645 nm處的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間逐漸增強(qiáng)。當(dāng)探針1與甲醛反應(yīng)時(shí),形成亞胺中間體,隨后發(fā)生高烯丙基胺基的2-aza-Cope重排和水解產(chǎn)生了熒光較強(qiáng)的醛產(chǎn)物。探針1對(duì)甲醛表現(xiàn)出良好的選擇性和高靈敏度。此外,探針1能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的外源性甲醛和人胚腎細(xì)胞(HEK293TN cells)中賴氨酸特異性蛋白酶去甲基化產(chǎn)生的內(nèi)源性產(chǎn)生的甲醛。探針1在活細(xì)胞中檢測(cè)甲醛的應(yīng)用,為在表觀遺傳,衰老和病理生理過程中探測(cè)活性羰基化合物提供了研究方向。

圖3 探針1的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.3 Structure of probe 1 and detection mechanism of formaldehyde

Roth和Chan[64]課題組等于2015年設(shè)計(jì)了一種基于2-aza-Cope重排反應(yīng),以硅羅丹明為骨架合成檢測(cè)活細(xì)胞中FA的探針2(如圖4所示)。探針2由3部分組成:黑色為羅丹明結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán),藍(lán)色為FA識(shí)別基團(tuán),紅色為猝滅基團(tuán)。為了優(yōu)化檢測(cè)的靈敏度加入了4-硝基芐基,通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(d-PeT)降低探針2的背景熒光。在FA存在下,探針2通過可逆縮合反應(yīng)生成一種亞胺中間體,該中間體可以通過電荷促進(jìn)[3,3]-σ鍵遷移重排,水解使4-硝基芐基離去,阻斷了a-PeT過程,得到強(qiáng)熒光性質(zhì)的醛產(chǎn)物。探針2對(duì)FA有良好的選擇性和高的靈敏度,可用于人胚腎細(xì)胞(HEK293TN cells)和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(NS1 cells)的活細(xì)胞成像。此外,探針2具有很好的光穩(wěn)定性,在延時(shí)成像實(shí)驗(yàn)中,可以實(shí)時(shí)捕捉探針2與FA之間的反應(yīng)。探針2為闡明FA在活細(xì)胞中的生理作用提供了技術(shù)手段。

與傳統(tǒng)的單光子成像技術(shù)相比,雙光子成像利用兩個(gè)近紅外激光來激發(fā)熒光探針,具有比單光子更少的光漂白、光毒性、細(xì)胞自發(fā)熒光和組織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)。Li和Yuan等[65]于2016年設(shè)計(jì)了一種基于2-aza-Cope重排反應(yīng)的“Turn-on”型雙光子熒光探針3(如圖5所示),它可以選擇性和靈敏地檢測(cè)甲醛。探針3以萘衍生物作為熒光團(tuán)(黑色部分),高烯丙基胺基作為甲醛的識(shí)別基團(tuán),又引入硝基芐基作為猝滅基團(tuán)(紅色部分),采用d-PeT來降低探針的背景熒光。探針3本身幾乎沒有熒光,當(dāng)與甲醛反應(yīng)時(shí),形成亞胺中間體,隨后高烯丙基胺基重排和水解,生成具有D-π-A結(jié)構(gòu)的雙光子熒光產(chǎn)物“開啟”熒光。探針3有良好的光物理性質(zhì),在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)有較高的選擇性,其檢測(cè)限為0.2 μmol/L。此外,探針3具有良好的光穩(wěn)定性,可用于活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性甲醛的檢測(cè),并且具有較低的細(xì)胞毒性和自熒光性。探針3有良好的組織穿透和染色能力,適用于組織水平的甲醛的檢測(cè)。這些研究都表明探針3在生物內(nèi)檢測(cè)甲醛分子具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 探針2的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.4 Structure of probe 2 and detection mechanism of formaldehyde

圖5 探針3的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.5 Structure of probe 3 and detection mechanism of formaldehyde

2016年Bruemmer和Chang課題組[66]等基于2-aza-Cope重排反應(yīng)在4-OMe-Tokyo Green(TG)熒光骨架上設(shè)計(jì)了一種可在活細(xì)胞中檢測(cè)甲醛的探針4(如圖6,7所示)。探針4通過游離酚類基團(tuán)來阻礙熒光團(tuán)呫噸酮部分的共軛作用,從而使探針本身沒有熒光。當(dāng)與甲醛反應(yīng)時(shí),探針4中的高烯丙基胺通過aza-Cope重排形成亞胺,隨后探針發(fā)生自分解和水解生成一種熒光較強(qiáng)的酚鹽和副產(chǎn)物高烯丙基胺以及丙烯醛。因此,基于2-aza-Cope重排反應(yīng),通過自分解將含酚的熒光團(tuán)釋放來選擇性檢測(cè)甲醛的熒光探針將成為一種新的設(shè)計(jì)思路。

圖6 探針4的檢測(cè)機(jī)理Fig.6 Detection mechanism of probe 4

圖7 探針4的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.7 Structure of probe 4 and detection mechanism of formaldehyde

圖8 探針5的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.8 Structure of probe 5 and detection mechanism of formaldehyde

2016年He和Lin課題組[67]等設(shè)計(jì)并合成了一種基于6-羥基萘為熒光團(tuán)的甲醛比率型熒光探針5(如圖8所示)。探針5在含1%(體積分?jǐn)?shù))丙酮的磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L, pH 7.4)中與甲醛反應(yīng)后,在359 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減低,而在451 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),在發(fā)射譜上產(chǎn)生了明顯的紅移(92 nm),兩個(gè)不同的發(fā)射峰(I451/I359)的比值顯著增加(53.2倍)。探針5在pH 7.4下的檢測(cè)限為5.96×10-5mol/L,在pH 4.5下的檢出限為1.87×10-5mol/L,低于pH 7.4時(shí)的檢出限。探針5中的高烯丙基氨基為甲醛的識(shí)別基團(tuán),可與甲醛反應(yīng)生成亞胺中間體,該中間體進(jìn)一步經(jīng)過2-aza-Cope重排和水解,生成吸電子能力較強(qiáng)的醛基化合物。因此,在較低的pH值下探針更容易形成亞胺中間體,從而促進(jìn)探針與甲醛間的作用過程。同時(shí)通過密度泛函理論計(jì)算驗(yàn)證了探針與甲醛反應(yīng)的機(jī)理,并且能夠在HeLa細(xì)胞上進(jìn)行熒光成像,獲得了良好的比值信號(hào)。探針5不僅適用于溶液中甲醛含量的測(cè)定,而且適用于具有兩個(gè)不同發(fā)射帶的生物樣品中甲醛的測(cè)定。因此對(duì)生物環(huán)境中監(jiān)測(cè)甲醛具有重要意義,所以探針5在定量測(cè)定水溶液中甲醛方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

