四川泡菜產(chǎn)生物胺細菌的篩選及產(chǎn)胺能力驗證

唐垚，唐小曼，明建英，汪冬冬，張其圣,3*

(1.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620000；2.四川理工學院，四川 自貢 643000；3.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，成都 611130)

四川泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表，因清香、嫩脆而深受人們喜愛，常作為烹飪食材和佐餐菜品[1]。四川泡菜按照加工方式可分為工業(yè)化和家庭式兩類，其都依靠蔬菜表面附帶的微生物自然發(fā)酵而成，在貯藏階段可能積累生物胺。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗樣品

四川工業(yè)泡菜：取自四川省眉山市某知名泡菜企業(yè)，共兩份；四川家庭泡菜：取自四川省眉山市不同家庭，共兩份。

1.1.2 實驗試劑

組胺、腐胺、酪胺、尸胺等生物胺標準品：購于美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇等色譜純?nèi)軇嘿徲谔旖蚴兄逻h化學試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒：購于成都福際生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Master Mix及相關引物：購于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 產(chǎn)生物胺細菌篩選培養(yǎng)基(BAF)的配制

胰蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，吐溫80 0.5 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO30.1 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04 g，溴甲酚紫0.06 g，組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸各1 g，蒸餾水1000 mL，混勻后調(diào)節(jié)pH至 5.2，配制固體培養(yǎng)基再添加20 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.4 儀器與設備

MJ-54A立式高壓滅菌鍋 上海施都凱儀器設備有限公司；L6S紫外可見分光光度計、PHS-3C 酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；LC-2030高效液相色譜儀 日本島津公司；T960 PCR儀 杭州晶格科學儀器有限公司；JY04S-3E凝膠成像分析系統(tǒng) 北京君意電泳設備有限公司。

1.2 理化及微生物指標測定方法

1.2.1 pH的測定

參考GB 10648—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》。

1.2.2 總酸的測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用電位法測定。

1.2.3 鹽度的測定

參考GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》。

1.2.4 菌落總數(shù)的測定

參考GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.2.5 乳酸菌的測定

參考GB/T 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》。

1.2.6 酵母的測定

參考GB/T 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》。

1.3 生物胺含量檢測

根據(jù)Frias等研究報道的方法測定樣品常見的8種生物胺[7]。

1.4 生物胺形成菌的篩選及鑒定

將20 g樣品加到180 mL無菌生理鹽水中，勻漿后進行梯度稀釋，取適當稀釋度的菌懸液涂布于BAF固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑選BAF培養(yǎng)基上有明顯紫圈的菌落，劃線法分離純化各菌株。細菌DNA的提取參照試劑盒說明書方法進行，PCR擴增體系及程序參照Haruta等的方法進行[8]，擴增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序，利用Blast軟件將菌株16S rDNA序列與RDP數(shù)據(jù)庫中核酸數(shù)據(jù)進行比對，用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法進行1000次步長計算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 氨基酸脫羧酶基因測定

組氨酸脫羧酶hdc基因的引物及擴增程序參考孟甜等的方法進行[9]，酪氨酸脫羧酶tdca基因的引物及擴增程序參考Fernández等的方法進行[10]，鳥氨酸脫羧酶odc基因的引物及擴增程序參考Coton等的方法進行[11]，賴氨酸脫羧酶cacd基因的引物及擴增程序參考De Filippis等[12]的方法進行。

1.6 篩選菌產(chǎn)胺能力的驗證

參考馬秀玲等[13]的方法構(gòu)建OD值對應菌落數(shù)的標準曲線。將篩選菌保持整個體系105CFU/mL的量接種于BAF液體培養(yǎng)基中，每個篩選菌3個平行，以不接菌的BAF液體培養(yǎng)基作為空白，37 ℃培養(yǎng)48 h，測其生物胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化及微生物指標測定結(jié)果

對四川泡菜的理化及微生物指標進行測定，結(jié)果見表1。

表1 四川泡菜的理化及微生物指標測定結(jié)果Table 1 Physicochemical and microbial indicators of Sichuan pickles

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差。

由表1可知，四川工業(yè)泡菜的鹽度較高，菌落總數(shù)及乳酸菌總數(shù)較低，而家庭泡菜的pH較低，酸度較高，這可能是由于家庭泡菜鹽度低，乳酸菌生長不受抑制，大量產(chǎn)酸并不斷積累導致。

2.2 生物胺含量測定結(jié)果

四川泡菜常見8種生物胺的測定結(jié)果見圖1。

圖1 四川泡菜常見8種生物胺的測定結(jié)果Fig.1 Determination results of 8 kinds of biogenic amines in Sichuan pickles

