不同部位與處理對三葉青茶總黃酮含量的影響

洪春桃，沈登鋒，魏斌，章建紅

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040)

三葉青(Tetrastigmahemsleyanum)，中文學(xué)名為三葉崖爬藤，又名蛇附子、石抱子、金線吊葫蘆、三葉對、小扁藤、三葉扁藤、攔山虎、雷膽子等，藥名為三葉青，是葡萄科崖爬藤屬多年生蔓生藤本植物，為中國特有珍稀藥用植物[1-2]。藥理試驗表明，三葉青具有抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3-6]，且長期應(yīng)用未見毒副作用，是西藥無法代替的“植物抗生素”?，F(xiàn)代化學(xué)分離、分析研究發(fā)現(xiàn)，其主要化學(xué)成分為黃酮及其苷類化合物，臨床上已逐步用于肝癌、肺癌、白血病和艾滋病等疾病的治療[3-4]。隨著人們健康意識的增強，以傳統(tǒng)中草藥為主要成分的保健茶已成為市場的新亮點。三葉青主要利用部位是塊根，但它的莖葉同樣具有相應(yīng)的功能[7-9]，將三葉青莖葉制成茶葉，既可以消除感冒等病癥又可以提高免疫力，是未來保健茶中的佼佼者。茶優(yōu)良品質(zhì)的形成主要取決于鮮葉質(zhì)量和加工工藝，因此，選擇適宜的制茶工藝對三葉青茶生產(chǎn)具有重要意義。本研究采用正交試驗比較了不同加工處理對三葉青茶總黃酮含量的影響，現(xiàn)將試驗結(jié)果歸納總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

三葉青嫩葉、老葉和幼嫩莖段采自寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院橫溪鎮(zhèn)大岙村的三葉青基地(寧波，浙江)，采摘時間為2018年3月中旬。試劑：蘆丁對照品(批號：20200423，購于北京索萊寶科技有限公司)，氫氧化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，95%乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，三氯化鋁(阿拉丁)等。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，恒溫水浴鍋(上海慧泰儀器制造有限公司)，超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，USA)，高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific，USA)等。

1.3 處理設(shè)計

1.3.1 三葉青不同加工處理正交試驗方法

試驗采用3因素3水平的正交試驗，對制茶的殺青方式(A)、干燥方式(B)、取材部位(C)進行對比探討[10-11]，并測定試驗組的總黃酮含量，作為篩選較佳制茶加工條件的依據(jù)。殺青方式：1，鍋炒；2，微波；3，蒸汽[11]。干燥方式：1，鍋炒干燥；2，冷凍干燥；3，烘箱干燥。取材部位：1，嫩葉；2，老葉；3，嫩莖段，其中嫩葉采用每個枝條頂端的前6輪葉子，老葉為6輪以下的葉子，嫩莖段為頂端的前5段。殺青方式：鍋炒殺青按傳統(tǒng)經(jīng)驗，高溫，2 min；微波殺青：800 W，0.5～1.0 min；蒸汽殺青：100 ℃，1 min。干燥方式：炒干，30～60 min；冷凍干燥，-60 ℃，12～24 h；烘干，60 ℃，8 h。具體處理組別見表1。

1.3.2 三葉青不同制茶加工樣品的制備

采集樣品后先進行挑選，將嫩葉和嫩莖段分開，再進行清水漂洗、濾水、攤晾，待沒有水跡后進行稱量、分組、制備。將稱量好的嫩葉、老葉和嫩莖段分別按照表1處理方式進行試驗，并將干燥處理后的樣品密封包裝，置于干燥器中保存用于總黃酮含量測定。

1.3.3 總黃酮含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，加適量70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度。將蘆丁配成200.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10% AlCl3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加4% NaOH溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min，于500 nm處測定吸光度[11-12]。所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理得到蘆丁濃度與吸光度間的線性關(guān)系：y=0.005 7x-0.033 6，R2=0.9973，y為蘆丁濃度，x為樣品吸光度。