圖9 探針6的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.9 Structure of probe 6 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Xie和Zhu課題組等[68]報(bào)道了一種新型“Turn-on”型雙光子熒光探針6(如圖9所示),該探針以具有較大斯托克斯位移和高光穩(wěn)定性的4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺染料作為雙光子結(jié)構(gòu)的母核。在探針6的3位上引入強(qiáng)吸電子基團(tuán)醛基,會(huì)降低1,8-萘二甲酰亞胺的推拉能力,從而進(jìn)一步增強(qiáng)ICT效應(yīng)。同時(shí),這種醛可以通過反應(yīng)轉(zhuǎn)化為甲醛的識(shí)別基團(tuán)高烯丙基胺基。當(dāng)探針6與甲醛反應(yīng)后,形成亞胺中間體。隨后,發(fā)生電荷促進(jìn)的[3,3]-σ重排反應(yīng),并隨后進(jìn)行亞胺水解以形成最終產(chǎn)物醛,發(fā)出熒光。探針6在10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.4, 0.5%體積 DMSO)中,在448 nm處具有強(qiáng)的紫外吸收峰,熒光發(fā)射波長(zhǎng)為550 nm,Φ=0.469,而加入甲醛后探針6發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象,最大吸收波長(zhǎng)變?yōu)?15 nm,最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)變?yōu)?20 nm,Φ=0.74。探針與甲醛在濃度0～0.5 mmol/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R2=0.994 6),其檢測(cè)限為5 μmol/L。此外,雙光子細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)證明探針6能夠檢測(cè)HeLa細(xì)胞和斑馬魚中的甲醛分子,對(duì)細(xì)胞膜有很好的穿透性,從而使探針能夠在更多的生物醫(yī)學(xué)研究中成為一個(gè)很有前景的工具。

2017年Brewer和Chang課題組[69]等報(bào)道了一系列用于檢測(cè)生物系統(tǒng)中甲醛的比率型熒光探針7a，7b，7c(如圖10所示),探針7a，7b，7c以久洛尼定香豆素為熒光母核,連有高烯丙基胺基作為甲醛識(shí)別基團(tuán)。檢測(cè)時(shí),探針與甲醛的縮合引發(fā)2-aza-Cope重排,隨后水解釋放具有紅移激發(fā)波長(zhǎng)的醛產(chǎn)物,從而產(chǎn)生比率熒光。但反應(yīng)速度緩慢,探針7a的雙分子速率常數(shù)為0.017 mol/(L·s)-1,限制了其在生物系統(tǒng)中檢測(cè)FA的應(yīng)用。為了加快探針對(duì)甲醛檢測(cè),在探針7的高烯丙基胺基上連接偕二甲基得到探針7b,這種偕二烷基取代基能通過Thorpe-Ingold效應(yīng)加速與環(huán)狀過渡態(tài)的反應(yīng),可以顯著提高aza-Cope重排的速率,探針7b的雙分子速率常數(shù)為0.12 mol/(L·s)-1,與探針7a相比,速率增加了約7倍。探針7b可用于HEK293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)的甲醛成像,采用點(diǎn)狀染色模式時(shí),對(duì)亞細(xì)胞定位不均勻,這可能對(duì)其在其他細(xì)胞類型中的應(yīng)用造成潛在的限制。為了使探針在不同細(xì)胞類型上表現(xiàn)出更均勻的染色和亞細(xì)胞定位,同時(shí)保持對(duì)甲醛的高選擇性,對(duì)探針7b的羥丙基側(cè)鏈進(jìn)行修飾。鏈接一個(gè)含有乙二醇-己基氯化物的酰胺,使探針在細(xì)胞中顯示出明顯改善的染色效果,得到了探針7c。探針7c也可用于HEK293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)的甲醛成像,同時(shí),在HEK293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)中呈現(xiàn)出均勻的染色模式,表明其在研究甲醛生物學(xué)方面具有更廣泛的應(yīng)用。此外,探針7c還可用于檢測(cè)下細(xì)胞中內(nèi)源性甲醛的濃度和代謝的變化。

2017年,Xie和Tang課題組[70]等設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)溶酶體中甲醛分子的雙光子熒光探針8(如圖11所示),探針8通過甲醛識(shí)別基團(tuán)高烯丙基胺橋?qū)⒕哂袉徇妮炼柞啺穪喗Y(jié)構(gòu)與香豆素結(jié)構(gòu)相結(jié)合構(gòu)成的,而在探針中引入嗎啉基團(tuán)有助于探針分子靶向溶酶體。探針8的激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm,在566 nm處表現(xiàn)出較弱的熒光發(fā)射,因香豆素部分的熒光被萘酰亞胺猝滅,所以顯示萘酰亞胺熒光團(tuán)的特征發(fā)射峰。當(dāng)探針8與甲醛反應(yīng)時(shí),探針的高烯丙基胺橋裂解,萘酰亞胺結(jié)構(gòu)和香豆素結(jié)構(gòu)發(fā)生解離,導(dǎo)致發(fā)射最大值從566藍(lán)移至506 nm,主要顯示香豆素?zé)晒鈭F(tuán)的特征發(fā)射峰。探針加入甲醛后,在pH 4.0～6.0時(shí)表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的熒光,與溶酶體的生理pH范圍一致。探針在FA濃度為10～250 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出極好的線性關(guān)系(R2=0.993 0),檢測(cè)限為3.0 μmol/L。此外,探針8能夠在活細(xì)胞和組織中檢測(cè)甲醛分子,并且只對(duì)溶酶體中的甲醛分子有響應(yīng),可以避免中性細(xì)胞溶質(zhì)和其他細(xì)胞器中甲醛的干擾,提高了空間分辨率和準(zhǔn)確性?？傊?探針8能夠通過雙光子熒光成像成功地應(yīng)用于活體細(xì)胞和動(dòng)物中甲醛分子的原位可視化,為闡明與甲醛相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供了一種有潛力的分子工具。

