3種猴頭菇不同成熟度子實(shí)體的抗氧化活性

呂國英，張作法*，陳建飛，毛榮良，劉世柱

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.衢州菇樂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江 衢州 324000；3.常山縣森力家庭農(nóng)場，浙江 常山 324200； 4.浙江方格藥業(yè)有限公司，浙江 慶元 323800)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)又名猴頭菌、刺猬菌，是一種大型的食藥用真菌，因其形狀酷似金絲猴頭，而得名。猴頭菌的食用歷史悠久，營養(yǎng)豐富，主要活性成分有多糖、低聚糖、萜類和酚類等，具有抗癌、護(hù)胃、提高免疫力等多種藥理功效[1-2]。有關(guān)猴頭菇的功能性成分研究中，多糖護(hù)胃活性最受關(guān)注[3]，猴頭菇的抗氧化活性研究較少。

自由基是在生物體內(nèi)呈游離狀態(tài)帶有不成對電子的分子、原子或離子。大量研究表明，氧自由基誘導(dǎo)的LPO反應(yīng)與許多疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系[4]。因此，尋找利于人體吸收的能清除體內(nèi)過量自由基的外源活性自由基清除劑，成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。本研究以抗氧化活性為指標(biāo)，選取不同品種不同成熟度猴頭菇子實(shí)體，制備出具有優(yōu)良抗氧化活性的提取物，同時為猴頭菇功能食品的開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

猴頭菇1號、2號、99號不同生長時期的子實(shí)體由常山縣森力家庭農(nóng)場提供。DPPH、ABTS、過硫酸鉀購自Sigma，其他試劑為分析純。

1.2 樣品制備

選取猴頭菇1號、2號、99號3個品種不同生長時期的子實(shí)體(A未成熟，B成熟，C過熟)，60 ℃烘干粉碎過60目篩，備用。

取3.0 g猴頭細(xì)粉，加入100 mL 70%乙醇，90 ℃回流1 h，離心收集上清液，殘渣再次加入100 mL 70%乙醇，再次回流1 h。合并提取液，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液旋蒸，得到醇提物，4 ℃下保存。測定時，取醇提物用70%乙醇配制成1～5 mg·mL-1的樣品待測液。

1.3 DPPH自由基清除率的測定

1 mL樣品待測液加入1 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液，振蕩反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定吸光度。以70%乙醇溶液代替同樣體積的樣品作為空白，計算DPPH清除率[5]。

1.4 ABTS+清除率的測定

配制7 mol·L-1ABTS儲備液(2.46 mol·L-1過硫酸鉀溶液溶解ABTS)，室溫避光條件下靜置12～16 h；將ABTS以磷酸緩沖液(10 mmol·L-1，pH值7.4)稀釋，使其吸光度在734 nm處達(dá)到0.70±0.02。然后取2.5 mL的ABTS+測定液，加入1.0 mL的樣品待測液，準(zhǔn)確振蕩30 s，在734 nm處測定吸光度，計算ABTS+清除率[6]。

1.5 羥自由基清除率的測定

1 mL樣品加入1 mL FeSO4(12 mmol·L-1)，再加入1 mL H2O2(12 mmol·L-1)，37 ℃下保溫10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸，37 ℃下保溫30 min，然后10 000 r·min-1，4 ℃下離心10 min，取上清液在510 nm處測定吸光度。以70%乙醇溶液代替同樣體積的樣品作為空白，計算羥自由基清除率[7]。

1.6 還原力測定

取0.4 mL樣品，加入1 mL 0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液，再加入1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合液于50 ℃下水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸后，4 ℃下1 000g離心10 min，取2 mL上清液，加入0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液中，于700 nm處測定吸光度，吸光度值大則表示還原力強(qiáng)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

