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    鴨皮膠原蛋白肽的制備及抗氧化活性

    2019-07-22 01:27:20郭德斌蘇婷郭振毛春財盧素珍王輝
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年7期
    關(guān)鍵詞:膠原蛋白多肽膠原

    郭德斌,蘇婷,郭振,毛春財,盧素珍,王輝*

    (1.江西煌上煌集團食品股份有限公司,江西 南昌 330200; 2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330047)

    鴨肉具有大補消熱、利便除腫、消脹利臟等功效,一直是餐桌上的上乘佳肴。鴨肉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì),尤其是蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)比畜肉高,脂肪、碳水化合物含量適中[1]。另外,鴨皮中含有豐富的膠原蛋白,是美容養(yǎng)顏、滋陰補腎的佳品。據(jù)報道,鴨皮膠原蛋白的氨基酸組成和比例非常優(yōu)越,羥脯氨酸含量較高,且膠原蛋白的結(jié)構(gòu)與人體膠原蛋白結(jié)構(gòu)比較相似,是生產(chǎn)膠原蛋白的最佳原料[2]。

    目前,膠原蛋白質(zhì)的提取技術(shù)主要有酸法[3]、堿法、酶法、水提法等等,其中酸法、堿法和水提法的反應(yīng)條件比較劇烈,易使蛋白質(zhì)上的氨基酸發(fā)生其他副反應(yīng),影響膠原蛋白的品質(zhì)。酶法具有效率高、反應(yīng)溫和、不破壞蛋白質(zhì)的原始氨基酸結(jié)構(gòu)等優(yōu)點[4],被廣泛用于膠原蛋白的提取。鴨肉制品的加工是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè),在全國各地均有較多的消費群體,但是關(guān)于鴨骨、鴨皮、鴨皮中膠原的研究較少,僅有鴨骨成分和鴨骨糜加工等方面的研究報道[5]。肉鴨加工中還會產(chǎn)生鴨皮等副產(chǎn)物,僅伊莉等[3]研發(fā)了酸法提取鴨皮膠原蛋白的工藝和技術(shù)。本文以鴨皮為主要原料,以水解度和抗氧化活性為指標(biāo)篩選最佳蛋白酶,通過單因素和正交試驗研究鴨皮膠原蛋白肽的最佳制備工藝,并進行分子質(zhì)量和抗氧化活性分析,為鴨皮的高值化綜合利用提供新方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    鴨皮來源于江西煌上煌集團食品股份有限公司。2.4 L Alcalase堿性蛋白酶購于丹麥諾維信公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    U-2910紫外/可見分光光度計(日本日立公司);Synergy H1酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);TGL-10C高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);TP-214型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Agilent 1100 HPLC(美國安捷倫科技技術(shù)有限公司);B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

    1.2 處理設(shè)計

    1.2.1 鴨皮的粉碎和脫脂處理

    將新鮮鴨皮清洗干凈,采用膠體磨進行鴨皮的粉碎,得到鴨皮糜,然后以低沸點正己烷為提取劑,采用溶劑脫脂技術(shù)進行鴨皮糜的脫脂,使脂肪殘留量低于5%(占干物質(zhì)量)。

    1.2.2 最適蛋白酶的選擇

    通過相關(guān)文獻、市場銷售和工藝需求,分別從表1的4種蛋白酶中進行最適蛋白酶的選擇,比較不同酶對鴨皮糜的水解度,水解度最高的酶為最適合酶。

    表1 最適蛋白酶的酶解條件

    1.2.3 鴨皮中膠原多肽的提取

    以脫脂后的鴨皮糜為原料,按照一定的料液比加入去離子水,在一定溫度和pH值條件下采用堿性蛋白酶進行水解,以水解度為主要指標(biāo),以料液比、溫度、pH值、酶添加量和時間為主要影響因素,通過單因素和正交試驗確定鴨皮中膠原多肽的最佳提取工藝。

    單因素試驗:液料比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30;加酶量分別為4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U·g-1;溫度分別為50、55、60、65、70 ℃;pH值分別為7、7.5、8.0、8.5、9.0;水解時間分別為1、2、3、4、5、6 h。