圖10 探針7的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.10 Structure of probe 7 and detection mechanism of formaldehyde

圖11 探針8的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.11 Structure of probe 8 and detection mechanism of formaldehyde

2017年,Singha和Ahn等[71]設(shè)計(jì)了一種雙光子比率型甲醛探針9(如圖12所示),探針9是在1-(萘-2-基)吡咯烷上連有一個(gè)仲-高烯丙胺基所構(gòu)成的。在用甲醛處理后,探針將形成亞胺離子,其經(jīng)歷2-aza-Cope重排后水解,誘導(dǎo)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT),進(jìn)而得到6-(吡咯烷-1-基)-2-萘甲醛,一種供體-受體型雙光子吸收染料。選擇吡咯烷基團(tuán)作為染料的電子供體部分,因其與傳統(tǒng)的N,N二甲氨基供體相比,能在水介質(zhì)中產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。探針9本身在438 nm處顯示出強(qiáng)烈的藍(lán)色發(fā)射。在加入甲醛后,探針在438 nm處的發(fā)射逐漸減少,而在533 nm處出現(xiàn)新峰。探針9在甲醛濃度為200～400 μmol/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,檢測(cè)限為10 μmol/L,pH耐受范圍為4.0～7.4。此外,探針9可用于MCF7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)、小鼠組織及器官中內(nèi)源性甲醛分子的檢測(cè)。

圖12 探針9的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.12 Structure of probe 9 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Li和Qian等[72]報(bào)道了第一個(gè)基于2-aza-Cope重排反應(yīng)的用于檢測(cè)植物組織內(nèi)源甲醛的比率型熒光探針10(如圖13所示)。探針10以N,N-二甲基喹啉-6-胺結(jié)構(gòu)作為熒光母核,高烯丙基胺基為甲醛的識(shí)別基團(tuán)。探針與甲醛反應(yīng)后,高烯丙基胺基形成亞胺中間體,然后發(fā)生重排和水解產(chǎn)生醛產(chǎn)物,發(fā)生熒光性質(zhì)變化。探針10在254 nm和353 nm處顯示出兩個(gè)紫外吸收峰,熒光發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm,加入甲醛后,分別在277 nm和429 nm處有兩個(gè)紫外吸收峰,在570 nm處熒光發(fā)射峰增強(qiáng),在495 nm處熒光發(fā)射峰減弱,均發(fā)生了紅移。探針10的pH耐受范圍為3.0～11.0,在與甲醛濃度(0～200 μmol/L)之間存在極好的線性關(guān)系(R2=0.988 3),在水溶液中的檢測(cè)限為0.5 μmol/L。此外,探針可對(duì)擬南芥活體根尖組織的內(nèi)源性甲醛進(jìn)行成像。同時(shí),探針能夠檢測(cè)實(shí)際水樣中的甲醛,并能夠用于定位擬南芥活組織中的內(nèi)源性甲醛,實(shí)現(xiàn)對(duì)外源性甲醛和內(nèi)源性甲醛的檢測(cè)。綜上,探針10為應(yīng)用于其他植物甲醛分子的熒光成像,更好地了解其代謝機(jī)制及甲醛相關(guān)生理病理研究的進(jìn)展提供了方法。

圖13 探針10的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.13 Structure of probe 10 and detection mechanism of formaldehyde

2017年,You和Chen等[73]設(shè)計(jì)了一種新的基于ICT的比率型熒光探針11(如圖14所示),

圖14 探針11的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.14 Structure of probe 11 and detection mechanism of formaldehyde

探針11以苯基菲并咪唑?yàn)闊晒饽负?高烯丙基胺基為甲醛識(shí)別基團(tuán)。因高烯丙基胺基阻礙了ICT過程,探針本身無熒光。與甲醛反應(yīng)后,高烯丙基胺基先形成亞胺離子,再進(jìn)行2-aza-Cope重排,最終水解生成醛產(chǎn)物恢復(fù)ICT過程發(fā)出熒光。探針11在440 nm處呈現(xiàn)熒光發(fā)射,Φ=0.62。加入甲醛后,在440 nm處的發(fā)射峰降低,在520 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的發(fā)射峰,Φ=0.51,熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移。探針11的檢測(cè)限為0.84 μmol/L。除此之外,探針11能夠?qū)eLa細(xì)胞的內(nèi)源性甲醛進(jìn)行成像和定量,還可對(duì)斑馬魚和小鼠腎組織的內(nèi)源性甲醛進(jìn)行成像。探針11具有量子產(chǎn)率高、響應(yīng)快和檢測(cè)限低等優(yōu)異的性能,有望成為進(jìn)一步探索生物系統(tǒng)中甲醛生物學(xué)機(jī)制的有效工具。

2018年Zhou和Xiao課題組[74]設(shè)計(jì)了一種可在水溶液、血清和空氣中檢測(cè)甲醛的新型的基于aza-Cope反應(yīng)的比率型甲醛熒光探針12(如圖15所示)。探針以2-(2-羥基苯基)苯并噻唑作為熒光母核,pro-aza-Cope重排部分高烯丙基胺基作為甲醛的反應(yīng)位點(diǎn)。探針12在pH 7.4, 10 mmol/L PBS緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)40%CH3CN)中,在333nm處有最大紫外吸收峰,在462 nm處顯示出一個(gè)強(qiáng)熒光發(fā)射峰。加入不同濃度甲醛后,隨著甲醛濃度的增加,探針在333 nm處的紫外吸收峰下降,而在425 nm處的紫外吸收峰增大,并在355 nm和395 nm處分別有一個(gè)等當(dāng)點(diǎn)。同時(shí),探針在541 nm處(79 nm的紅移)的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增加,而在462 nm處的熒光發(fā)射峰逐漸降低。這是因甲醛將能夠通過aza-Cope重排反應(yīng)將富電子的pro-aza-Cope重排部分轉(zhuǎn)化為缺電子的醛基,產(chǎn)生強(qiáng)大的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)過程導(dǎo)致探針的熒光帶發(fā)生紅移,并提供比率型熒光信號(hào)。在pH 7.4, 10 mmol/L PBS緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)40%CH3CN)中,探針與甲醛(0～30 mmol/L)的發(fā)射比(I541/I462)成良好的線性正比,檢測(cè)限為4.1×10-4mol/L。此外,探針12成功的應(yīng)用于對(duì)小牛血清中甲醛和氣態(tài)甲醛的檢測(cè),并且探針12在生物系統(tǒng)進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行,為生物系統(tǒng)及環(huán)境中檢測(cè)甲醛提供了有力的工具。

