Shh蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義

劉海英 張秋實(shí) 蘇旭明 張學(xué)新

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院神經(jīng)外科 河北石家莊 050012

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有高增殖性、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，臨床治療效果較差[1]。惡性程度最高的膠質(zhì)瘤病人的中位生存期只有14.6 個(gè)月，5年生存率僅為9.8%。究其原因可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的多形性、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的無(wú)限增殖以及多信號(hào)通路的共同激活有關(guān)[2]。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，探究腫瘤相關(guān)分子機(jī)制是治療膠質(zhì)瘤的一項(xiàng)重要手段。研究顯示SHH（Sonic Hedgehog）信號(hào)通路在胚胎發(fā)育尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到重要作用。不僅如此近年來(lái)研究也證明，SHH 信號(hào)通路在多種腫瘤如髓母細(xì)胞瘤、胃癌、肝癌、基底細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-6]。

Shh 蛋白是SHH 信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，是一種由上皮細(xì)胞分泌的，具有高度保守性的分泌型糖蛋白[7]。以往的研究中顯示，其表達(dá)程度可直接反應(yīng)Shh 信號(hào)通路的激活狀況[6,9]。而在膠質(zhì)瘤中SHH 信號(hào)通路及Shh 蛋白的表達(dá)情況目前尚顯有報(bào)道。因此本研究旨在利用免疫組化技術(shù)，探究人腦膠質(zhì)瘤中SHH 信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子Shh 蛋白的表達(dá)情況，探尋膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，為臨床實(shí)踐提供一定的幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集我院神經(jīng)外科自2014年5月至2018年5月資料完整的行開顱手術(shù)患者腫瘤標(biāo)本，經(jīng)病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤標(biāo)本75 例。其中男性39 例，女性36 例。年齡17-72 歲，中位年齡49.2 歲；病理學(xué)分級(jí)依據(jù)2016年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，分為四組：Ⅰ級(jí)13 例，Ⅱ級(jí)16 例，Ⅲ級(jí)21 例，Ⅳ級(jí)25 例。選取同期因腦外傷手術(shù)患者非腫瘤腦組織10 例作為對(duì)照組。

1.2 試劑

兔抗人Shh 單克隆抗體（Abcam 公司）、SP9001 免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膠質(zhì)瘤及正常腦組織中Shh 的表達(dá)

將取得的膠質(zhì)瘤標(biāo)本、非腫瘤腦組織經(jīng)甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片，梯度復(fù)水后3%過(guò)氧化氫(H2O2)室溫避光孵育30min，PBS 沖洗2 次，EDTA 熱修復(fù)后PBS 沖洗2 次，血清封閉液37℃溫箱封閉1h，吸取多余血清后滴加一抗(shh 1:100)，4℃孵育過(guò)夜。次日PBS 沖洗2 次，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃溫箱孵育30min，PBS 沖洗2 次，加鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內(nèi)孵育30min，PBS 沖洗2 次，DAB 顯色，復(fù)染。光鏡下觀察結(jié)果并拍照。

Shh 免疫組化表達(dá)均主要為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中。采用Friedrich 等 的 免 疫 反 應(yīng) 評(píng) 分（immunoreactivity score，IRS），采用半定量標(biāo)準(zhǔn)：高倍視野下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為0 分；＞10%-50%為1 分；＞50%-75%為2 分；＞75%為3 分。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。總體評(píng)價(jià)：以上述2 項(xiàng)得分相乘：0 分判為“-”，1 分～4 分判為“+”，5 分～7 分判為“++”，≥8 分判為“+++”。以“++”和“+++”定義為陽(yáng)性，“－”和“+”定義為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

Shh 蛋白表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)中。Shh 蛋白的表達(dá)在Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中為23.07%(3/13)，Ⅱ級(jí)37.50%(6/16)，Ⅲ級(jí)61.90%(13/21)，Ⅳ級(jí)76.00%(19/25)，正常腦組織中為10%（1/10），各膠質(zhì)瘤組與對(duì)照組比較具有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 Shh 蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Shh 蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的年齡、腫瘤大小、術(shù)前KPS 評(píng)分及是否為復(fù)發(fā)性腫瘤無(wú)關(guān)（P＞0.05）。Shh 蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO 分級(jí)明顯相關(guān)，膠質(zhì)瘤各組間比較，隨腫瘤病理級(jí)別的增高，Shh 蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.054，P＜0.05）（表1）。