三葉青茶總黃酮含量測定：將不同組別樣品碾碎，分別放入研缽中研磨呈粉末，粉碎過100目篩，可得到三葉青茶粉，準(zhǔn)確稱取各組三葉青茶粉0.1 g，按1 g∶25 mL料液比加入70%乙醇溶液，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，取上清液測定總黃酮含量。取0.1 mL樣品溶液，根據(jù)本文標(biāo)準(zhǔn)溶液測定方法測定其在500 nm處的吸光度，計算黃酮得率。將各組數(shù)據(jù)輸入SPSS 18.0軟件進行方差分析。

總黃酮得率計算公式：100CV1V2÷m÷V3。

式中：C表示測定液的總黃酮質(zhì)量體積分數(shù)(mg·mL-1)；V1表示測定液的定容體積(mL)；V2表示提取液的定容體積(mL)；m表示樣品質(zhì)量(g)；V3表示測定時量取的體積(mL)[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果

通過L9(34)正交試驗設(shè)計，比較了不同加工處理對不同部位三葉青茶樣品總黃酮含量的影響，結(jié)果如表1所示。以幼嫩莖段為材料，采用鍋炒的殺青方式，烘干的干燥方法獲得總黃酮含量最高，為7.81%。通過正交試驗主體間效應(yīng)檢驗分析可知，不同制茶工藝條件下，材料部位和干燥方式對總黃酮含量有顯著差異(分別為P=0和P=0.004)，而殺青方式對總黃酮含量無顯著性影響(P=0.061)，根據(jù)F值大小判斷影響總黃酮含量的因素順序為材料部位(4 263.255)>干燥方式(231.618)>殺青方式(15.369)。

表1 三葉青不同制茶工藝處理組合的總黃酮含量

2.2 不同殺青方式對三葉青茶總黃酮含量的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果，將不同殺青方式下三葉青茶總黃酮含量進行統(tǒng)計分析可知，鍋炒、微波和蒸汽殺青方式下總黃酮含量分別為5.81%、5.86%和5.69%。采用LSD多重比較分析得出，鍋炒的殺青方式與微波和蒸汽殺青方式之間沒有顯著差異(P>0.05)，而微波殺青和蒸汽殺青方式之間存在顯著差異。

2.3 不同干燥方式對三葉青茶總黃酮含量的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果，將不同干燥方式下三葉青茶總黃酮含量統(tǒng)計分析可知，炒干、凍干和烘干3種干燥方式下總黃酮含量分別為5.77%、5.38%和6.11%。采用LSD多重比較分析得出，3種干燥方式之間三葉青茶總黃酮含量均存在顯著差異。

2.4 不同材料部位對三葉青茶總黃酮含量的影響

根據(jù)正交試驗結(jié)果，將不同材料部位的三葉青茶總黃酮含量統(tǒng)計分析可知，嫩葉、老葉和嫩莖段的總黃酮含量分別為5.30%、4.46%和7.51%。LSD多重比較分析表明，3種材料部位的三葉青茶總黃酮含量均存在顯著差異。

3 小結(jié)

三葉青作為新入選的“浙八味”[13]，藥用價值不可小覷，具有“天然抗生素”的美譽，而其入藥部位主要是塊根[1,3-4,6-8]，對莖葉的研究利用相對較少。本研究通過對三葉青莖葉制茶工藝條件的探索，提高了三葉青莖葉的利用率，也增加了三葉青全株入藥的科學(xué)依據(jù)。三葉青莖葉制茶時，采用幼嫩莖段作為制茶部位，獲得的三葉青茶總黃酮含量較高，這與前人研究結(jié)果一致[14]。用蒸汽法殺青方式所測得的各組總黃酮含量均較低，可能是由于蒸汽殺青高溫高濕，迅速破壞了三葉青莖葉中的總黃酮，導(dǎo)致有效成分降低，因而不宜采用蒸汽法殺青。根據(jù)總黃酮得率越大越好，且考慮成本等因素，篩選的三葉青制茶的加工處理工藝為選擇嫩莖段，鍋炒殺青，烘干。