圖15 探針12的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.15 Structure of probe 12 and detection mechanism of formaldehyde

2018年,Zhao和Yin課題組[75]等基于2-aza-Cope重排反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種可檢測(cè)氣態(tài)甲醛的“Turn-on”型熒光探針13(如圖16所示)。在已經(jīng)報(bào)道過的探針中大多是由具有聚集猝滅(ACQ)特征的熒光團(tuán)構(gòu)成,它們?cè)诰奂癄顟B(tài)下發(fā)出微弱的熒光,需要在溶劑中分散,只能在溶液中檢測(cè)FA。與ACQ熒光團(tuán)相比,聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)熒光團(tuán)能夠在聚集狀態(tài)下發(fā)射出強(qiáng)熒光,更適合制備便攜式固體傳感器,實(shí)現(xiàn)對(duì)氣態(tài)甲醛的簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)。探針13以聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)熒光團(tuán)四苯基乙烯為熒光母核,高烯丙基胺基作為甲醛識(shí)別位點(diǎn),并加入4-硝基芐基(Ph-NO2)作為熒光猝滅基團(tuán)。高烯丙基胺可以通過2-aza-Cope重排與甲醛反應(yīng)并釋放熒光猝滅劑以實(shí)現(xiàn)熒光“Turn-on”。最初,探針13由于電子供體和電子受體之間的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)而具有弱熒光(固態(tài)熒光量子產(chǎn)率ΦFS=2.64%)。在與甲醛反應(yīng)后,探針變成高發(fā)射性化合物(ΦFS=35.42%)具有較強(qiáng)熒光,并且在酸性(pH<5)溶液中能催化探針13與甲醛的反應(yīng)?；谔结樀腁IE特性,作者通過在高效薄層色譜硅膠板上直接加載探針制備了便攜式固體傳感器,即甲醛測(cè)試板。甲醛測(cè)試板在504 nm處的熒光強(qiáng)度和氣態(tài)甲醛在濃度為0～1.6 mg/m3范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.998 3),檢出限為0.036 mg/m3,低于世界衛(wèi)生組織建議的空氣質(zhì)量指標(biāo)值0.1 mg/m3。甲醛測(cè)試板實(shí)現(xiàn)了對(duì)氣態(tài)甲醛的靈敏、選擇性和定量檢測(cè),易于用肉眼觀察,適用于檢測(cè)室內(nèi)空氣中的氣態(tài)甲醛,且具有便攜性,與基于溶液的傳感器相比,使用和運(yùn)輸更加安全方便,為開發(fā)便攜式甲醛傳感器提供了新的設(shè)計(jì)思路。

圖16 探針13的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.16 Structure of probe 13 and detection mechanism of formaldehyde

圖17 探針14的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.17 Structure of probe 14 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Yang和Lin課題組[76]等報(bào)道了一個(gè)新的基于ICT的“Turn-on”型甲醛探針14(如圖17所示)。探針14以吡咯烷基苯并口惡二唑?yàn)闊晒饽负?高烯丙基胺基作為甲醛反應(yīng)位點(diǎn),其中苯并口惡二唑是一種典型的基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)的熒光染料。由于高烯丙基胺基的吸電子能力較差,探針最初沒有熒光。然而,與甲醛反應(yīng)后,高烯丙基胺基將通過縮合反應(yīng)生成亞胺中間體,亞胺中間體進(jìn)一步發(fā)生2-aza-Cope重排和水解,最終生成醛類衍生物,是一種具有高效ICT性能的強(qiáng)熒光物質(zhì)。當(dāng)向探針溶液中加入80當(dāng)量的甲醛時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到了最大值,熒光強(qiáng)度提高了265.5倍(量子產(chǎn)率從0.003 2顯著提高到0.061 5)。探針在563 nm處的發(fā)射強(qiáng)度值與0～100 μmol/L和200～500 μmol/L范圍內(nèi)的甲醛濃度成線性關(guān)系,表明探針14能夠廣泛定量測(cè)定水溶液中甲醛的濃度范圍。探針對(duì)于甲醛低濃度和高濃度水平,檢測(cè)限分別為4.35×10-8mol/L和4.97×10-8mol/L。此外,探針14可用于HeLa細(xì)胞中甲醛分子的生物成像。探針14不僅適用于檢測(cè)水溶液和活細(xì)胞中的甲醛,同時(shí),為甲醛的檢測(cè)和設(shè)計(jì)高信噪比熒光甲醛探針提供一個(gè)新的工具和新的思路。

2 基于取代基NHNH2與甲醛反應(yīng)的探針

2015年Liu和Li等[77]設(shè)計(jì)一種基于PET的甲醛熒光探針15(如圖18所示),以8-羥基喹啉與苯并噻唑共軛構(gòu)成了熒光探針15,以NHNH2作為甲醛的識(shí)別基團(tuán),通過甲醛與肼的肼?；磻?yīng)生成甲肼。探針15在水溶液中顯示出微弱的熒光,加入甲醛后,在467 nm處的熒光增強(qiáng)5.5倍。探針與甲醛可在0～1.3×10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,并能夠?qū)ζ溥M(jìn)行定量檢測(cè),檢測(cè)限低至900 nmol/L。探針15還可用于檢測(cè)魚片、魷魚絲、魚腐竹、干海草等幾種商品食品中的甲醛殘留量。

圖18 探針15的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.18 Structure of probe 15 and detection mechanism of formaldehyde

圖19 探針16的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.19 Structure of probe 16 and detection mechanism of formaldehyde