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,進行4因素3水平正交試驗設(shè)計:1、2、3水平的酶解溫度(A)分別為55、60、65 ℃,液料比(B)分別為1∶18、1∶20、1∶22,加酶量(C)分別為6 500、7 000、7 500 U·g-1,pH(D)分別為8.0、8.5、9.0。

    1.3 指標(biāo)測定

    采用甲醛滴定法[6]測定水解度。

    將最佳工藝制備得到的鴨皮膠原多肽溶于去離子水,用0.45 μm的微孔濾膜過濾后,采用高效體積排阻色譜法測定分子質(zhì)量[7]。

    羥自由基(·OH)清除能力的測定。分別取1.0 mL不同濃度的鴨皮膠原肽溶液加入5 mL的具塞試管中,然后依次分別加入硫酸亞鐵(2 mL,1.8 mmol·L-1)、水楊酸-乙醇(1.5 mL,1.8 mmol·L-1)、H2O2(0.1 mL,8.8 mmol·L-1),37 ℃孵化30 min;然后取200 μL反應(yīng)液于96孔的酶標(biāo)板上測量波長510 nm處的吸光度值Di,空白樣品為去離子水樣品,吸光度值為D0。羥自由基清除率(%)[8]=[(D0-Di)/D0]×100。

    還原力的測定。分別取2.0 mL不同濃度的多肽溶液移入10 mL的具塞比色管中,然后依次加入2 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1,pH值6.6)、2 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的K3Fe(CN)6,混合均勻,于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min,然后冷卻至室溫。隨后加入2 mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸,混勻離心后取2 mL上清液,加2 mL去離子水和0.4 mL 0.1% FeCl3,混勻后于700 nm處測定Di。以去離子代替樣品作為對照[9]。

    DPPH清除能力測定。分別取100 μL不同濃度的膠原多肽移至96孔酶標(biāo)板,然后加100 μL 0.2 mmol·L-1的DPPH的乙醇溶液,混勻,在常溫條件下避光反應(yīng)30 min,波長517 nm處測吸光度值D1。以95%乙醇代替DPPH溶液作為空白對照1(D0),以去離子水代替膠原多肽為對照組2(D2)。DPPH清除率(%)[10]=(D2-D1)/(D2-D0)×100。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛋白酶的篩選

    水解度和抗氧化活性是衡量膠原多肽制備效率和產(chǎn)品效果的2個主要指標(biāo)[10]。本研究選擇具有較強活性的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶為主要水解酶,4種蛋白酶對鴨皮膠原多肽的水解效果和抗氧化活性如圖1所示,堿性蛋白酶的酶解效率較高,且水解樣品的羥自由基清除率、DPPH清除率和還原力均高于其他3種水解酶。因此,本試驗以堿性蛋白酶為最佳水解酶開展后續(xù)試驗。

    同指標(biāo)柱上無相同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2~4同

    2.2 單因素試驗

    2.2.1 料液比對鴨皮膠原水解度的影響

    料液比是影響鴨皮膠原蛋白水解的重要因素之一。如圖2所示,隨著料液比的增大,鴨皮膠原蛋白的水解度呈增加的趨勢,且當(dāng)料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25和1∶30時,其水解度變化不顯著。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有2個,一方面鴨皮糜本身含有一定的水分,料液比1∶15的條件下剛好使鴨皮糜達到最佳料液比;另一方面,在該條件下酶可以充分地與底物膠原蛋白接觸和反應(yīng),物料濃度太高時,酶與底物不能充分接觸,物料濃度太低時,酶與底物的接觸面積也會相對減少[11]。

    圖2 料液比對鴨皮膠原蛋白水解度的影響

    2.2.2 加酶量、溫度對鴨皮膠原水解度的影響

    加酶量和溫度是鴨皮膠原水解的重要因素。由圖3可知,酶的添加量與水解度成正相關(guān),隨著酶添加量的不斷增加,鴨皮膠原的水解度顯著提高,當(dāng)酶加入量超過7 000 U·g-1后,水解度無顯著變化,此時的反應(yīng)達到平衡。主要是由于底物-酶的結(jié)合有一個最佳飽和度,當(dāng)未達到飽和時,隨著酶添加量增加,水解度逐漸提高;當(dāng)二者達到飽和時,酶的添加量對其水解度的影響減小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是,在蛋白質(zhì)酶解初期,底物和酶之間的相互作用達到飽和,但是,隨著酶添加量的增加,大部分反應(yīng)底物被消耗,而使其水解度降低。因此,選取試驗酶加入量的3個水平因素為5 000、6 000、7 000 U·g-1。隨著溫度的增加水解度呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢,當(dāng)水解溫度為60 ℃時,其水解度達到最大值,說明底物為鴨皮糜時,60 ℃為堿性蛋白酶的最佳酶解活性。