由圖1可知，四川泡菜生物胺總含量約為697.29～1164.48 mg/kg，其中腐胺、尸胺、組胺、酪胺含量均超過100 mg/kg，為四川泡菜的主要生物胺。在四川工業(yè)泡菜中，尸胺含量最高，為(349.43±13.23) mg/kg，其次為酪胺，含量為(244.29±41.03) mg/kg。在家庭泡菜中，腐胺含量最高，為(338.2±53.07) mg/kg，其次為酪胺和組胺。本次實驗選取的四川泡菜樣品，組胺和酪胺的含量均已超過歐洲食品安全局對食品中生物胺含量建議的100 mg/kg。研究報道，酪胺和尸胺攝入量過高，會抑制人體腸道中組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶以及胺氧化酶的活性，導致組胺對機體產(chǎn)生毒害作用，且酪胺和尸胺能與亞硝酸鹽形成具有致癌性的亞硝胺[14]。Sandler等研究指出攝入3 mg的苯乙胺就能造成偏頭痛[15]，當生物胺攝入量達到1000 mg/kg時會對人體造成嚴重危害。因此，四川泡菜的生物胺含量可能存在一定安全隱患。

2.3 產(chǎn)生物胺細菌的篩選及鑒定

四川泡菜中的生物胺除原料本身含有外，主要依靠微生物利用氨基酸脫羧形成。本研究在基礎培養(yǎng)基中添加主要生物胺的前體氨基酸，添加溴甲酚紫作為指示劑，當微生物將氨基酸脫羧形成顯堿性的生物胺時，菌落會在培養(yǎng)基上顯示紫色。依據(jù)該顯色原理，篩選產(chǎn)生物胺的細菌，分子鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 生物胺形成菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of biogenic amino-producing bacteria

從四川泡菜中分離純化共得到11株產(chǎn)生物胺的細菌，其中工業(yè)泡菜樣本中共篩選出8株，家庭泡菜中共篩選出3株。對篩選菌的16S rDNA序列進行測定，獲得的序列在RDP數(shù)據(jù)庫中比對，11株產(chǎn)生物胺細菌分別為解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。Cosansu等研究了發(fā)酵食品中與生物胺形成相關的微生物包括芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬等[16]。Hsien等研究了臺灣市售泡菜中與組胺形成相關的微生物包括頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、褶皺假絲酵母(Candidarugosa)等[17]。

2.4 生物胺形成菌脫羧酶基因的確定

尸胺、腐胺、酪胺、組胺的形成分別與微生物中的賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶有關。以篩選菌的DNA為模板，采用PCR擴增氨基酸脫羧酶的相關基因，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測該微生物中是否含有脫羧酶基因，凝膠電泳結(jié)果見圖3。

賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶的目標基因條帶大小分別為220，830，700，497 bp。由圖3可知，泳道編號1，5，6有賴氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶的目標基因，對應菌株分別為1BAF1、1BAF5、1BAF6，都為R.ornithinolytica，說明其具有形成尸胺和組胺的能力。篩選菌中未檢測到鳥氨酸脫羧酶odc基因和酪氨酸脫羧酶tdca基因，四川泡菜中腐胺和酪胺含量較高，可能由發(fā)酵前、中期的微生物脫羧形成，并不斷積累導致。

圖3 賴氨酸脫羧酶(A)、鳥氨酸脫羧酶(B)、酪氨酸脫羧酶(C)、組氨酸脫羧酶(D)的凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Gel electrophoresis results of lysine decarboxylase(A),ornithine decarboxylase(B), tyrosine decarboxylase (C) and histidine decarboxylase (D)

2.5 篩選菌生物胺形成能力的驗證

將11株篩選菌定量回接至BAF液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測定生物胺的含量，結(jié)果見圖4。

圖4 篩選菌生物胺形成能力測定結(jié)果Fig.4 Determination results of biogenic amine formation ability of screening bacteria

由圖4可知，菌株1BAF1、1BAF5、1BAF6形成了大量的尸胺和組胺，這3株菌都為R.ornithinolytica，結(jié)果與2.4一致。其中，菌株1BAF1和1BAF5形成尸胺的能力較強，在BAF液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，分別形成(766.67±2.17) mg/L和(754.90±29.07) mg/L的尸胺，四川工業(yè)泡菜中尸胺含量較高可能與R.ornithinolytica有關，而菌株1BAF5形成尸胺能力較弱，培養(yǎng)結(jié)束后測定尸胺含量為(141.22±52.79) mg/L，說明不同菌株的尸胺形成能力強弱存在差異。菌株1BAF1、1BAF5、1BAF6在BAF液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，含量在308.98～378.89 mg/L之間，說明其產(chǎn)組胺能力差別不大。

3 結(jié)論

四川工業(yè)泡菜和家庭泡菜的理化特征和微生物數(shù)量存在差異，腐胺、尸胺、組胺、酪胺為主要的生物胺，且在四川工業(yè)泡菜中，尸胺含量最高。從四川泡菜中篩選出11株產(chǎn)生物胺的細菌，通過檢測氨基酸脫羧酶基因及回接產(chǎn)胺實驗，驗證了R.ornithinolytica具有形成尸胺和組胺的能力，且四川工業(yè)泡菜中尸胺含量較高可能與R.ornithinolytica有關。本研究可為四川泡菜生物胺含量的調(diào)控提供參考。