表1：膠質(zhì)瘤Shh 蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

SHH 信號(hào)通路在普遍存在于正常的人體組織中，對(duì)于胚胎發(fā)育、細(xì)胞成熟、細(xì)胞分化、內(nèi)分泌激素的產(chǎn)生有著不可替代的重要作用。作為SHH 信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，當(dāng)shh 蛋白與Ptch 蛋白結(jié)合后，Smo 蛋白的抑制作用被解除，Gli 蛋白的水解作用被抑制，從而使Gli 蛋白以全長(zhǎng)的形式進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其核轉(zhuǎn)錄因子的作用，促使靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8-10]。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，學(xué)者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SHH 信號(hào)通路在腫瘤組織中也有明顯的異常激活現(xiàn)象。

研究發(fā)現(xiàn)Shh 在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌中普遍存在，尤其與肺鱗癌的病理分化程度密切相關(guān)。而在小細(xì)胞肺癌中，Shh 和Gli-1的表達(dá)量明顯降低[11-13]。阿布拉等[14]等在胰腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)SHH 信號(hào)通路中Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1 在胰腺癌組織中表達(dá)量顯著高于胰腺癌旁組織及正常胰腺組織，證實(shí)SHH 信號(hào)通路在胰腺癌組織中存在異?；罨F(xiàn)象；還有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠活體中應(yīng)用Smo 抑制劑環(huán)靶明能夠誘導(dǎo)胰腺腫瘤細(xì)胞凋亡和減少腫瘤組織的形成，改善胰腺癌的預(yù)后[15]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，SHH 信號(hào)通路研究相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，在部分髓母細(xì)胞瘤組織中存在SHH 信號(hào)通路的異?；罨F(xiàn)象。其中Ptch-1 的突變與人髓母細(xì)胞瘤的關(guān)系被廣泛證實(shí)[16]。何青蘭等[17]用RT-PCR 檢測(cè)體外培養(yǎng)的U251 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及人腦膠質(zhì)瘤組織中SHH 信號(hào)通路因子mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示在U251 細(xì)胞和膠質(zhì)瘤組織中的Shh mRNA 的表達(dá)分別高于其在瘤周組織的表達(dá)，提示Shh 的信號(hào)通路異常參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Wang[18]等研究發(fā)現(xiàn)阻斷SHH 信號(hào)通路可限制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。Shahi 等[19]研究發(fā)現(xiàn)Gli-1、Gli-3 mRNA 在大部分星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤組織中呈明顯的高表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以SHH 信號(hào)通路中重要的啟動(dòng)因子Shh 作為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)10 例正常腦組織中Shh 不表達(dá)或僅有弱表達(dá)，而在75 例膠質(zhì)瘤組織中41 例檢測(cè)到Shh 陽(yáng)性表達(dá)，余下34 例Shh 陰性表達(dá)，與對(duì)照組比較明顯增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異，說(shuō)明Shh 在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)。在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤間比較，Shh 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中陽(yáng)性率明顯高于低級(jí)別組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明：與正常腦組織對(duì)比，在各級(jí)膠質(zhì)瘤組織中Shh 在蛋白水平均上調(diào)，提示Shh 信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是普遍激活的，隨腫瘤病理級(jí)別的增高，Shh 表達(dá)逐漸增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Shh 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的年齡、腫瘤大小、術(shù)前KPS 評(píng)分及是否為復(fù)發(fā)性腫瘤無(wú)關(guān)。因此從另一個(gè)層面來(lái)說(shuō)適時(shí)適當(dāng)干預(yù)Shh 的表達(dá)，調(diào)節(jié)Shh 信號(hào)通路的激活/失活狀態(tài)，將有可能作為治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)重要手段。

目前有關(guān)SHH 信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤方面的研究尚少，積極探究膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍然有鎖欠缺，本研究樣本量較少，機(jī)制研究深入程度仍需完善，但也為臨床治療膠質(zhì)瘤提供了一定指導(dǎo)意義，為后續(xù)研究打下部分基礎(chǔ)。