    2.2.3 pH值和酶解時間對鴨皮膠原水解度的影響

    由圖4可知,pH值從7增加到9時,水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當(dāng)pH值為8.5時水解度達到最大。而隨著酶解時間的延長,水解度不斷提高。酶解時間為1、2 h時,水解度的升高速度最快,因為蛋白酶在前期活性最高,水解效率也最高。當(dāng)時間超過5 h時,水解度無顯著變化,這是因為當(dāng)水解時間為1~5 h時,鴨皮膠原蛋白呈飽和狀態(tài),水解反應(yīng)為零級反應(yīng),反應(yīng)向產(chǎn)物生成的方向進行,當(dāng)反應(yīng)時間超過5 h,反應(yīng)達到平衡,加上5 h以后蛋白酶的活性降低也會影響其水解度。

    圖3 加酶量和溫度對鴨皮膠原蛋白水解度的影響

    圖4 pH值和反應(yīng)時間對鴨皮膠原蛋白水解度的影響

    2.3 正交試驗結(jié)果

    鴨皮膠原蛋白水解過程中的各個影響因素不是孤立發(fā)生的,是具有一定的相互關(guān)聯(lián)性的。因此,要得到鴨皮膠原蛋白制備的最佳工藝,必須進行酶添加量、料液比、反應(yīng)溫度、時間和pH等各個因素正交試驗[12]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇固定酶解時間,進行料液比、酶解溫度、加酶量、pH值4個因素的正交試驗。由表2和極差分析結(jié)果可知,各因素對鴨皮中膠原蛋白水解度的影響大小為溫度>料液比>pH>加酶量。鴨皮膠原水解的最佳工藝為溫度60 ℃,料液比為1∶20,加酶量7 000 U·g-1,pH 8.5,反應(yīng)4 h,此時水解度為22.14%。

    表2 各處理組合對水解度的影響

    2.4 鴨皮膠原蛋白肽的抗氧化活性和相對分子質(zhì)量分析

    采用上述最佳工藝條件制備鴨皮膠原蛋白肽,并進行其抗氧化和分子質(zhì)量分析。如圖5所示,隨著多肽濃度增加,其抗氧化活性逐漸增大,當(dāng)添加濃度為16 mg·mL-1時,其羥自由基清除能力、DPPH清除能力和還原力分別為65.22%、77.45%和79.36%。

    圖5 鴨皮膠原蛋白肽的抗氧化活性分析

    利用分子排阻凝膠柱進行鴨皮膠原多肽的相對分子質(zhì)量分析,通過HPLC色譜中的出峰時間、面積,以相對分子質(zhì)量的對數(shù)對保留時間作圖(圖6),得到相對分子質(zhì)量校正曲線方程,計算得出鴨皮膠原蛋白肽的相對分子質(zhì)量為1 000~5 000 u,該組分占83.56%;1 000 u以下的多肽占16.44%。

    圖6 鴨皮膠原蛋白肽相對分子質(zhì)量分析的HPLC圖譜

    3 小結(jié)

    本研究以鴨皮糜為原料,篩選了堿性蛋白酶作為鴨皮糜中膠原蛋白肽提取的主要蛋白酶,并以水解度為主要指標(biāo),確定了鴨皮膠原肽制備的最佳工藝條件為:溫度60 ℃,料液比為1∶20,加酶量7 000 U·g-1,pH值 8.5,反應(yīng)4 h,此時水解度為22.14%。

    本文工藝制備得到的鴨皮膠原肽具有一定的抗氧化能力,當(dāng)添加濃度為16 mg·mL-1時,其羥自由基清除能力、DPPH清除能力和還原力分別為65.22%、77.45%和79.36%;其相對分子質(zhì)量為1 000~5 000 u,該組分占83.56%,1 000 u以下的多肽占16.44%。

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