2016年Liu和Sun課題組[78]等報(bào)道了一個(gè)以1,8-萘二甲酰亞胺為母體的甲醛熒光探針 16(如圖19所示)。探針利用NHNH2作為反應(yīng)位點(diǎn),能在溫和條件下快速檢測(cè)甲醛。探針16與甲醛之間發(fā)生了加成縮合反應(yīng),位于1,8-萘二甲酰亞胺單元4位的亞胺基和氨基使化合物形成推拉體系,該體系在受到激發(fā)后可進(jìn)行ICT過程,而叔胺基的質(zhì)子化阻礙了PET過程,從而抑制了1,8-萘二甲酰亞胺的熒光,使探針與甲醛反應(yīng)的產(chǎn)物具有良好的熒光性質(zhì)。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為410 nm時(shí),探針16在515 nm處顯示弱熒光,加入甲醛后,室溫下9min內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),且隨著甲醛濃度的增加,在515 nm處熒光逐漸增強(qiáng)。探針的熒光強(qiáng)度與0～200 μmol/L范圍內(nèi)的甲醛濃度成良好的線性關(guān)系(R=0.995 9),最低檢測(cè)限為0.104 μmol/L。此外,為了驗(yàn)證探針16 在甲醛檢測(cè)中的實(shí)用價(jià)值,建立了一套熒光試紙系統(tǒng),在添加試劑后制備的試紙外觀與白色濾紙基本相同。當(dāng)加入乙腈(體積分?jǐn)?shù)10%乙酸)或甲醛水溶液后,在自然光下,試紙的顏色幾乎沒有明顯的變化,而在365 nm紫外光照射下,這些試紙顯示出明顯的綠色熒光。因此,熒光試紙有望用于甲醛的定性檢測(cè),為構(gòu)建用于定量檢測(cè)甲醛的熒光探針提供了可能。

2016年,Tang和Lin課題組[79]設(shè)計(jì)了一種基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)的雙光子熒光探針17(如圖20所示),探針以經(jīng)典的雙光子染料骨架1,8-萘二甲酰亞胺為母體,以NHNH2作為反應(yīng)位點(diǎn)與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng),實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)甲醛的目的。探針17在PBS緩沖溶液(10 mmol/L,pH=7.4,含體積分?jǐn)?shù)1%的二甲亞砜)中幾乎不發(fā)熒光,加入甲醛后,在543 nm處形成一個(gè)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,熒光增強(qiáng)了325倍的,檢出限為7.1×10-7mol/L。探針17與甲醛分子的反應(yīng)速率為0.39 min-1。探針17對(duì)甲醛有較高的選擇性,可在Hela細(xì)胞中進(jìn)行生物成像。此外,探針可以成像肝組織中的甲醛,首次實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)活體組織中的內(nèi)源性甲醛。因此,探針17有望成為研究甲醛在活體組織中生理和病理作用的強(qiáng)有力的分子工具。

圖20 探針17的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.20 Structure of probe 17 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Wu和Xu等[80]設(shè)計(jì)了一種基于N-氨基蒽-1,9-二羧基酰亞胺用于檢測(cè)甲醛的新型熒光探針18(如圖21所示)。探針18以NHNH2作為甲醛的識(shí)別基團(tuán),能與甲醛發(fā)生醛亞胺縮合反應(yīng),生成的產(chǎn)物具有較好的熒光性質(zhì)。由于從肼到蒽酰亞胺結(jié)構(gòu)的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET),在含有體積分?jǐn)?shù)40%DMF(10 mmol/L,pH 7.4)的PBS溶液中,探針18在518 nm處有弱的熒光發(fā)射峰(Φ=0.015)。隨著甲醛的加入,PET過程受到了抑制,在518 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大(Φ=0.041),并在3 min內(nèi)迅速達(dá)到最大值。探針18在518 nm處的熒光強(qiáng)度與0～13 mmol/l范圍內(nèi)的甲醛濃度呈線性關(guān)系,R2=0.991 4,檢出限為988 nmol/L。探針18在加入甲醛后,熒光強(qiáng)度在pH 3.5～5.0之間顯著增加,說明在弱酸性條件下,有利于甲醛與探針的胺基之間的醛亞胺縮合反應(yīng)。探針具有較低的細(xì)胞毒性。此外,探針18能在在HeLa細(xì)胞中的外源性甲醛進(jìn)行了生物成像,沒有加入甲醛時(shí),HeLa細(xì)胞不發(fā)光,甲醛處理后,細(xì)胞輪廓清晰,發(fā)出熒光綠色。綜上,探針18可以快速定量檢測(cè)出濃度范圍廣、檢測(cè)限低的甲醛,在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中具有潛在的應(yīng)用前景。

圖21 探針18的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.21 Structure of probe 18 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Liang和Li等[81]報(bào)道了一種用于超快速檢測(cè)生物樣品中甲醛,基于香豆素-肼基的熒光探針19(如圖22所示)。探針19是基于香豆素骨架,通過7-(二乙基氨基)香豆素的C-2位將肼基引入來設(shè)計(jì)的,由于氧原子上的孤對(duì)電子與CN的超共軛,探針中的肼具有強(qiáng)的親核性,易于與甲醛反應(yīng)形成亞胺鍵,而由于香豆素電子體系中電子極化程度的改變,進(jìn)而改變探針19的熒光性質(zhì)。在磷酸鹽緩沖溶液(PBS,10 mmol/L,pH 7.4)中,探針19在364 nm處有最大紫外吸收峰(Φ=0.003),而加入甲醛后,導(dǎo)致紫外吸收峰發(fā)生紅移為393 nm(Φ=0.029)。探針本身幾乎是無熒光的,與甲醛反應(yīng)后,在1 min內(nèi)能夠與甲醛完全反應(yīng),熒光發(fā)射峰為500 nm,并隨著甲醛濃度的增加而顯著增強(qiáng),檢出限為0.4 μmol/L。探針19對(duì)甲醛的選擇性超過了其他潛在競(jìng)爭(zhēng)的生物羰基物種,且有68倍的熒光增強(qiáng)。此外,探針19通過對(duì)神經(jīng)血管細(xì)胞和生物組織中甲醛分子的進(jìn)行了生物成像,實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)神經(jīng)血管細(xì)胞和小鼠腦組織內(nèi)源性甲醛的動(dòng)態(tài)變化。這表明探針19能夠快速、特異地檢測(cè)生物體內(nèi)的內(nèi)源性甲醛,具有良好的時(shí)空敏感性和空間分辨率,并且有助于闡明神經(jīng)血管疾病病理過程及神經(jīng)退行性病變的病理進(jìn)展中所涉及的機(jī)制,具有作為診斷工具的潛力。