當(dāng)DPPH自由基與抗氧化劑反應(yīng)后，會隨著還原而逐漸褪色，在517 nm處的吸光度降低。由表1可以看出，3種猴頭菇的醇提物隨著濃度的增大，DPPH自由基清除能力增強(qiáng)，不同成熟度的子實(shí)體提取物的DPPH自由基清除率在未成熟時都表現(xiàn)出最高，5 mg·mL-1時，99號的清除率最高為59.5%，明顯優(yōu)于2號的清除率(48.7%)。黃越等[9]提取猴頭的粗多糖對清除DPPH自由基的研究表明，當(dāng)粗多糖濃度為5 mg·mL-1時，3種多糖A-HeP、U-HeP和W-HeP對DPPH自由基的清除率分別為71.67%、55.12%和47.91%。實(shí)驗(yàn)表明，猴頭菇中一些小分子物質(zhì)與多糖等大分子同樣具有抗氧化效果。

表1 樣品DPPH自由基清除率

2.2 清除ABTS+的能力

含抗氧化成分的樣品與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。ABTS+的最大吸收波長 734 nm處檢測吸光度的變化，可測定樣品對ABTS+自由基的清除能力。猴頭菇提取物對ABTS自由基的清除作用見表2。1號品種表現(xiàn)出優(yōu)秀的清除能力，不同成熟度的子實(shí)體提取物在2 mg·mL-1時的清除率均超過了95%，99號提取物在3 mg·mL-1的清除率也超過了95%，2號的ABTS+自由基的清除能力略遜于前兩者。吳美媛等[10]比較猴頭菇的不同溶劑提取物的ABTS+自由基的清除能力，猴頭菇熱水、乙醇及丙酮提取物2 mg·mL-1對ABTS+自由基的清除率分別為52.06%、63.84%，49.59%。說明不同品種與提取試劑對抗氧化作用有明顯的差異。

表2 樣品ABTS+清除率

2.3 清除羥自由基的能力

H2O2和Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸，可捕捉羥自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。加入抗氧化物質(zhì)，會與水楊酸形成競爭，使有色產(chǎn)物的生成量減少，通過吸光度的變化評價羥自由基的清除能力。猴頭菇提取物對羥自由基的清除能力見表3。3種猴頭菇的醇提物隨著濃度的增大清除能力增強(qiáng)，不同品種之間的清除率有較大的差別，99號品種在高濃度時羥自由基清除率在60.9%～70.8%，2號品種的清除率相對最弱，為23.7%～35.8%，但不同成熟度之間的清除能力沒有明顯的規(guī)律。

表3 樣品羥自由基清除率

2.4 還原力

還原能力是反映物質(zhì)抗氧化活性的一個重要指標(biāo)，還原力與抗氧化活性呈正相關(guān)，還原能力越大，抗氧化活性越高。表4表明，猴頭菇醇提物濃度為1～5 mg·mL-1時，還原力隨著濃度的升高快速增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，2號不同成熟度的還原能力都優(yōu)于1號和99號。何晉浙等[11]在研究不同產(chǎn)地的猴頭菇多糖的還原力時，當(dāng)多糖濃度為5 mg·mL-1，其在700 nm處的吸光度都在0.55以下。Kozarski等[12]對靈芝多糖還原能力進(jìn)行研究，當(dāng)濃度為5 mg·mL-1時，其在700 nm處的吸光度的僅為0.23。說明猴頭菇醇提物具有良好的還原能力。

表4 樣品還原能力

3 小結(jié)

本研究以體外藥理活性為導(dǎo)向，比較了不同品種猴頭菇在不同成熟度時子實(shí)體70%乙醇提取物的體外抗氧化能力，以DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基的清除率和還原力為指標(biāo)。研究結(jié)果表明，不同品種的猴頭菇提取物均具有良好的抗氧化能力，但有較大的差別。1號和99號品種對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率優(yōu)于2號；2號品種的還原能力最強(qiáng)；99號品種的羥基清除能力最高。研究結(jié)果為猴頭菇保健品開發(fā)提供了思路和參考。