圖22 探針19的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.22 Structure of probe 19 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Bi和Zeng課題組[82]設(shè)計(jì)了一種新型的基于PET機(jī)理,以1,8-萘二甲酰亞胺為母體的甲醛熒光探針20(如圖23所示)。基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過程,探針20在水溶液中具有微弱的熒光,與甲醛反應(yīng)后,探針的PET過程受到抑制,在525 nm處的熒光顯著增強(qiáng),可以在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)甲醛的檢測(cè)。探針20在525 nm處的熒光強(qiáng)度與0～30 μmol/L范圍內(nèi)的甲醛濃度呈現(xiàn)出極好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為20 nmol/L,實(shí)現(xiàn)了對(duì)水溶液中的甲醛定量檢測(cè)。作者還研制了一種能夠加載探針20的甲醛檢測(cè)試紙,試紙?jiān)谒芤褐谐尸F(xiàn)微弱的藍(lán)色熒光,隨著甲醛的加入,在紫外光燈365 nm處,能夠觀察到明顯的熒光增強(qiáng),為甲醛的檢測(cè)提供了一種方便、靈敏、快速的方法。此外,探針20還用于對(duì)SMMC-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)的進(jìn)行了生物成像,這表明探針能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的甲醛。因此,推測(cè)這種熒光探針可能為環(huán)境和生物系統(tǒng)中甲醛的檢測(cè)提供一種有前景的檢測(cè)工具。

圖23 探針20的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.23 Structure of probe 20 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Li和Lu等[83]報(bào)道了一種用于甲醛檢測(cè)的親水性的肼基-萘二甲酰亞胺官能化的殼聚糖(HN-殼聚糖)聚合物探針21(如圖24所示)。與其小分子類似物相比,HN-殼聚糖是以生物高分子殼聚糖的隨機(jī)螺旋聚合物鏈為基礎(chǔ)的,因此能夠利用多個(gè)肼基-萘二甲酰亞胺識(shí)別位點(diǎn)和相鄰羥基的協(xié)同作用,通過弱的超分子相互作用來富集聚合物鏈周圍的低濃度的甲醛污染物,加速了探針上的肼基與甲醛的反應(yīng),實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大和快速響應(yīng)。另外,探針21的水溶性功能也避免了在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中使用有毒和揮發(fā)性有機(jī)溶劑。在水溶液中探針21利用多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)和相鄰羥基的協(xié)同效應(yīng),到達(dá)平衡反應(yīng)的時(shí)間小于1 min,具有高度敏感性。與小分子類似物相比,聚合物探針21的平衡響應(yīng)時(shí)間顯著縮短。在365nm探針21在水溶液幾乎是無熒光的,因?yàn)檩刘啺坊嬖卩徑碾禄?可以通過PET過程,對(duì)萘二甲酰亞胺的熒光起到強(qiáng)熒光猝滅劑的作用。然而,當(dāng)加入微量(百萬分之一)的甲醛后,熒光增強(qiáng),因從肼基到萘酰亞胺熒光團(tuán)的PET過程會(huì)被甲醛與肼基之間的快速化學(xué)反應(yīng)抑制,表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光發(fā)射。聚合物探針21在酸性條件(pH=1.0～6.5)下對(duì)堿性條件的熒光響應(yīng)更佳,有較寬的pH范圍,探針21的理論檢出限約為0.05×10-6(1.66 μmol/L)。由于聚合物探針21具有較高的靈敏度、選擇性、快的響應(yīng)速度、寬的線性檢測(cè)范圍和光穩(wěn)定性,可用于復(fù)雜的水樣和食品樣品中甲醛的檢測(cè)。基于聚合物探針21的設(shè)計(jì)原理,可廣泛應(yīng)用于構(gòu)建其他功能強(qiáng)大的聚合物探針,用于其他重要污染物的超快檢測(cè)。

圖24 探針21的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.24 Structure of probe 21 and detection mechanism of formaldehyde

3 基于取代基NH2與甲醛反應(yīng)的探針

圖25 探針22的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.25 Structure of probe 22 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Song和Lü等[84]設(shè)計(jì)了一種可逆熒光探針22(如圖25所示),用于活體細(xì)胞和體內(nèi)甲醛的檢測(cè)。探針22以具有高熒光量子產(chǎn)率,良好的光穩(wěn)定性,優(yōu)異的摩爾消光系數(shù)和良好的pH穩(wěn)定性的二氟化硼-二吡咯甲烷(BODIPY)熒光染料作為熒光基團(tuán),伯氨基作為響應(yīng)基團(tuán)。在探針中伯氨基不影響B(tài)ODIPY熒光團(tuán)的光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移過程(PET),在與FA發(fā)生醛亞胺縮合反應(yīng)后,將產(chǎn)生亞胺(CN)基團(tuán),而CN異構(gòu)化和旋轉(zhuǎn)可猝滅探針的熒光發(fā)射。探針22在pH 7.4,10 mmol/L HEPES的緩沖液,最大紫外吸收波長(zhǎng)為495 nm(Φ=0.85),熒光發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm。加入FA后,探針在515 nm處熒光強(qiáng)度逐漸降低,熒光量子產(chǎn)率降低至Φ=0.01。探針22對(duì)0～500 μmol/L的甲醛范圍內(nèi),存在良好的線性關(guān)系,線性擬合常數(shù)r=0.999 1,檢出限為50 nmol/L,探針22對(duì)甲醛的檢測(cè)具有高靈敏度。探針22的可逆循環(huán)可以重復(fù)至少3次,且熒光衰減較小。此外,探針22可對(duì)SMMC-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)、小鼠的器官和組織進(jìn)行生物成像,不僅可以定位于細(xì)胞質(zhì)中并跟蹤活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性甲醛濃度的波動(dòng),對(duì)活細(xì)胞中甲醛的可逆檢測(cè);而且成功應(yīng)用于定性評(píng)估體外解剖器官中的甲醛濃度。上述應(yīng)用使探針22成為研究甲醛在細(xì)胞和體內(nèi)生理和病理功能的潛在化學(xué)工具。

2018年Cao和Qin等[85]基于二氟化硼-二吡咯甲烷(BODIPY)染料合成了一種新型的甲醛高選擇性熒光探針23(如圖26所示)。探針23以硼-二吡咯亞甲基染料作為熒光團(tuán),鄰苯二胺(OPDA)作為反應(yīng)基團(tuán)。氨基取代或N-取代的BODIPY染料總是具有低熒光量子產(chǎn)率,這是由于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)過程在激發(fā)態(tài)下從鄰苯二胺的氮原子到BODIPY的有效猝滅。當(dāng)氨基與醛的反應(yīng)抑制了BODIPY受體的ICT過程,熒光減弱。探針23在乙腈/HEPES緩沖液(20mmol/L,pH7.4)中的紫外吸收峰為482 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。加入FA后,在482 nm處的吸收峰呈下降趨勢(shì),在525 nm出現(xiàn)新的吸收峰,熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移(525～548 nm)。探針23的熒光強(qiáng)度在0～1 000 μmol/L的甲醛濃度范圍內(nèi)呈線性增加,最低檢測(cè)限為0.104 μmol/L。此外,探針23能夠監(jiān)測(cè)HeLa細(xì)胞中自發(fā)生成的甲醛。同時(shí)開發(fā)了一種試紙檢測(cè)氣體中的甲醛,表明探針對(duì)內(nèi)源細(xì)胞和氣體環(huán)境中的甲醛具有較高的響應(yīng)性。

圖26 探針23的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.26 Structure of probe 23 and detection mechanism of formaldehyde

4 基于其他反應(yīng)的測(cè)定甲醛探針

2011年Li和Han課題組[86]報(bào)道了一種基于羅丹明B衍生物的甲醛熒光探針24(如圖27所示),探針24以羅丹明B為母體,乙二胺為甲醛的反應(yīng)基團(tuán),加入甲醛后,乙二胺與甲醛反應(yīng)形成席夫堿中間體1,其促進(jìn)分子內(nèi)脫氧內(nèi)酰胺開環(huán),形成含有咪唑烷的羅丹明B產(chǎn)物,發(fā)出熒光。探針熒光發(fā)射峰在590 nm處,且熒光發(fā)射強(qiáng)度隨甲醛濃度的增加而增強(qiáng)。探針24對(duì)烷基醛和芳香族醛具有良好的選擇性。除此之外,鑒于羅丹明的特殊熒光性質(zhì),如高熒光量子產(chǎn)率、生物正交熒光光譜和高光穩(wěn)定性,探針24對(duì)細(xì)胞表面醛類化合物的化學(xué)選擇性和熒光性標(biāo)記表明,含有脫氧內(nèi)酯的羅丹明在活細(xì)胞表面唾液蛋白的可視化或跟蹤方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,如用于儀器或肉眼檢測(cè)甲醛,甲醛釋放抗癌藥物的評(píng)價(jià)和某些癌癥內(nèi)源性甲醛的定量測(cè)定。

圖27 探針24的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.27 Structure of probe 24 and detection mechanism of formaldehyde

2016年He和Lin課題組[87]設(shè)計(jì)合成了一種超快速甲醛熒光探針25(如圖28所示),探針以乙二胺基團(tuán)作為甲醛反應(yīng)位點(diǎn),羅丹明6G作為熒光團(tuán)。探針本身是無熒光的,當(dāng)乙二胺基與甲醛之間縮合形成亞氨基中間體,其隨后使分子內(nèi)脫氧內(nèi)酰胺開環(huán),并產(chǎn)生咪唑產(chǎn)物,熒光恢復(fù)。探針25在水溶液(pH 7.4,含體積分?jǐn)?shù)50%N,N-二甲基甲酰胺的25 mmol/L PBS緩沖液)中幾乎是非熒光的(ΦF=0.21),隨著甲醛劑量的增加,在560 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸增加(7.4倍),并與甲醛濃度存在良好的線性關(guān)系,檢出限為7.7×10-7mol/L,能夠?qū)λ芤褐械蜐舛燃兹┻M(jìn)行定量檢測(cè)。并且,當(dāng)用2.0當(dāng)量濃度的甲醛處理探針時(shí),其發(fā)射強(qiáng)度在約10s內(nèi)迅速達(dá)到最大值,可以超快速監(jiān)控甲醛。此外,探針25能夠檢測(cè)Hela細(xì)胞中的外源性甲醛,成功地應(yīng)用于香菇干中甲醛的定量檢測(cè),并首次實(shí)現(xiàn)了肉眼快速檢測(cè)室內(nèi)的甲醛氣體。這表明探針25在監(jiān)測(cè)生活系統(tǒng)、食品工業(yè)和環(huán)境中的甲醛具有廣闊的應(yīng)用前景。探針25在室內(nèi)能夠甲醛檢測(cè)氣體的最低濃度為0.044mol/m3。探針25在體內(nèi)外對(duì)甲醛均表現(xiàn)出明顯的熒光增強(qiáng)反應(yīng),有望成為檢測(cè)生物系統(tǒng)、食品工業(yè)和環(huán)境中低水平甲醛的實(shí)用工具。

圖28 探針25的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.28 Structure of probe 25 and detection mechanism of formaldehyde

2017年Liu和Zeng課題組[88]等報(bào)道了一種基于鄰-二氨基羅丹明衍生物的甲醛熒光探針26(如圖29所示),用于從其他醛類化合物中鑒別和檢測(cè)甲醛(FA)、甲基乙二醛(MGO)和乙二醛(GD)。探針26在642 nm處表現(xiàn)出微弱的熒光發(fā)射,加入甲醛后,探針出現(xiàn)輕微藍(lán)移,在620 nm處的熒光增強(qiáng),量子產(chǎn)率從0.07增加到0.55,檢出限為8.3 μmol/L。而甲基乙二醛的加入引起明顯的熒光減弱,量子產(chǎn)率從0.07下降到0.014。同時(shí),乙二醛的也使探針從642 nm藍(lán)移到620 nm,熒光強(qiáng)度無明顯變化,表明探針26具有良好的選擇性,可以通過不同的特征光譜響應(yīng)區(qū)分甲醛、甲基乙二醛、乙二醛和其他醛類化合物。此外,探針26可用于L929細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)中甲醛和甲基乙二醛的生物成像。探針具有細(xì)胞滲透性,可以作為一種工具,分別通過熒光開關(guān)模式監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的甲醛、甲基乙二醛和乙二醛。

2018年Xie和Zhu課題組[89]設(shè)計(jì)了第一個(gè)具有能夠檢測(cè)pH和甲醛的“turn-off”型熒光探針27(如圖30所示)。高烯丙基胺基被認(rèn)為是有效的甲醛識(shí)別基團(tuán),氮原子質(zhì)子化是一個(gè)好的pH觸發(fā)器,這使得高烯丙基胺基也可以作為檢測(cè)pH的敏感官能團(tuán)。探針以4-羥基1,8-萘二甲酰亞胺為母體,高烯丙基氨基為識(shí)別集團(tuán),與甲醛反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的β-消除反應(yīng),釋放出4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺,發(fā)出綠色熒光,在酸性條件下發(fā)出藍(lán)色熒光。探針27在pH=3.5時(shí)在365 nm處有紫外吸收峰,當(dāng)pH值增加到7.4時(shí)吸光度逐漸下降。探針27在pH 7.4下幾乎沒有熒光,在酸性pH 4.0下455 nm處發(fā)射強(qiáng)度的顯著增強(qiáng),熒光強(qiáng)度增加10倍。探針27在PBS緩沖液(體積分?jǐn)?shù)0.5%二甲亞砜,10 mmol/L, pH 7.4)經(jīng)甲醛處理后,在555 nm處的發(fā)射強(qiáng)度顯著增強(qiáng),與0～0.25 mmol/L范圍內(nèi)的甲醛濃度有良好的線性關(guān)系,R2=0.99,檢出限為10 μmol/L。探針27的檢測(cè)速率常數(shù)確定為0.01 min-1。此外,探針27同時(shí)應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中的酸性溶酶體和外源性及內(nèi)源性甲醛的生物成像。探針27在活細(xì)胞中的檢出限為37 μmol/L。用單一熒光探針同時(shí)成像復(fù)雜生物體內(nèi)的pH和甲醛,為進(jìn)一步理解pH和甲醛間的相互作用和細(xì)胞間的相互作用提供技術(shù)支撐。因此,探針27在雙分析物檢測(cè)領(lǐng)域是一種很有前途的分析工具。

圖29 探針26的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.29 Structure of probe 26 and detection mechanism of formaldehyde

圖30 探針27的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.30 Structure of probe 27 and detection mechanism of formaldehyde

2018年Xu和Lou等[90]報(bào)道了兩種甲醛再生熒光探針28a和28b(如圖31所示)。探針28以3-(芐基氨基)琥珀酰亞胺作為甲醛的選擇性反應(yīng)基團(tuán),實(shí)現(xiàn)了前所未有的區(qū)域特異性FA誘導(dǎo)的分子內(nèi)反應(yīng)策略。探針28能夠捕獲甲醛分子,誘導(dǎo)區(qū)域特異性酰亞胺鍵裂解,然后通過獨(dú)特的雙PeT/ICT猝滅機(jī)制釋放捕獲的甲醛分子,同時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過甲醇胺中間體8的分子內(nèi)酰胺酯交換反應(yīng)加速了甲醛誘導(dǎo)的α氨基酰胺6的酰胺鍵的水解。探針28a在pH 7.4和5.0下對(duì)甲醛都有熒光啟動(dòng)響應(yīng),在pH 7.4下,熒光強(qiáng)度在前10 min內(nèi)增加70.4倍后,在3 h內(nèi)降至30.7倍的穩(wěn)定水平。當(dāng)pH值為5.0時(shí),熒光強(qiáng)度在2 h內(nèi)最大增加45.6倍,并保持不變,檢出限為0.48 μmol/L。探針28b中未質(zhì)子化的嗎啉基團(tuán)的PET效應(yīng)有助于抑制胞質(zhì)或其他中性細(xì)胞器中探針對(duì)甲醛的響應(yīng),從而增強(qiáng)酶體中對(duì)甲醛選擇性。在pH為5.0的高甲醛濃度下,探針28b的熒光強(qiáng)度高達(dá)51.8倍,沒有明顯的熒光減弱,檢出極限為0.145 μmol/L,pH適應(yīng)范圍為4.0～6.0,特別適合溶酶體內(nèi)部的甲醛檢測(cè)(pH 4.5～5.5)。此外,探針28a可以通過熒光成像檢測(cè)HeLa細(xì)胞中的外源性甲醛,探針28b能夠選擇性檢測(cè)溶酶體內(nèi)的甲醛。并且，這兩種探針的聯(lián)合使用可以檢測(cè)溶酶體和細(xì)胞質(zhì)中甲醛的相對(duì)水平。這些探針在細(xì)胞內(nèi)和溶酶體內(nèi)激活甲醛水平的檢測(cè)和成像方面顯示出了潛力,并以其獨(dú)特的甲醛再生特性為研究生物系統(tǒng)中甲醛的穩(wěn)態(tài)、信號(hào)和功能提供了有用的工具。此外,新的分析物誘導(dǎo)的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)策略可以作為設(shè)計(jì)新的熒光探針的一種方法。

圖31 探針28的結(jié)構(gòu)及對(duì)甲醛的檢測(cè)機(jī)理Fig.31 Structure of probe 28 and detection mechanism of formaldehyde

5 總結(jié)與展望

活性羰基物種是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)之一,其在體內(nèi)發(fā)生異常時(shí)會(huì)引起許多疾病,而甲醛作為一種重要的活性羰基物種,在生命活動(dòng)中也具有重要意義。設(shè)計(jì)合成一種能夠動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)甲醛的熒光探針是當(dāng)前的研究熱點(diǎn),實(shí)現(xiàn)分子水平、細(xì)胞水平和活體水平的成像分析,有利于了解甲醛在生理學(xué)病理學(xué)的功能作用,有助于了解甲醛的來源和去路,以此發(fā)現(xiàn)甲醛代謝平衡的新機(jī)制,同時(shí),將理論與現(xiàn)實(shí)生活相聯(lián)系,有助于預(yù)防甲醛引起的危害。本文根據(jù)不同識(shí)別基團(tuán)與甲醛的反應(yīng)將其分類,總結(jié)歸納了近幾年來報(bào)道的甲醛熒光探針,發(fā)現(xiàn)單光子熒光探針較多,雙光子熒光探針較少,測(cè)定甲醛的相應(yīng)時(shí)間有待提高。所以,未來設(shè)計(jì)監(jiān)測(cè)甲醛的熒光探針,可以在提高靈敏性和選擇性的基礎(chǔ)上,定性以及定量檢測(cè)甲醛,實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)可視化檢測(cè)甲醛濃度,著重突出研究甲醛與其他分子以及蛋白質(zhì)的相互作用,揭示其背后的生物規(guī)律以及其于疾病的相關(guān)性等方面,同時(shí),運(yùn)用高水平的科技聯(lián)用技術(shù),例如近紅外熒光以及多光子成像技術(shù),三維成像和高時(shí)空分辨單分子成像技術(shù),多方位,多空間,多信息更好的實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)。